Name: improved in-gel reductive &#946;-elimination for comprehensive o-linked and sulfo-glycomics by mass spectrometry
Uploaded: 2014-11-20T13:00:00
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This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.

नोट: लैब सुरक्षा चिंताएं मानक प्रयोगशाला सर्वोत्तम प्रथाओं के साथ रखने में, निम्न पाते. उपयुक्त स्थानों में सभी कार्बनिक सॉल्वैंट्स स्टोर. रासायनिक रचनाओं का स्पष्ट लेबलिंग के साथ र...

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	<li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+roles+of+oligosaccharides:+all+of+the+theories+are+correct.">Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct.</a> Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).</li><li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+in+cellular+mechanisms+of+health+and+disease.">Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease.</a> Cell. 126 (5), 855-867 (2006).</li><li>Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+protein+glycosylation:+diversity,+synthesis+and+function.">Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).</li><li>Lowe, J. B., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+approach+to+Mammalian+glycan+function.">A genetic approach to Mammalian glycan function.</a> Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).</li><li>Yan, A., Lennarz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+mechanism+of+protein+N-glycosylation.">Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).</li><li>Washburn, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilisation+of+proteomics+datasets+generated+via+multidimensional+protein+identification+technology+(MudPIT).">Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT).</a> Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).</li><li>Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+of+proteins+for+internal+sequence+analysis+after+one-+or+two-dimensional+gel+electrophoresis.">In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).</li><li>Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+an+'In-Gel'+digestion+procedure+for+the+micropreparation+of+internal+protein+fragments+for+amino+acid+sequencing.">Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing.</a> Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).</li><li>Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+mass+spectrometry+for+the+proteomic+analysis+of+glycosylation.">The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation.</a> Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).</li><li>Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+of+glycosylated+interferon-gamma+variants+separated+by+gel+electrophoresis.">Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).</li><li>Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+of+N-linked+oligosaccharides+directly+from+protein+gels:+in-gel+deglycosylation+followed+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+and+normal-phase+high-performance+liquid+chromatography.">Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography.</a> Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).</li><li>Kuster, B., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18O-labeling+of+N-glycosylation+sites+to+improve+the+identification+of+gel-separated+glycoproteins+using+peptide+mass+mapping+and+database+searching.">18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching.</a> Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).</li><li>Aoki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+O-linked+glycans+expressed+during+Drosophila+melanogaster+development+reflects+stage-+and+tissue-specific+requirements+for+cell+signaling.">The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).</li><li>Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+peeling+during+the+release+of+O-glycans+by+hydrazinolysis.">Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis.</a> Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).</li><li>Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+analysis+of+O-linked+oligosaccharides+from+glycoproteins+and+mucins+separated+by+gel+electrophoresis.">Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis.</a> Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).</li><li>Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC5B+glycosylation+in+human+saliva+reflects+blood+group+and+secretor+status.">MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status.</a> Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).</li><li>Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+profiling+of+O-linked+glycans+released+directly+from+glycoproteins+in+gels+using+in-gel+reductive+&#946;-elimination.">Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive &#946;-elimination.</a> Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).</li><li>Anumula, K. R., Taylor, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+procedure+for+preparation+of+partially+methylated+alditol+acetates+from+glycoprotein+carbohydrates.">A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates.</a> Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).</li><li>Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+developmental+elaboration+of+N-linked+glycan+complexity+in+the+Drosophila+melanogaster+embryo.">Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo.</a> J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).</li><li>Domon, B., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systematic+Nomenclature+for+Carbohydrate+Fragmentations+in+Fab-Ms+Ms+Spectra+of+Glycoconjugates.">A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates.</a> Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Lapadula, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+3.+OSCAR:+an+algorithm+for+assigning+oligosaccharide+topology+from+MSn+data.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).</li><li>Ashline, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+structural+isomers+analyzed+by+sequential+mass+spectrometry.">Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).</li><li>Thomsson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+mucin+MG1+(MUC5B)+carries+a+repertoire+of+unique+oligosaccharides+that+is+large+and+diverse.">The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse.</a> Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).</li><li>Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+techniques+and+strategic+workflow+for+sulfoglycomics+based+on+mass+spectrometry+mapping+and+sequencing+of+permethylated+sulfated+glycans.">Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans.</a> Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+mass+spectrometry-based+sulfoglycomic+mapping+for+identification+of+terminal+sulfated+lacdiNAc+glycotope.">Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope.</a> Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).</li><li>Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+&#946;-elimination+and+aqueous-organic+partition+for+improved+O-+and+sulfoglycomics.">In-gel &#946;-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).</li></ol>

Combining in-gel reductive &#946;-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t...

ग्लाइकोसिलेशन जीवधारी शरीर क्रिया विज्ञान, ऊतक विकृति, और सेलुलर मान्यता 1-3 के लिए योगदान, एक आवश्यक प्रोटीन बाद translational संशोधन है. विश्लेषणात्मक glycoscience में प्रमुख प्रगति के बावजूद, एक विशिष्ट प्रोटीन पर glycans की पूरी विविधता निस्र्पक विशेष रूप से प्राथमिक जैविक स्रोतों से अलग प्रोटीन पर, एक बेहद चुनौती भरा काम रहता है. बहरहाल, ग्लाइकोप्रोटीन glycans की microheterogeneity अक्सर अन्य प्रोटीन के साथ कार्यात्मक बातचीत को प्रभावित करता है. इसलिए, glycan विविधता के लक्षण वर्णन सेलुलर और ऊतक ग्लाइकोसिलेशन 4,5 के शारीरिक महत्व को समझने के लिए आवश्यक है. ऊतक शरीर विज्ञान और pathophysiology, मजबूत, संवेदनशील, और व्यापक glycomic विश्लेषणात्मक तकनीकों को ग्लाइकोप्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन के योगदान को समझने के लिए तेजी से महत्वपूर्ण बन गए हैं. प्रोटिओमिक विश्लेषण में, प्रोटीन पहचान आम तौर पर नियंत्रण रेखा एमएस द्वारा प्राप्त कर रहे हैं/ Tryptic पेप्टाइड्स 6 के एमएस विश्लेषण. प्रोटीन पाचन ऐसे 7-9 trypsin रूप प्रोटिएजों साथ में जेल पाचन निम्नलिखित एसडीएस पृष्ठ द्वारा हल एक शुद्ध प्रोटीन या प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है. एसडीएस पृष्ठ से प्रोटीन मिश्रण की प्री-संवर्धन प्रोटीन आईडी की गहराई और सटीकता को बढ़ाता है. ग्लाइकोप्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन की glycomic विश्लेषण के लिए अनुरूप रणनीति के विकास glycoscience के मामले में सबसे आगे है. glycans के दो प्रमुख वर्गों एन उठाना या ओ-लिंकेज या तो के माध्यम से प्रोटीन अनिवार्य जरूरतों से जुड़े होते हैं. एन से जुड़े glycans asparagine से जुड़े होते हैं (ASN) Asn-एक्स सर्विसेज / Thr / Cys के रूप में परिभाषित एक sequon के हिस्से के रूप में पाया अवशेष (एक्स प्रोलाइन को छोड़कर किसी भी अमीनो एसिड होता है), और peptide- एन के साथ enzymatic पाचन द्वारा जारी किया जा सकता है -glycanase (PNGaseF या ए), या तो समाधान में, में जेल, या पर-धब्बा 10-12. हे से जुड़े glycans मुख्य रूप से सेरीन (SER) या threonine (THR) अवशेषों से जुड़े होते हैं. हालांकि, केवल एक एंजाइम पहचान की गई हैग्लाइकोप्रोटीन से ओ से जुड़े glycans को रिहा करने में सक्षम है और यह केवल सरल ओ-लिंक्ड glycans रिहा, एक अत्यंत सीमित glycan विशिष्टता है कि tified. केमिकल रिलीज रणनीतियों ग्लाइकोप्रोटीन से ओ से जुड़े glycans की व्यापक रिहाई के लिए पसंद की विधि रहते हैं. Reductive या गैर reductive β-उन्मूलन, या hydrazinolysis अच्छी तरह से विशेषता रासायनिक रिहाई तकनीकों हैं और ग्लाइकोप्रोटीन 13,14 से ओ से जुड़े glycans रिहा करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया दृष्टिकोण वर्तमान में कर रहे हैं. Reductive β-उन्मूलन एसडीएस पृष्ठ द्वारा अलग ग्लाइकोप्रोटीन से ओ से जुड़े glycans जारी करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जो पिछले दृष्टिकोण बाद के विश्लेषण के 15-17 के लिए एचपीएलसी जुदाई की आवश्यकता है. बहुआयामी एमएस (एमएस एन) विश्लेषण वर्तमान में सबसे जैविक स्रोतों से उम्मीद की मात्रा में पृथक ग्लाइकोप्रोटीन से रिहा glycans निस्र्पक के लिए संरचनात्मक डेटा के सबसे अमीर स्रोत प्रदान करता है. एमएस की गहराईआधारित संरचनात्मक लक्षण वर्णन बहुत पहले उनके विश्लेषण के लिए जारी किया glycans permethylating से मदद की है. Permethylation आयनीकरण को बढ़ाता है और glycan संरचनाओं 18,19 के एक विस्तृत रेंज में दाढ़ संकेत प्रतिक्रियाओं बराबर हो जाता है. इसके अलावा, permethylation असंदिग्ध जिससे संरचनात्मक व्याख्या 20-23 बढ़ाने विशिष्ट जनता के साथ टर्मिनल और एवजी मोनोसैकराइड moieties, टैग. उदाहरण के लिए, अम्लीय glycans एमएस द्वारा गैर permethylated प्रजाति के रूप में पता लगाने के लिए आम तौर पर मुश्किल हो जाता है. अम्लीय glycans एमएस द्वारा नकारात्मक आयन मोड में पता लगाया जा सकता है, यह एक ही आयन मोड में दोनों अम्लीय और तटस्थ glycans पता लगाने के लिए असंभव है. Glycan permethylation का एक प्रमुख लाभ permethylated के रूप में एक glycan के मोनोसैकराइड substituents पर मुक्त हाइड्रॉक्सिल समूह (ओएच) की उन सभी के रूप में पहचाने बनाने, एक मिथाइल समूह (OCH 3 या OME), इस प्रकार एक sialylated glycan के आरोपों निष्प्रभावी कर रहे हैं के साथ छाया हुआ होगा कि है तटस्थ (एशियालो) glycans. हालांकि, sulfoglycans पर सल्फेट moieties की hydroxyls के आयनीकरण दबा और संवेदनशीलता कम हो जाती है जो ऋणात्मक प्रभारी, की अवधारण, जिसके परिणामस्वरूप permethylation लिए प्रतिरोधी रहे हैं. इस दमन वर्तमान सल्फेटकृत glycans 24-26 के एक उच्च बहुतायत ले जो ऐसे mucins के रूप में बहुत जटिल ग्लाइकोप्रोटीन, की व्यापक glycomic विश्लेषण से बचाता है. सफ़ाई सल्फेटकृत glycans पर हाल की रिपोर्टों से रिवर्स चरण शुद्ध करने के लिए क्रोमैटोग्राफी और MALDI विश्लेषण करने से पहले अलग permethylated glycans, आरोप लगाया करते थे. इस विधि हम जैविक चरण विभाजन से कम कठोर हो पाया है जो क्षालन के लिए विभिन्न मोबाइल चरणों, का उपयोग सल्फेटकृत और गैर-सल्फेटकृत glycans की पूरी जुदाई पर निर्भर करता है. इसलिए, sulfoglycans का पता लगाने और संवर्धन के लिए उपयुक्त नई तकनीकों यहां प्रस्तुत कर रहे हैं. इन तकनीकों में पानी निम्नलिखित जलीय चरण में सल्फेटकृत glycans की मात्रात्मक वसूली के लिए अनुमति देते हैं: डीसीएम (dichloromethane)नियमित glycan permethylation प्रतिक्रियाओं 27 के अंत में किया जाता है जो निष्कर्षण,. भी एमएस 2 विखंडन पैटर्न को सरल बनाने, जबकि महत्वपूर्ण बात है, permethylated गैर सल्फेटकृत glycans के मिश्रण से permethylated sulfoglycans के इस मजबूत जुदाई समन्वित रूप से आरोप लगाया प्रजातियों के लिए समृद्ध करती. सुधार में जेल ओ-लिंक्ड glycan विश्लेषण के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत किया है. सुधार प्रोटोकॉल, glycan वसूली बढ़ाता एमएस के माध्यम से प्राप्य एन permethylated glycans के विश्लेषण संरचनात्मक जानकारी बढ़ जाती है, और जैविक स्रोतों से पृथक आवश्यक ग्लाइकोप्रोटीन के लिए लागू sulfoglycomic विश्लेषण की संवेदनशीलता को बेहतर बनाता है. इस प्रोटोकॉल पूरे ग्लाइकोप्रोटीन निष्कर्षों की ओ से जुड़े glycan विश्लेषण के लिए या एसडीएस पृष्ठ द्वारा हल ब्याज की एक विशिष्ट ग्लाइकोप्रोटीन का इरादा है और तीन प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं से बना है; ए) जेल सफाई, बी) में जेल reductive β-उन्मूलन, और सी) glycan permethyआबादी. लक्ष्य जैविक ब्याज (चित्रा 1) के प्राथमिक स्रोतों से काटा ग्लाइकोप्रोटीन के लिए व्यापक ओ-लिंक्ड glycomic डेटा प्राप्त करने के लिए है. एसडीएस पृष्ठ द्वारा अलग ग्लाइकोप्रोटीन धुंधला और ब्याज के बैंड excised हैं और जिसके परिणामस्वरूप जेल बैंड छोटे टुकड़ों में कटा हुआ है द्वारा दिखाए जा रहे हैं. जेल टुकड़े destained और जेल संदूषकों (2A चित्रा) को हटाने के लिए एथिल एसीटेट washes के लिए किया जाता है. Glycan रिहाई में जेल reductive β-उन्मूलन (चित्रा 2B) द्वारा हासिल की है और जारी glycans permethylated रहे हैं. जलीय जैविक निकासी निम्नलिखित permethylation मात्रात्मक दूर गैर सल्फेटकृत तटस्थ glycans (चित्रा -2) से ऋणात्मक सल्फेटकृत glycans विभाजन. इन-जेल जलीय-जैविक निकासी के लिए युग्मित reductive β-उन्मूलन एसडीएस पृष्ठ द्वारा अलग ग्लाइकोप्रोटीन की थोड़ी मात्रा से रिहा ओ-लिंक्ड glycans और sulfoglycans के लक्षण वर्णन में सक्षम बनाता है. सामरिक सिंहावलोकन summari हैचित्रा 1 और विवरण में जेड चित्रा 2 में दिखाया गया है. इसके अलावा, destained और धोया जेल टुकड़े के एक हिस्से मानक नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस प्रोटिओमिक तकनीक से प्रोटीन आईडी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:303px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:231px;">Water, deionized water</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV, for HPLC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Acetic acid, Glacial</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>A38-500</td>
			<td style="width:303px;">Certified ACS&#8805;99.7 w/w %</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Methanol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV, for HPLC, &#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td style="width:303px;">BioUltra, &#8805;99.5% (T), Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34998-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV Plus, for HPLC, &#8805;99.9%, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td>34972-1L-R</td>
			<td style="width:303px;">LC-MS CHROMASOLV, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sodium borohydride</td>
			<td style="width:155px;">Aldrich</td>
			<td>213462-25G</td>
			<td style="width:303px;">ReagentPlus, 99%, Step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Iodomethane</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>289566-100G</td>
			<td style="width:303px;">ReagentPlus, 99.5%,&#160; Step 6.&#160; Store at 4 &#176;C until use.&#160; Sit at room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Sodium hydroxide solution, 50% w/w</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>SS254-1</td>
			<td style="width:303px;">Certified, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dimethyl sulfoxide, anhydrous</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>276855-1L</td>
			<td style="width:303px;">Anhydrous, &#8805;99.9%, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Methanol, anhydrous</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>322415-100ML</td>
			<td style="width:303px;">Anhydrous, 99.8%, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34856-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOL&#174;, for HPLC, &#8805;99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:231px;">Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200&#160;mesh</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>217506-500G</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">AG 50W-X8 Resin&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td>142-1441</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:231px;">BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase</td>
			<td style="width:155px;">JT Baker</td>
			<td>JT-7020-01</td>
			<td style="width:303px;">Step 5 and 8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Bio-Safe Coomassie Stain&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td>161-0786</td>
			<td style="width:303px;">G-250, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Silver Stain Kit for Mass Spectrometry</td>
			<td style="width:155px;">Pierce</td>
			<td>24600</td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140)</td>
			<td style="width:155px;">Supelco&#160;</td>
			<td>47265</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135)</td>
			<td style="width:155px;">Supelco&#160;</td>
			<td>47265</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes</td>
			<td style="width:155px;">Corning</td>
			<td>99447-13</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes</td>
			<td style="width:155px;">Corning</td>
			<td>99447-16</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner</td>
			<td style="width:155px;">Kimble</td>
			<td>45066C-13</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner</td>
			<td style="width:155px;">Kimble</td>
			<td>45066C-15</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81265</td>
			<td style="width:303px;">volume 500&#160;&#956;L, needle size 22 ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81165</td>
			<td style="width:303px;">volume 250&#160;&#956;L, needle size 22 ga</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81065</td>
			<td style="width:303px;">volume 100&#160;&#956;L, needle size 22s ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>80965</td>
			<td style="width:303px;">volume 50&#160;&#956;L, needle size 22s ga</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton Calibrated Syringes</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>80300</td>
			<td style="width:303px;">volume 10&#160;&#956;L, needle size 26s ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">Petri Dish Glass 100mm x 15mm</td>
			<td style="width:155px;">GSC INTERNATIONAL INC</td>
			<td>1500-4</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Bard-Parker Surgical Blades</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>371310</td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Reacti-Therm Heating/Stirring Module</td>
			<td style="width:155px;">Pierce</td>
			<td>18870</td>
			<td style="width:303px;">Step 1, 4 and 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Heating Blocks</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>125D</td>
			<td style="width:303px;">Step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:155px;">Aldrich</td>
			<td>CLS3950</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fused Silica CutterTubing cutter</td>
			<td style="width:155px;">alltech</td>
			<td>3194</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Multi-tube vortexers&#160;</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>444-7063</td>
			<td style="width:303px;">Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Lyophilizer 25EL Freezemobile</td>
			<td style="width:155px;">Virtis</td>
			<td>25EL</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>Clinical 50</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">LTQ Orbitrap Discovery</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;">0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved in-gel reductive &#946;-elimination for comprehensive o-linked and sulfo-glycomics by mass spectrometry

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive &#946;-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.

इन-जेल reductive β-उन्मूलन के लिए एथिल एसीटेट उपचार के प्रभाव से पहले में जेल reductive β-उन्मूलन का उपयोग mucin गोजातीय से रिहा permethylated ओ-लिंक्ड glycan नमूने का एक प्रतिनिधि जन स्पेक्ट्रम 3 चित्र में द?...

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Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive &#946;-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.

मास स्पेक्ट्रोमेट्री में जेल सुधार reductive β-उन्मूलन व्यापक ओ से जुड़े और के लिए sulfo-Glycomics

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

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