Name: cytosolic calcium measurements in renal epithelial cells by flow cytometry
Uploaded: 2014-10-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Исследования в лабораториях финансируется Фриц-Бендер фонда, Мюнхен, Германия (в ТД) и Университета Виттен / Хердекке внутреннего исследовательского гранта (на В.-KL). Мы хотели бы поблагодарить проф д-р д-р Франк Thévenod (Институт физиологии, патофизиологии и токсикологии Университета Виттен / Хердекке) за полезные предложения.

1. Подготовка реагентов и решения <ol><li> Подготовка сбалансированный солевой раствор модифицированной Хэнка (HBSS) (в мм: 136,9 NaCl, 5,37 KCl, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 NaHCO 3, рН 7,2, нет фенол красный). Хранить при 4 ° С. </li><li> Сделать 1,5 М CaCl 2 и 2 М 4- (2-гидроксиэтил) -1-пипераз?...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li><li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+pumps+in+health+and+disease.">Calcium pumps in health and disease.</a> Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling.">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li><li>Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+actions+of+calcium-mobilizing+messenger,+inositol+1,4,5-trisphosphate.">Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate.</a> Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).</li><li>Putney, J. W., Ribeiro, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+between+the+plasma+membrane+and+endoplasmic+reticulum+calcium+stores.">Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).</li><li>Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM+proteins:+dynamic+calcium+signal+transducers.">STIM proteins: dynamic calcium signal transducers.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).</li><li>Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+uptake.">Mitochondrial calcium uptake.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).</li><li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium+and+cell+death:+a+deadly+triad+in+neurodegeneration.">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).</li><li>Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channels+and+pumps+in+cancer:+changes+and+consequences.">Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences.</a> J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).</li><li>Roderick, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+in+the+heart:+when+it's+good,+it's+very+very+good,+but+when+it's+bad,+it's+horrid.">Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid.</a> Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli.">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. , (2013).</li><li>Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intracellular+calcium+in+vital+cells+by+flow-cytometry.">Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry.</a> Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).</li><li>June, C. H., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+cellular+ionized+calcium+concentration.">Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration.</a> Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).</li><li>Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+intracellular+calcium+mobilization.">Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization.</a> Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).</li><li>Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+Ca2++flux+measurement+on+isolated+human+B+cells+that+uses+flow+cytometry.">A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).</li><li>Seidel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotransmitter+GABA+is+a+potent+inhibitor+of+the+stromal+cell-derived+factor-1alpha+induced+migration+of+adult+CD133++hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).</li><li>Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Th&#233;venod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK1/2-dependent+bestrophin-3+expression+prevents+ER-stress-induced+cell+death+in+renal+epithelial+cells+by+reducing+CHOP.">ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP.</a> Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).</li><li>Woost, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+characterization+of+proximal+tubule+cells+derived+from+kidneys+of+spontaneously+hypertensive+and+normotensive+rats.">Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats.</a> Kidney Int. 50, 125-134 (1996).</li><li>Beyer, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benemid,'+p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic+acid;+its+renal+affinity+and+its+elimination.">Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination.</a> Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).</li><li>Buckley, B. J., Whorton, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunicamycin+increases+intracellular+calcium+levels+in+bovine+aortic+endothelial+cells.">Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells.</a> Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).</li><li>Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SLC22+family+with+transporters+of+organic+cations,+anions+and+zwitterions.">The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions.</a> Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).</li><li>Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+ATP-binding+cassette+(ABC)+transporter+superfamily.">The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily.</a> J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).</li><li>Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+expression+of+P-glycoprotein+as+a+determinant+of+loading+with+fluorescent+calcium+probes.">Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes.</a> Cytometry. 17, 343-348 (1994).</li><li>Th&#233;venod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+multidrug+resistance+P-glycoprotein+via+nuclear+factor-kappaB+activation+protects+kidney+proximal+tubule+cells+from+cadmium-+and+reactive+oxygen+species-induced+apoptosis.">Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis.</a> J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).</li><li>Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Th&#233;venod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadmium+induces+Wnt+signaling+to+upregulate+proliferation+and+survival+genes+in+sub-confluent+kidney+proximal+tubule+cells.">Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells.</a> Mol Cancer. 9, 102 (2010).</li><li>Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+mobilization+in+human+platelets+using+indo-1+and+flow+cytometry.">Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry.</a> Blood. 74, 2674-2680 (1989).</li><li>Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cytosolic+ionized+calcium+variation+in+polymorphonuclear+leukocytes+using+flow+cytometry+and+Indo-1+AM.">Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM.</a> Cytometry. 10, 165-173 (1989).</li></ol>

Кальций является ключевым событием в нескольких клеточных процессов, действующих в качестве второй молекулы посланник сигнализации, а также в качестве средства общения между ЭР и митохондрий. Возможность измерения изменений в свободных цитозольными концентрации кальция является по...

Кальций является важным вторичным мессенджером отвечает за передачу клеточного физиологических и патофизиологических сигналов 1. Цитозольные концентрации кальция на низком уровне благодаря активности насосов кальция и обменных кальция. Саркоплазматического / эндоплазматический АТФазы ретикулума кальция (SERCA) пополняет эндоплазматической сети (ER) магазин кальция в качестве части системы «утечки насоса&quot; в то время как АТФ-азы плазматической мембраны кальция (PMCA) экструдирует кальция в внеклеточное, как в АТР-зависимых манер 2. Физиологические мессенджеры, такие как гормоны или нейромедиаторы, передают свои сигналы через G-белками рецепторов, активацию фосфолипазы С, который гидролизует фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат (PIP2) в плазматической мембране, чтобы генерировать и диацилглицерол инозитол трифосфата (IP3) 3. В то время как диацилглицерин остается в плазматической мембране, IP3 диффундирует в цитозоле и связывается с рецептором IP3S (IP3Rs), которые лиганд активированные кальциевые каналы, найденные в ER мембраны и кальций высвобождается из ER просвета магазине кульминацией к увеличению концентрации кальция цитозольных 4. Альтернативный путь для достижения кальция в цитозоль через кальциевых каналов и теплообменников, присутствующих в плазматической мембране. Перекрестные помехи между этими двумя отсеками были описаны: выпуск кальция индуцированной кальция (CICR), где внеклеточного кальция вызывает высвобождение кальция из ER магазинах 5, и магазин работает поступления кальция (SOCE), где опорожнения из ER магазинах воспринимается СТИМ и вызывает открытие ORAI кальциевые каналы в плазматической мембране, чтобы способствовать повторным наполнением ER магазинах 6. Под патофизиологических условиях, ответ сотовой кальция разрегулирована и цитозольных увеличивается кальция в отсутствие физиологических стимуляторов 1. Реакция кальция может повлиять на несколькими способами: длительное кальцийСигнал, задерживается удаление кальция из цитоплазмы, истощение магазинах кальция или локализованных изменений в кальция. Кроме того, митохондрии взять на главную роль в буферизации и выпуская кальций 7. Длительное и / или сверхмаксимальном цитозольный увеличение кальция приводит к гибели клеток. На самом деле, кальция чаще всего не участвует в клеточном патофизиологической ответ и является ключевым событием в широком спектре заболеваний, таких как нейродегенеративные заболевания, болезни сердца, рак, болезни костей и заболевания почек, которые в основном связаны с клеточной смерти и потеря или изменение органа или ткани функции 8-10. Кроме того, возмущение сигналов кальция было связано с клеточной адаптации и изменений в клеточных функций и реакций. Традиционно сигналы кальция измеряются с отрицательно заряженной флуоресцентного индикатора кальция, который загружается в клетках в клетки проницаемыми ацетоксиметиловый (AM) форме эфира. После того, как расщепляется клеточными esterasэс, флуоресцентные показатели остаются в пределах внутриклеточное пространство и увеличить интенсивность флуоресценции при кальция связан. Самый известный и используемый показатель кальция является пропорциональный Фура-2 разработана Роджером Tsien и коллег 11. Показатели кальция с различной аффинностью к кальция позволяют различные бассейны кальция, подлежащих мониторингу. Методы обнаружения включают живых изображений сотовый, флуоресценции планшетного и проточной цитометрии. Относительно быстро кинетика кальциевых сигналов (обычно в течение нескольких секунд до минут) делает живых изображений сотовый наилучший метод для получения наиболее полную информацию о характеристиках сигнала кальция. Помимо быстрой кинетики сигналов кальция (в пределах миллисекунд), изображений живых клеток является лучшим методом изучения клеточного обособления кальциевой сигнализации в пределах одной ячейки 12. Абсолютные концентрации кальция можно рассчитать путем определения минимального и максимального флуоресценции экз кальцияicator добавлением хелатирующего кальция и permeabilizing клетки, соответственно, как описано Grynkiewicz соавт. 11. Использование проточной цитометрии для измерения сигналов кальция была впервые разработана в 1980-х годах в иммунологических клеток, где возможность измерения нескольких параметров, таких как целостности мембраны и разделения популяции клеток, а также требование клеток в суспензии в сочетании с развитием одной длине волны показатели кальция из проточной цитометрии идеального и convenientdetection метода 13-15. В прикрепленных клеток, изображений живых клеток обеспечивает наиболее полную информацию о кальциевой сигнализации, самое главное кинетики, но требует сложной настройки, содержащий флуоресцентный микроскоп, систему перфузии, поддержание клеточной среды, таких как температура, и специализированное программное обеспечение микроскоп для приобретения и анализа данных. Альтернативные способы, такие как флуоресценция микропланшет-ридера или Pharmacological средства через использование хелаторов кальция несравнимы с точки зрения накопленного информации. Проточной цитометрии становится все более широко используются для контроля цитозольную кальция в прикрепленных клеток, хотя, в большинстве исследований, только конечная точка измерения выполняются. С помощью метода, первоначально разработанный Gergely и др. В иммунологических В-клеток 16, изменения в цитозольной концентрации свободного кальция с помощью проточной цитометрии с в режиме реального времени и мониторинга кинетики интенсивности флуоресценции в отдельных клеток из популяции образца были успешно измеряется в раковых эпителиальных клеток и стволовых клеток рака гибриды 17. Этот метод был дополнительно приспособлен для использования в адгезивных эпителиальных клеток, которые трудно загружать с показателями кальция 18. Здесь, с помощью клейкого иммортализованной линии эпителиальных клеток, полученной из сегменте S1 крысы проксимальных канальцах почек (WKPT-0293 Cl.2) 19, опишем оптимизированную упрощенную меню для измерения изменений в цитозольной концентрации кальция методом проточной цитометрии. Поскольку многие эпителиальные клетки обладают рядом органических перевозчиков для анионных соединений, загрузка клеток с индикатором кальция может оказаться сложной задачей. Чтобы предотвратить отток показателей кальция, пробенецидом, прототипом ингибитора органических анионов перевозчиков и первоначально разработанной для уменьшения почечной экскреции пенициллина 20, применяется одновременно в среде инкубации. Клетки поддерживали в монослоев для индикатора кальция загрузки, приведены в подвески и кальциевых сигналов могут быть обнаружены сразу же после того соединения.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:79px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:321px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-3, AM</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">F-1241&#160;</td>
			<td>Cell permeable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Probenecid</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8761</td>
			<td>Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I9657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:79px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tunicamycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software</td>
			<td style="width:79px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)</td>
			<td style="width:79px;">Joe Trotter, The Scripps Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line</td>
			<td style="width:79px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology &#38; Biophysics, Case 
			Western Reserve University, Cleveland, OH)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytosolic calcium measurements in renal epithelial cells by flow cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Для увеличения цитозольную кальций, два фармакологические соединения наносили на проксимальных почечных канальцев клеток (WKPT-0293 Cl.2), нагруженных связывания клеток проницаемой кальция красителя, Fluo-3-AM. Образцы необработанных контрольных были загружены кальция связывания красителя в ...

Watch this Scientific Journal Video about Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Кальций участвует в многочисленных физиологических и патофизиологических сигнальных путей. Изображений живых клеток требует специального оборудования и может занять много времени. Быстрый, простой метод с использованием цитометр потока для определения относительных изменений цитозольным кальция в прикрепленных эпителиальных клеток ввели в суспензии оптимизированы.

Цитозольные Измерения кальция в почечных эпителиальных клеток методом проточной цитометрии

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Research

JoVE Journal

Biology

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

IP-FCM: Иммунопреципитация обнаружен с помощью проточной цитометрии

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Проточной цитометрии Очистка мыши мейоза клетки

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Хроматина Изоляция очистки РНК (чирпа)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Оптимизирован Окрашивание и распространения методов моделирования для деления клеток Мониторинг использования красителей сотовых слежения

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Быстрое Генетический анализ эпителиальных мезенхимальных сигнализации во время регенерации волос

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Высокая эффективность Дифференциация человека плюрипотентные стволовые клетки, чтобы кардиомиоцитов и характеристика цитометрическим

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Анализ Суспензии клеток, выделенная из твердых тканей с помощью спектральной проточной цитометрии

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Измерение Endoreduplication подачей Cytometry изолированных клубней протопласта

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Высок объём измерение сапротрофные discoideum макропиноцитозом, поток цитометрии

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...