Name: cytosolic calcium measurements in renal epithelial cells by flow cytometry
Uploaded: 2014-10-28T13:00:00
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Pesquisas nos laboratórios é financiado pela Fundação Fritz-Bender, Munique, Alemanha (para TD) e da Universidade de Witten / Herdecke bolsa de investigação interna (para W.-KL). Gostaríamos de agradecer a Prof Dr. Dr. Frank Thévenod (Instituto de Fisiologia, Fisiopatologia e Toxicologia da Universidade de Witten / Herdecke) para sugestões.

1. Preparação dos Reagentes e Soluções <ol><li> Prepare uma solução de Hank equilibrada modificado sal (HBSS) (em mM: 136.9 NaCl, 5.37 KCl, 0,34 de Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 NaHCO 3, pH 7,2, sem vermelho de fenol). Armazenar a 4 ° C. </li><li> Adicione 1,5 M de CaCl2 e 2 M de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) (pH 7,2) soluções de reserva, utilizando água destilada. </li><li> Prepara-se uma solução de estoque de ...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li><li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+pumps+in+health+and+disease.">Calcium pumps in health and disease.</a> Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling.">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li><li>Putney, J. 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H., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+cellular+ionized+calcium+concentration.">Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration.</a> Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).</li><li>Ransom, J. T., DiGiusto, D. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunicamycin+increases+intracellular+calcium+levels+in+bovine+aortic+endothelial+cells.">Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells.</a> Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).</li><li>Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SLC22+family+with+transporters+of+organic+cations,+anions+and+zwitterions.">The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions.</a> Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).</li><li>Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+ATP-binding+cassette+(ABC)+transporter+superfamily.">The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily.</a> J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).</li><li>Brezden, C. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+mobilization+in+human+platelets+using+indo-1+and+flow+cytometry.">Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry.</a> Blood. 74, 2674-2680 (1989).</li><li>Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cytosolic+ionized+calcium+variation+in+polymorphonuclear+leukocytes+using+flow+cytometry+and+Indo-1+AM.">Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM.</a> Cytometry. 10, 165-173 (1989).</li></ol>

O cálcio é um evento chave na múltiplos processos celulares que actuam como um segundo mensageiro molécula de sinalização e também como um meio para comunicar entre o ER e mitocôndrias. A capacidade de medir alterações nas concentrações de cálcio citosólico livre é uma técnica útil que pode ser aplicada a todas as áreas de biologia celular. Existem vários métodos para a detecção de sinais de cálcio citosólicos. Classicamente, os sinais de um indicador de cálcio raciométrica, tais como Fura-2, s...

O cálcio é um importante segundo mensageiro responsáveis ​​pela transmissão de sinais fisiológicos e patofisiológicos celular 1. Concentrações citosólicas de cálcio são mantidos baixos por meio da atividade de bombas de cálcio e trocadores de cálcio. A / ATPase de cálcio do retículo endoplasmático sarcoplasmático (SERCA) preenche o retículo endoplasmático (ER) loja de cálcio como parte de um sistema de &quot;vazamento de bomba&quot;, enquanto o cálcio ATPase da membrana plasmática (PMCA) expulsa o cálcio para o compartimento extracelular, tanto em maneiras dependentes de ATP 2. Mensageiros fisiológicas, tais como hormonas ou neurotransmissores, transmitem os seus sinais através de receptores acoplados à proteína G, a activação de fosfolipase C, que provoca a hidrólise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) na membrana de plasma para gerar diacilglicerol e trifosfato de inositol (IP3) 3. Enquanto diacilglicerol permanece na membrana plasmática, IP3 difunde-se para o citosol e liga-se ao receptor de IP3s (IP3Rs), que são activadas ligando os canais de cálcio, encontrados na membrana do RE e do cálcio é libertado a partir da loja ER luminal culminando com um aumento nas concentrações de cálcio citosólicos 4. Uma via alternativa para o cálcio para atingir o citossol é através de canais de cálcio e permutadores presentes na membrana plasmática. Crosstalk entre esses dois compartimentos foram descritos: liberação de cálcio de cálcio induzida (CICV), onde o cálcio extracelular induz liberação de cálcio das lojas ER 5 e loja operada entrada de cálcio (SOCE), onde o esvaziamento das lojas ER é detectada por STIM e provoca a abertura de Orai canais de cálcio na membrana plasmática para promover o reenchimento das lojas de 6 ER. Sob condições fisiopatológicas, a resposta celular de cálcio é desregulados e citosólicas de cálcio aumenta na ausência de estimuladores fisiológicos 1. A resposta de cálcio pode ser afectada de várias maneiras: cálcio prolongadasinal, a remoção retardada de cálcio a partir do citosol, depleção das reservas de cálcio ou mudanças localizadas em cálcio. Além disso, as mitocôndrias assumir um papel central na memória intermédia de libertação de cálcio e 7. Prolongado e / ou aumento de cálcio citosólico supramáxima leva à morte celular. Na verdade, o cálcio é mais frequentemente do que não envolvido na resposta fisiopatológica celular e é um evento chave em uma ampla gama de doenças, tais como doenças neurodegenerativas, doenças cardíacas, câncer, doenças ósseas e doenças renais, que estão principalmente associados com a morte celular e perda ou alteração de órgão ou tecido função 8-10. Além disso, a perturbação de sinais de cálcio tem sido associada a adaptação celular e alterações em funções celulares e as respostas. Tradicionalmente, os sinais de cálcio são medidos com um indicador de cálcio fluorescente carregada negativamente que é carregado em células em uma forma de éster de acetoximetilo permeável célula (AM). Uma vez clivada por Esteras celulareses, os indicadores fluorescentes permanecer dentro do compartimento intracelular e aumentam em intensidade de fluorescência quando o cálcio é ligado. O indicador de cálcio mais conhecidos e utilizados é o raciométrica Fura-2 desenvolvido por Roger Tsien e colegas 11. Indicadores de cálcio com afinidades diferentes para permitir diferentes pools de cálcio de cálcio a ser monitorizado. Métodos de detecção incluem imagens de células vivas, leitor de microplacas de fluorescência e citometria de fluxo. A cinética relativamente rápida de sinais de cálcio (geralmente dentro de alguns segundos a minutos) faz de células vivas imaginando o melhor método para a obtenção de mais informações sobre as características do sinal de cálcio. Além dos cinética rápida de sinais de cálcio (em milissegundos), imagens de células vivas é um método melhor para estudar compartimentalização celular da sinalização de cálcio dentro de uma única célula 12. As concentrações de cálcio absolutos pode ser calculada através da determinação da fluorescência mínima e máxima da ind cálcioicator pela adição de um quelante de cálcio e de permeabilização das células, respectivamente, como descrito por Grynkiewicz et ai. 11. A utilização de citometria de fluxo para medir sinais de cálcio foi desenvolvido pela primeira vez na década de 1980 em células imunológicas onde a oportunidade para medir vários parâmetros, tais como a integridade da membrana e separação de população de células, e o requisito de células em suspensão combinada com o desenvolvimento de um único comprimento de onda indicadores de cálcio feita de citometria de fluxo de um método ideal e convenientdetection 13-15. Em células aderentes, imagens de células vivas fornece a maior parte da informação sobre a sinalização de cálcio, mais importante, a cinética, mas requer uma instalação complicada, compreendendo um microscópio de fluorescência, um sistema de perfusão, a manutenção do ambiente celular, tais como a temperatura, e microscópio software especializado para adquirir e análise de dados. Métodos alternativos, tais como um leitor de microplacas de fluorescência ou farmacolmeios ogical através do uso de quelantes de cálcio são incomparáveis ​​em termos de informação adquirida. Citometria de fluxo é cada vez mais amplamente utilizado para monitorizar o cálcio citosólico em células aderentes, embora, na maioria dos estudos, apenas ponto de terminar as medições sejam efectuadas. Utilizando o método desenvolvido inicialmente por Gergely et al., Em células imunológicas B 16, alterações na concentração de cálcio livre citosólico por citometria de fluxo com uma cinética em tempo real e o controlo da intensidade de fluorescência em células individuais a partir de uma população de amostra foram medidos com sucesso em células epiteliais de cancro e de células-tronco do câncer híbridos 17. Este método foi adicionalmente adaptado para utilização em células epiteliais aderentes, que são difíceis de carregar com os indicadores de cálcio 18. Aqui, utilizando uma linha de células epiteliais aderentes imortalizada derivada do segmento S1 do túbulo proximal do rim de rato (WKPT-CL.2 0293) 19, descrevemos um m simplificada optimizadoétodo para a medição de alterações na concentração de cálcio citosólico, por citometria de fluxo. Uma vez que muitas células epiteliais possuem um número de transportadores orgânicos para compostos aniónicos, a carga de células com um indicador de cálcio podem provar ser um desafio. Para evitar o efluxo de indicadores de cálcio, probenecida, o inibidor prototípico de transportadores de aniões orgânicos e originalmente desenvolvido para diminuir a excreção renal de penicilina 20, é aplicado simultaneamente no meio de incubação. As células são mantidas em monocamadas de carga indicador de cálcio, apresentado em sinais de suspensão e de cálcio podem ser detectadas imediatamente após a adição do composto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:79px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:321px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-3, AM</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">F-1241&#160;</td>
			<td>Cell permeable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Probenecid</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8761</td>
			<td>Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I9657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:79px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tunicamycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software</td>
			<td style="width:79px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)</td>
			<td style="width:79px;">Joe Trotter, The Scripps Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line</td>
			<td style="width:79px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology &#38; Biophysics, Case 
			Western Reserve University, Cleveland, OH)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytosolic calcium measurements in renal epithelial cells by flow cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Para aumentar o cálcio citosólico, dois compostos farmacológicos foram aplicados a células renais do túbulo proximal (WKPT-0293 CL.2) carregadas com o corante de ligação celular permeável ao cálcio, Fluo-3-AM. Amostras de controlo não tratados foram carregadas com corante de ligação do cálcio na presença de probenecida e foram misturados, mas sem a adição de quaisquer compostos. Tapsigargina (TG) é um inibidor da bomba clássica SERCA que conduz a fugas para fora do ER e resultando em aumento de cálcio...

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Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

O cálcio está envolvido em inúmeras vias de sinalização fisiológicos e fisiopatológicos. Imagem de células vivas requer equipamento especializado e pode ser demorado. Um método rápido, simples usando um citômetro de fluxo para determinar mudanças relativas de cálcio citosólico em células epiteliais aderentes trazidos para suspensão foi otimizado.

Medidas cálcio citosólico em células epiteliais renais por citometria de fluxo

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Research

JoVE Journal

Biology

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FCM-IP: Imunoprecipitação Detectado por citometria de fluxo

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Biologia

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

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Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplicação por citometria de fluxo de protoplastas de tubérculos isolados de medição

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Medição do elevado-throughput de Dictyostelium discoideum macropinocitose por citometria de fluxo

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...