Name: killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells
Uploaded: 2014-08-11T19:00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Dette arbejde er blevet støttet af den tyske Research Foundation (DFG) SCHU 2681 / 1-1 (CS) og KFO 146 (MF), DOD forsvarsministerium tilskud PC 040.972 (MO) og National Institute of Health giver RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)

1. Generering af HLA-A2-Ig-Based KaAPC <ol><li> Forbered steril boratbuffer. Lav en 0,1 M opløsning af borsyre i vand og justere pH til 7,0. Sterilt filter (0,22 um) buffer og opbevares ved 4 ° C. </li><li> Forbered steril perle vaskebuffer. Brug phosphatbufret saltvand (PBS) uden magnesium og calcium. Tilføj humant AB serum i 3% slutkoncentration. Tilføj ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i 2 mM slutkoncentration. Tilføj natriumazid (NaN 3) til 0,01% slutkoncentration. Sterilt filter (0,22 um) buffer og opbevares ved 4 ° C. </li><li> Overfør 250 ul epoxy perler (ca. 100 x 10 6 perler) fra lager i en steril, skruelåg hætteglas. </li><li> Tilføj 250 ul boratbuffer. </li><li> Sæt hætteglas på en magnet og lad perler adhærere i 2 minutter; aspireres buffer og fjerne hætteglas fra magneten. </li><li> Vask perlerne en gang med 1 ml boratbuffer. </li><li> Resuspender perler i 550 pi 0,018 ug/ Ml HLA-A2-lg og 3,64 ug / ml anti-humant CD95-mAb (klon CH11) og bland forsigtigt ved omrystning. (Se venligst diskussion afsnit for yderligere oplysninger.) </li><li> Inkuber hætteglas på en rotator ende over ende ved 4 ° C i 24 timer. </li><li> Spin ned perler ved 300 xg i 2 min. </li><li> Placer hætteglas på en magnet i 2 minutter og aspirér &quot;KaAPC loading løsning&quot;; fjerne hætteglas fra magnet tilsættes 1 ml perle vaskebuffer og resuspender grundigt ved at ryste. </li><li> Gentag trin 1.10 to gange. </li><li> Inkuber hætteglas på en rotator ved 4 ° C i 24 timer i 1 ml perle vaskebuffer. På dette tidspunkt, vil enhver resterende proteinbindingssteder blokeres af humant AB serum indeholdt i perlen vaskebuffer. </li><li> Spin ned perler ved 300 xg i 2 min. </li><li> Placer hætteglas på en magnet i 2 minutter og aspirere perle vaskebuffer; fjerne hætteglas fra magneten og erstatte løsning med 1 ml PBS. </li></ol> 2. Kvalitetskontrol, Peptid Loading, Wforaskning, opbevaring og stabilitet KaAPC <ol><li> Overfør 1,5 x 10 5 KaAPC ind i en FACS rør og vask med 1 ml FACS vaskebuffer. </li><li> Resuspender perler i 100 pi FACS vaskepuffer og tilføje 1 ml af anti-muse-IgG1-PE (til påvisning af Fc-del af HLA-A2-lg) og 1 ul anti-muse-IgM-FITC (klon R6-60.2 til påvisning af anti-humant CD95 mAb). </li><li> Inkuber i 15 minutter ved 4 ° C, vaskes med 1 ml FACS vaskepuffer og resuspender i 250 pi FACS vaskepuffer og læse farvning ved flowcytometri. </li></ol><img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1. QC plet af en KaAPC parti foretages som anført i protokollen sektion. Farvning blev udført som beskrevet i protokollen afsnit 2. HLA-A2-Ig blev påvist ved anvendelse af et anti-muse-lgG1 PE-mAb, medens anti-human-CD95 (anti-Fas) blev detekteret med et anti-muse-IgM-FITC mAb (se protokol sektion 2.2) (blå linje). Fyldte sorte grafer repræsenterer tomme perler farves med anti-muse-lgG1 PE mAb eller anti-muse-IgM-FITC mAb hhv. Tal i øverste højre hjørne angiver den gennemsnitlige fluorescerende intensitet (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <ol start="4"><li> For peptid lastning overførsel 20 x 10 6 KaAPC ind i en ny steril hætteglas, placere på en magnet i 2 min, aspireres PBS og resuspender perler i 500 pi frisk PBS med 5 ug peptid (Husk, kun HLA-A2 begrænsede peptider binde på dimeren!). </li><li> Opbevares indlæst KaAPC ved 4 ° C indtil anvendelse, i mindst 3 dage for at tillade tilstrækkelig peptid lastning på HLA-A2-Ig-dimer. </li><li> Umiddelbart før brug, vaske lastet KaAPC som angivet i 1.14 peptid; gentage dette trin mindst 6x. BEMÆRK: Dette er et afgørende skridt til at sikre, at den frie peptid har to fjernes helt for at undgå falske positive drab resultater; resterende frie peptid har vist sig at inducere apoptose i antigen-specifikke T-cellekulturer 9. For at udelukke en opløselig peptid effekt, køre supernatant- kontrolprøver af peptid indlæst og vaskede KaAPC (se 3.8). </li><li> Tæl perler ved hjælp af hæmocytometer og mærke med dato, navn på peptid og koncentration. BEMÆRK: Loaded KaAPC forblive funktionsdygtigt ved 4 ° C i mindst en måned. Efter en måned genpålæsningen med det samme peptid giver KaAPC skal anvendes til op til et år. </li></ol> 3. KaAPC In Vitro Killing Assay <ol><li> Forbered co-kultur medier. Forbered komplet RPMI-medium suppleret med 3% T-cellevækstfaktor (fremstillet i laboratoriet 6) og 3% donor autologt plasma. Hvis donor autolog plasma er tilgængelig, varmeinaktiverede humant AB serum. </li><li> Forbered AnnexinV bindende forberedelse buffer. Opløs 8,12 g natriumchlorid (NaCl) og 0,12 g calcium-chlorid (CaCl2) i 990 ml dobbeltdestilleret 2 O.Add 10 ml 1M HEPES-buffer. </li><li> Generere humane antigen-specifikke T-celler. (For en detaljeret protokol se en tidligere publikation 7 udnytte kunstige antigenpræsenterende celler (AAPC)). Kontroller, at peptid specificitet er mindst&gt; 75% som bestemt ved tetramerfarvning. </li><li> For hver prøve inkuberes 2 x 10 5 antigenspecifikke T-celler / brønd (i en 96-brønds rundbundet plade) i 200 pi codyrkningsmediet i en 1: 1-forhold med KaAPC i 48 timer i en befugtet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. </li><li> Harvest prøver og overførsel til en FACS rør; vaskes med 1 ml AnnexinV bindingsbuffer, spin ned ved 300 x g i 5 minutter, kasseres supernatanten og resuspender i 100 pi AnnexinV bindingsbuffer </li><li> Stain prøver med 1 pi AnnexinV FITC og 5 pi 7-AAD i 10-15 minutter ved stuetemperatur, vaskes med 1 ml AnnexinV bindende buffer; spin ned ved 300 xg i 5 minutter, kasseres supernatanten end resuspender i 250 pi AnnexinV bindingsbuffer </li><li> Læs straks prøverne på flowcytometer. </li><li> Forbered følgende prøver at bestemme antigen-specifikt drab af KaAPC: T kun celler; T-celler + opløseligt anti-CD95; T-celler + losses KaAPC; T-celler + ikke-beslægtede peptid indlæst KaAPC; T-celler + beslægtet peptid indlæst KaAPC; T-celler + supernatant beslægtet peptid indlæst KaAPC. </li></ol><img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> . Figur 2. KaAPC dræbe assayet Peptid indlæst KaAPC eller kontrolperler (HLA-A2-Ig perlerne), blev dyrket i 48 timer i en 1: 1-forhold med CMVpp65 specifikke T-celler (~ 80%), høstet og efterfølgende farvet med AnnexinV og propidiumiodid (PI) for at bestemme apoptose ved flowcytometri (se protokol afsnit 3,3-3,7). &quot;beslægtede&quot; henviser til perler fyldt med CMVpp65 og &quot;ikke-beslægtet&quot; at væreannoncer læsset med Mart-1 peptid. Tal angiver procentdelen af levedygtige T-celler i nederste venstre kvadrant af hver parcel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <ol start="9"><li> For at udføre kryds og tværs-eksperimenter generere antigenspecifikke T-celler fra to forskellige specificiteter. </li><li> Yderligere evaluering af antigenspecifikke depletion-evner KaAPC med en samtidig analyse af antigen-specifik eliminering af T-celler i heterogen T-cellepopulation. (For en detaljeret protokol se Schütz m.fl.. 10). </li></ol>

<ol>
	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CS og MF har intet at afsløre. Under en licensaftale mellem NexImmune og Johns Hopkins University, Drs. Schneck og Oelke har ret til andele af royalties modtaget af universitetet på salget af AAPC produkter, der beskrives i denne artikel. De ejer også NexImmune bestand, der er underlagt visse restriktioner under universitetet politik. Dr. Schneck er medlem af selskabets &quot;s bestyrelse og Scientific Advisory Board. Vilkårene i dette arrangement bliver forvaltet af Johns Hopkins University i overensstemmelse med sin interessekonflikt politik.

Det mest kritiske trin i protokollen er at sikre passende forhold mellem signal 1 (peptid MHC) og signal 2 (anti-Fas-mAb). Vi har foretaget intensive titreringsforsøg for at definere det perfekte forhold for signal 1 og 2; det blev klart, at minimale variationer, som skyldes forskelle i HLA-A2 Ig-dimer eller anti-Fas mAb-koncentrationer kan forstyrre funktionaliteten af ​​KaAPC. Derfor bør koncentrationen af ​​begge signaler altid kontrolleres og kvaliteten af ​​begge proteiner bør jævnligt testes, selvom det blev bestilt fra en kommerciel kilde. Endvidere bør koncentrationen altid bestemmes af det samme assay som forskellige påvisningsassays kan resultere i forskellige koncentrationer. Funktionalitet af HLA-A2-Ig kan også blive forringet på grund af ufuldstændig refoldningen og / eller ineffektiv peptid belastning. Desuden dimer molekyler kan samle til forskellige grader, hvilket kan få konsekvenser på den funktionelle aktivitet af proteinet. Derfor actual mængde dimer nødvendig til generering af et funktionelt og specifik KaAPC kan variere. Desuden fandt vi, at den ideelle område for døden inducere signal anti-Fas-mAb på KaAPC er ekstremt stramt. I vore hænder større mængder 3.64 ug / ml føre til ikke-specifik drab på Fas positive T-celler, mens beløb under 3,64 ug / ml resulterede i en dosisafhængig reduceret drab aktivitet. Mens disse betingelser synes ganske stramt vil opmærksomhed på disse detaljer resultere i dannelsen af ​​et funktionelt og specifik KaAPC. Mens den aktuelle KaAPC fænotype er funktionel til udtømning af aktiverede antigenspecifikke T-celler, indledende forsøg rettet naive eller hvilende antigenspecifikke T-celler viste ingen signifikant induktion af antigen-specifik apoptose disse populationer har reduceret Fas-ekspression. Derfor kan man forestille sig tilsætning af et co-stimulatorisk signal på KaAPC at inducere opregulering af Fas på hvilende T-celler til at vende demind i et mål for KaAPC. Mens det er muligt alle tre signaler skal titreres forsigtigt for at sikre en funktionel KaAPC fænotype. Justering perlen platform til en biokompatibel eller bionedbrydelig matrix forbedre KaAPC in vivo anvendelighed. For nylig, Shen et al. Har rapporteret den vellykkede in vivo-anvendelse af KaAPC udnytte 5 um latexperler konjugeret til anti-Fas (klon Jo2) og anti-His / H2-Kb -TRP2 11. Vi har været i stand til at vise, at det generelle koncept af kunstige antigenpræsenterende celler (AAPC) kan med held overføres fra um dimensioneret til nm mellemstore partikler 12 og at funktionaliteten påvirkes af partikelgeometri 13. Således ved at variere størrelsen og / eller form af fremtidig KaAPC designs man kunne være i stand til at have indflydelse på in vivo funktionalitet og bio-distribution, som kan være afgørende for en vellykket behandling af organspecifikke autoimmune sygdomme. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC overvinde de store mangler i cellebaserede udtynding strategier som en nem at bruge &quot;hyldevare&quot;, tid og omkostningseffektiv tilgang, der er uafhængig af donor tilstand og forbehandling. KaAPC er ikke mål for selvregulering eller parakrin drab signalering og ikke følsom over for cytolytiske effektorfunktioner af CTL. KaAPC vil kræve identifikation af den pågældende sygdom antigen og stole på deres specifikke HLA-type. Mens øjeblikket adskillige egnede HLA-A2 begrænsede antigener til type 1-diabetes, har GvHD og multipla sklerose blevet identificeret 2, udvikling af yderligere HLA klasse I dimer molekyler samt den løbende identifikation af nye autoimmune relevante antigener vil stige yderligere og udvide anvendeligheden af KaAPC. Desuden kunne man tænke på at bruge KaAPC rettet mod forskellige epitoper til at målrette flere antigener samtidigt. Sammenfattende KaAPC repræsenterer en fleksibel platform teknologi til entigen-specifikke T-celle-depletering. Deres &quot;lego-lignende&quot; karakter gør det muligt at medtage nye signaler såsom ekstra co-stimulerende eller hæmmende signaler såsom PD1 eller spor på forskellige matricer, der kan udvide og forbedre deres efterfølgende in vitro og in vivo anvendelighed. Vi heri præsentere trin-for-trin-protokollen til at generere KaAPC, den første perle tilgang til fjernelse af antigen-specifikke T-celler fra T-celle-blandinger med forskellige specificiteter. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3. KaAPC fjerne CTL på en antigen-specifik måde PKH26-mærkede aktiverede Fas + effektor-hukommelses-CTL og PKH67-mærket CMVpp65 CTL fra samme donor blev blandet til en 1:. 1-forhold og co-dyrket med CMVpp65 KaAPC i 48 timer. Kontrolkulturer blev behandlet med losset KaAPC eller 1 ug / mlaf opløseligt anti-Fas-mAb (klon CH11). Minimalt tab af levedygtige celler blev bestemt i ubehandlet blandet CTL kulturer (t mix). Originale FACS data for hver CTL population af T-mix er vist. Analyse af apoptose blev udført som tidligere offentliggjort af særskilt gating på begge T-cellepopulationer 10. Tal vist i øverste venstre kvadranter repræsenterer% af totale celler. Den illustrerer figur er afledt fra et repræsentativt eksperiment ud af tre uafhængige eksperimenter. Denne forskning blev oprindeligt udgivet i blod. . Schütz, C. m.fl. Killer kunstige antigenpræsenterende celler: en ny strategi til at slette specifikke T-celler Blood.. 2008 111, 3546-52. Ophavsret American Society of Hematology. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

I løbet af de sidste to årtier er der gjort store fremskridt i forståelsen af ​​patogene mekanismer i autoimmune sygdomme. Men det mest almindelige behandlinger stadig kunne stole på kortikosteroider samt immunosuppressive lægemidler, såsom purinanaloger, alkyleringsmidler og calcineurinhæmmere 1. Anvendelsen af ​​sådanne lægemidler har forbedret prognose for patienter, men behandlingen giver ikke en helbredelse af den underliggende immunologiske funktionsfejl. Endvidere patienter bliver sårbar over for infektioner og til udvikling af cancer. Derfor det ultimative mål for behandling af T-celle medierede autoimmune sygdomme og allotransplantatafstødning er specifikt rettet mod kun sygdom, der forårsager T-celler, mens på samme tid, hvilket efterlader de resterende immunsystemet uberørt og kompetente til at bekæmpe immunologiske lidelser. Utilizing antigenpræsenterende celler (APC), som en behandling for at undertrykke perifere T-celle-responser blev først beskrevet så tidligt som1970&#39;erne af flere grupper. Siden er blevet udviklet så mange cellebaserede midler (revideret i Schütz m.fl.. 2). Strategier via FasL-udtrykkende killer-APC som immunregulatoriske celler viste lovende resultater indikerer terapeutisk potentiale til behandling af autoimmunitet, allograftafstødning og kroniske infektioner. Men der er væsentlige begrænsninger med strategier udnytter FasL Killer-APC, som i sidste ende begrænset deres kliniske anvendelighed; (I) produktion eller isolation af APC er tid, arbejdskraft og omkostningskrævende (ii) at patienter, der lider af cytopeni grund immunosuppression levere begrænsede mængder og kvalitet af celler (iii) belægning eller transduktion af APC med apoptoseinducerende signaler såsom FasL resulterer i meget variable fænotyper og (iv) Killer-APC er følsomme over for cytotoksisk effektorfunktioner af T-celler følgelig reducerer deres terapeutiske potentiale. Derfor er det vanskeligt at sikre en defineret reproducerbar Killer-APC phenotype, der kan udnyttes til antigenspecifik modulering af T-celle responser in vivo. Baseret på vores tidligere arbejde med FasL udtrykker Killer-APC 3-5 og kunstige antigenpræsenterende celler (AAPC) 6,7 udviklede vi en perle tilgang (KaAPC) for antigen-specifik hæmning eller fjernelse af auto-reaktive T-celler i vitro. KaAPC består af en HLA-A2-Ig-dimer (signal 1) og et anti-Fas-mAb (apoptoseinducerende signal) kovalent immobiliseret på en overflade af en 4,5 um paramagnetisk latexperle. De nedbryder antigenspecifikke T-celler i et Fas / Fas-L-medierede mode fra T-cellekulturer af multiple specificiteter på en antigen-specifik måde og uafhængigt af aktivering induceret celledød (AICD) vej. Dosisafhængig apoptose i målrettede T-celler induceres hurtigt allerede efter 30 min 8. KaAPC kan let genereres i en kontrolleret måde sikrer en defineret fra hylden phenotype og overvinde de fleste af manglerne ved cellebaserede udtynding strategier. Følgelig KaAPC vist stort potentiale til behandling af T-celle medierede autoimmune sygdomme og afstødning, fremme inden for T-celle specifikke behandlingsstrategier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

Nuværende behandling af T-celle-medierede autoimmune sygdomme meste afhængig strategier for global immunosuppression, hvilket på lang sigt, er ledsaget af bivirkninger, såsom en nedsat evne til at bekæmpe infektioner eller maligne sygdomme. Derfor er det nødvendigt, nye tilgange, der skal udvikles, der kun målretter mod sygdom medierende celler og lade det resterende immunsystem intakt. Over det seneste årti en række cellebaserede immunterapi strategier til at modulere T-celle-medierede immunresponser er blevet udviklet. De fleste af disse metoder er afhængige af tolerance-fremkaldende antigen-præsenterende celler (APC). Men foruden at være teknisk vanskelig og besværlig, er meget følsomme over for cytotoksiske T-celle-responser, hvilket begrænser deres terapeutiske kapacitet sådanne cellebaserede. Her præsenterer vi en protokol til generering af ikke-cellulær killer kunstige antigenpræsenterende celler (KaAPC), som giver mulighed for udtømning af patologiske T-celler mens reresterende immunsystem uberørt og funktionelle. KaAPC er en alternativ løsning til cellulær immunterapi, som har potentiale til behandling af autoimmune sygdomme og allotransplantatafstødninger ved at regulere uønskede T-celle responser på en antigenspecifik måde.

Funktionerne i denne protokol omfatter den definerede generering af en KaAPC fænotype, der viser HLA-A2-Ig (signal 1) og anti-Fas-mAb (apoptose signal) på samme tid, som i sammenligning med cellebaserede metoder ikke ændres ved belægning eller transduktion effektiviteter og kan let moduleres under produktion (figur 1). Endvidere KaAPC, er ikke følsomme over for cytotoksiske effektor-funktioner af T-celler, og deres funktionalitet ikke er afhængig af kvaliteten af autologe antigenpræsenterende celler før og efter in vitro-manipulation. KaAPC er i stand til at udtømme antigenspecifikke T-celler in vitro, når fyldt med beslægtet peptid, mens ikke-beslægtede loaded KaAPC opbruger ikke T-celler (figur 2). Derfor KaAPC inducere T-celle-apoptose i en antigen-specifik måde. Derefter anvendte vi KaAPC til selektiv udtømning af antigenspecifikke T-celler fra en blanding af forskellige T-celle specificities, der viser, at kun minimal cytotoksicitet lækker i nabo T-celler (Figur 3). Således KaAPC repræsenterer en udsøgt værktøj til in vitro antigen-specifik udtømning af humane aktiverede antigen-specifikke T-celler med potentiel klinisk anvendelighed til behandling af autoimmune sygdomme og allotransplantatafstødninger.

Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Retningslinjer præsenteres til generering af killer kunstige antigenpræsenterende celler, KaAPC, et effektivt værktøj til in vitro-udtømning af humane antigen-specifikke T-celler, og en alternativ løsning til cellulær immunterapi til behandling af T-celle-medierede autoimmune sygdomme i et antigen specifik måde uden at kompromittere den resterende immunsystemet.

Killer Kunstig antigen-præsenterende celler (KaAPC) til effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Udtømning af humane antigen-specifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Kunstig antigenudvisende celle (AAPC) medieret aktivering og ekspansion af naturlige dræberceller T-celler

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinisk anvendelse af<em&gt; Tornerose</em&gt; Artificial og antigen-præsenterende celler til genetisk at modificere T-celler fra perifert og navlestrengsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Udvikling af et antigen-drevet Colitis Model at studere Præsentation af antigener ved antigen-præsenterende celler for T-celler

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generering<em&gt; De Novo</em&gt; Antigenspecifikke humane T-celle receptorer ved retroviral transduktion af Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Udvikling af Stem Cell-afledte antigen-specifikke regulatoriske T celler mod Autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detektion og berigelse af Rare Antigen-specifikke B-Celler til analyse af fænotype og funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay til påvisning af Antigen-specifikke T-celle cytolytisk funktion ved hjælp af en Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generation af diskriminerende menneskelige monoklonale antistoffer fra sjældne Antigen-specifikke B celler cirkulerer i blodet

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...