Name: cytosolic calcium measurements in renal epithelial cells by flow cytometry
Uploaded: 2014-10-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Forskning i laboratoriene er finansiert av Fritz-Bender Foundation, München, Tyskland (til TD) og en University of Witten / Herdecke interne forskningsstipend (til W.-KL). Vi ønsker å takke Prof Dr. Dr. Frank Thévenod (Institutt for fysiologi, patofysiologi og toksikologi, University of Witten / Herdecke) for nyttige forslag.

1. Utarbeidelse av reagenser og løsninger <ol><li> Tilbered en modifisert Hanks balanserte saltløsning (HBSS) (i mM: NaCl 136,9, KCl 5,37, 0,34 Na2 HPO 4, 0,44 KH 2PO 4, 4,17 NaHCO3, pH 7,2, uten fenolrødt). Oppbevar ved 4 ° C. </li><li> Gjør 1,5 M CaCl 2 og 2 M 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) (pH 7,2) stamløsninger ved hjelp av destillert vann. </li><li> Forbered en 250 mM stamløsning av probenecid. For den frie syreformen (ofte refe...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li><li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+pumps+in+health+and+disease.">Calcium pumps in health and disease.</a> Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling.">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li><li>Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+actions+of+calcium-mobilizing+messenger,+inositol+1,4,5-trisphosphate.">Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate.</a> Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).</li><li>Putney, J. W., Ribeiro, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+between+the+plasma+membrane+and+endoplasmic+reticulum+calcium+stores.">Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).</li><li>Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM+proteins:+dynamic+calcium+signal+transducers.">STIM proteins: dynamic calcium signal transducers.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).</li><li>Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+uptake.">Mitochondrial calcium uptake.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).</li><li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium+and+cell+death:+a+deadly+triad+in+neurodegeneration.">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).</li><li>Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channels+and+pumps+in+cancer:+changes+and+consequences.">Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences.</a> J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).</li><li>Roderick, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+in+the+heart:+when+it's+good,+it's+very+very+good,+but+when+it's+bad,+it's+horrid.">Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid.</a> Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli.">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. , (2013).</li><li>Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intracellular+calcium+in+vital+cells+by+flow-cytometry.">Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry.</a> Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).</li><li>June, C. H., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+cellular+ionized+calcium+concentration.">Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration.</a> Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).</li><li>Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+intracellular+calcium+mobilization.">Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization.</a> Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).</li><li>Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+Ca2++flux+measurement+on+isolated+human+B+cells+that+uses+flow+cytometry.">A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).</li><li>Seidel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotransmitter+GABA+is+a+potent+inhibitor+of+the+stromal+cell-derived+factor-1alpha+induced+migration+of+adult+CD133++hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).</li><li>Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Th&#233;venod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK1/2-dependent+bestrophin-3+expression+prevents+ER-stress-induced+cell+death+in+renal+epithelial+cells+by+reducing+CHOP.">ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP.</a> Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).</li><li>Woost, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+characterization+of+proximal+tubule+cells+derived+from+kidneys+of+spontaneously+hypertensive+and+normotensive+rats.">Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats.</a> Kidney Int. 50, 125-134 (1996).</li><li>Beyer, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benemid,'+p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic+acid;+its+renal+affinity+and+its+elimination.">Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination.</a> Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).</li><li>Buckley, B. J., Whorton, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunicamycin+increases+intracellular+calcium+levels+in+bovine+aortic+endothelial+cells.">Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells.</a> Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).</li><li>Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SLC22+family+with+transporters+of+organic+cations,+anions+and+zwitterions.">The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions.</a> Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).</li><li>Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+ATP-binding+cassette+(ABC)+transporter+superfamily.">The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily.</a> J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).</li><li>Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+expression+of+P-glycoprotein+as+a+determinant+of+loading+with+fluorescent+calcium+probes.">Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes.</a> Cytometry. 17, 343-348 (1994).</li><li>Th&#233;venod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+multidrug+resistance+P-glycoprotein+via+nuclear+factor-kappaB+activation+protects+kidney+proximal+tubule+cells+from+cadmium-+and+reactive+oxygen+species-induced+apoptosis.">Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis.</a> J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).</li><li>Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Th&#233;venod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadmium+induces+Wnt+signaling+to+upregulate+proliferation+and+survival+genes+in+sub-confluent+kidney+proximal+tubule+cells.">Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells.</a> Mol Cancer. 9, 102 (2010).</li><li>Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+mobilization+in+human+platelets+using+indo-1+and+flow+cytometry.">Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry.</a> Blood. 74, 2674-2680 (1989).</li><li>Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cytosolic+ionized+calcium+variation+in+polymorphonuclear+leukocytes+using+flow+cytometry+and+Indo-1+AM.">Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM.</a> Cytometry. 10, 165-173 (1989).</li></ol>

Kalsium er et viktig hendelse i flere cellulære prosesser som virker som en andre budbringer signalmolekyl og også som et middel for å kommunisere mellom ER og mitokondrier. Muligheten til å måle endringer i frie cytosoliske kalsiumkonsentrasjoner er en nyttig teknikk som kan gjelde for alle områder av cellebiologi. Det finnes ulike metoder for å oppdage cytosoliske kalsium signaler. Klassisk, signaler fra en ratiometrisk kalsiumindikator, for eksempel Fura-2, blir overvåket i levende celler ved anvendelse av en...

Kalsium er et viktig second messenger ansvarlig for overføring av cellulært fysiologiske og patofysiologiske signaler 1. Cytosolisk kalsiumkonsentrasjonen holdes lavt gjennom aktiviteten av kalsium pumper og kalsiumvekslere. Det sarkoplasma / endoplasmatiske retikulum kalsium ATPase (SERCA) etterfyller det endoplasmatiske retikulum (ER) kalsium lagre som del av en &quot;pumpe lekkasje&quot; systemet, mens plasmamembranen kalsium ATPase (PMCA) ekstruderer kalsium til det ekstracellulære rommet, både i ATP-avhengige oppførsel 2. Fysiologiske budbringere, slik som hormoner eller neurotransmittere, overfører deres signaler via G protein-koblede reseptorer, aktivering av fosfolipase C, som hydrolyserer fosfatidylinositol-4,5-bifosfat (PIP2) i plasmamembranen til å generere diacylglycerol og inositol-trifosfat (IP3) 3. Mens diacylglycerol forblir i plasmamembranen, IP3 diffunderer inn i cytosol og binder seg til reseptoren IP3s (IP3Rs), som er ligand aktivert kalsiumkanaler, som finnes i ER membranen og kalsium frigjøres fra ER luminal butikken kulminerte i en økning i cytosoliske kalsiumkonsentrasjoner 4. En alternativ rute for kalsium for å nå cytosol er gjennom kalsiumkanaler og vekslere som er tilstede i plasmamembranen. Crosstalk mellom disse to delene er beskrevet: kalsium indusert kalsium utgivelse (CICR) hvor ekstracellulære kalsium induserer kalsium utgivelse fra ER butikker 5, og butikken drives kalsium oppføring (SOCE) der tømming av ER butikker registreres av STIM og forårsaker åpning av Orai kalsiumkanaler i plasmamembranen å fremme påfylling av ER butikker seks. Under patofysiologiske betingelser, er den cellulære kalsiumrespons deregulerte og cytosoliske kalsium økninger i fravær av fysiologiske stimulatorer 1. Den kalsium-respons kan bli påvirket på en rekke måter: langvarig kalsiumsignal, forsinket kalsium fjerning fra cytosol, uttømming av kalsium butikker eller lokaliserte forandringer i kalsium. Videre mitokondriene ta på seg en sentral rolle i bufring og slippe kalsium 7. Langvarig og / eller supramaksimalt cytosolisk kalsium økning fører til celledød. Faktisk er kalsium oftere enn ikke involvert i den cellulære patofysiologisk respons og er en viktig hendelse i et bredt spekter av sykdommer, for eksempel neurodegenerative sykdommer, hjertesykdommer, kreft, skjelettsykdommer og nyresykdommer, som i hovedsak er assosiert med celledød og tap eller endring av organ eller vev funksjon 8-10. Videre har perturbasjon av kalsiumsignaler vært knyttet til cellulær tilpasning og forandringer i cellulære funksjoner og responser. Tradisjonelt er kalsium signaler målt med et negativt ladet fluorescerende kalsiumindikator som er lastet inn i celler i en cellepermeabel acetoksymetyl (AM) esterform. Når spaltes av cellulære Esterases, de fluorescerende indikatorer forblir innenfor det intracellulære rommet, og økning i fluorescensintensitet når kalsium er bundet. Den mest kjente og brukte kalsium indikator er proporsjonal Fura-2 er utviklet av Roger Tsien og kolleger 11. Kalsium indikatorer med ulik affinitet for kalsium tillate ulike kalsium bassenger som skal overvåkes. Deteksjonsmetoder inkluderer levende celle bildebehandling, fluorescens mikroplateleser og flowcytometri. De relativt raske kinetikk av kalsium signaler (vanligvis i løpet av få sekunder til minutter) gjør levende celle bildebehandling den beste metoden for å få mest mulig informasjon om egenskapene til kalsium signal. Bortsett fra de raske kinetikk kalsiumsignaler (innenfor millisekunder), er live cell imaging en bedre metode for å studere cellulære compartmentalization av kalsium signalering innenfor en enkelt celle 12. Absolutte kalsiumkonsentrasjoner kan beregnes ved å bestemme den minimale og maksimale fluorescens av kalsium indicator ved tilsetning av en kalsium chelator og permeabilizing cellene, henholdsvis, som beskrevet av Grynkiewicz et al., 11. Bruken av strømningscytometri for å måle kalsiumsignaler først ble utviklet i 1980-årene i immunologiske celler der mulighet til å måle flere parametere, slik som membranintegritet og separering av cellepopulasjon, og kravet av celler i suspensjon kombinert med utviklingen av enkelt bølgelengde kalsium indikatorer gjort flowcytometri en ideell og convenientdetection metode 13-15. I heftende celler, tilbyr levende celle bildebehandling mest mulig informasjon om kalsium signalering, viktigst kinetikk, men krever en komplisert oppsett bestående av en fluorescens mikroskop, en perfusjon system, vedlikehold av mobilnettet miljø, for eksempel temperatur, og spesialisert mikroskop programvare for å anskaffe og analysere data. Alternative metoder slik som en fluorescens mikroplateleser eller Pharmacological midler gjennom bruk av kalsium chelatorene er makeløs i form av tjente informasjon. Strømningscytometri blir stadig mer utbredt brukt til å overvåke cytosolisk kalsium i adherente celler selv om det i de fleste studiene, bare ende-punkt-målinger er utført. Ved hjelp av metoden opprinnelig utviklet av Gergely et al. I immunologiske B-celler 16 har endringer i cytosolisk fri kalsium-konsentrasjon ved flowcytometri med sanntidskinetikk og overvåking av fluorescensintensiteten i de enkelte celler fra en prøve populasjon blitt målt hos kreft epitelceller og kreft stamceller hybrider 17. Denne fremgangsmåte ble videre tilpasset for bruk i adherente epitel-celler, som er vanskelig å laste med kalsium indikatorer 18. Her, ved hjelp av en immortalisert adherent epitelisk cellelinje avledet fra S1 segment av rottenyre proksimale tubuli (WKPT-Cl.2 0293) 19 beskriver vi en optimalisert forenklet method for måling av endring i cytosolisk kalsiumkonsentrasjon ved strømningscytometri. Siden mange epitelceller besitter en rekke organiske transportører for anioniske forbindelser, kan lasting av celler med en kalsiumindikator vise seg å være en utfordring. For å hindre utstrømningen av kalsium indikatorer, probenecid, den prototypiske hemmer av organisk anion transportører og opprinnelig utviklet for å redusere renal utskillelse av penicillin 20, brukes samtidig i inkuberingsmediet. Cellene blir opprettholdt i monolag kalsiumindikator for lasting, bringes i suspension og kalsiumsignaler kan detekteres umiddelbart etter tilsetning forbindelsen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:79px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:321px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-3, AM</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">F-1241&#160;</td>
			<td>Cell permeable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Probenecid</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8761</td>
			<td>Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I9657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:79px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tunicamycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software</td>
			<td style="width:79px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)</td>
			<td style="width:79px;">Joe Trotter, The Scripps Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line</td>
			<td style="width:79px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology &#38; Biophysics, Case 
			Western Reserve University, Cleveland, OH)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytosolic calcium measurements in renal epithelial cells by flow cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

For å øke cytosolisk kalsium ble to farmakologiske forbindelser brukes til nyreproksimaltubul celler (WKPT-0293 Cl.2) lastet med celle gjennomtrengelig kalsium bindende fargestoff, Fluo-3-AM. Ubehandlede kontrollprøver ble lastet med kalsiumbindende fargestoff i nærvær av probenecid og ble blandet, men uten tilsetning av noen forbindelser. Thapsigargin (TG) er en klassisk inhibitor av SERCA pumpe som fører til lekkasje ut av ER og resulterer i økt cytosolisk kalsium. Tunicamycin (TUN) blokkerer N-glykosyleringsse...

Watch this Scientific Journal Video about Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Kalsium er involvert i en rekke fysiologiske og patofysiologiske signalveier. Levende celle bildebehandling krever spesialutstyr og kan være tidkrevende. En rask, enkel fremgangsmåte ved å bruke et strømningscytometer for å bestemme relative endringer i cytosolisk kalsium i adherente epitelceller bringes i suspensjon ble optimalisert.

Cytosolisk Kalsium Målinger i nyre Epitelceller med flowcytometri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Research

JoVE Journal

Biology

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Purification (kvitre)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimalisert flekker og spredning modellering Metoder for Celledeling Overvåking hjelp Cell Tracking Fargestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Rapid Genetic Analysis of epitelial-mesenchymale signaleringsprotokoll Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

High Efficiency Differensiering of Human Pluripotent stamceller til Cardiomyocytes og karakterisering med flowcytometri

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analyse av cellesuspensjoner Isolert fra solid vev ved Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Måle Endoreduplication av flowcytometri av isolerte Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Høy gjennomstrømming-måling av Dictyostelium discoideum Macropinocytosis av Flow cytometri

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...