Name: killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells
Uploaded: 2014-08-11T19:00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Duitse Research Foundation (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) en KFO 146 (MF), de DOD ministerie van Defensie subsidie ​​PC 040.972 (MO) en het National Institute of Health verleent RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)

1 generatie van HLA-A2-Ig Based KaAPC <ol><li> Bereid steriele boraatbuffer. Maak een 0,1 M oplossing van boorzuur in water en de pH op 7,0. Steriel filter (0,22 pm) buffer en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Bereid steriele kraal wasbuffer. Met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder magnesium en calcium. Voeg humaan AB serum voor 3% uiteindelijke concentratie. Voeg ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) voor 2 mM eindconcentratie. Voeg natriumazide (NaN 3) voor 0,01% uiteindelijke concentratie. Steriel filter (0,22 pm) buffer en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Breng 250 pi epoxykralen (ongeveer 100 x 10 6 kralen) uit voorraad in een steriele glazen schroefdop flacon. </li><li> Voeg 250 pl boraatbuffer. </li><li> Zet glazen flacon op een magneet en laat kralen houden gedurende 2 minuten; aspireren buffer en verwijder glazen flacon van magneet. </li><li> Was parels eenmaal met 1 ml boraatbuffer. </li><li> Resuspendeer kralen in 550 ul van 0,018 g/ Ml HLA-A2-Ig en 3,64 ug / ml anti-humaan CD95 mAb (kloon CH11) en meng door schudden. (Zie de discussie sectie voor meer informatie.) </li><li> Incubeer glazen flacon op een rotator over de kop, bij 4 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Spin down kralen bij 300 g gedurende 2 minuten. </li><li> Plaats glazen flacon op een magneet voor 2 min en zuig de &quot;KaAPC laden oplossing&quot;; verwijder glazen flacon van magneet, voeg 1 ml van de kraal wasbuffer en mengen zorgvuldig door te schudden. </li><li> Herhaal stap 1.10 tweemaal. </li><li> Incubeer glazen flacon op een rotator bij 4 ° C gedurende 24 uur in 1 ml kraal wasbuffer. Op dit moment worden alle resterende eiwit bindingsplaatsen geblokkeerd door humaan AB serum in de kraal wasbuffer. </li><li> Spin down kralen bij 300 g gedurende 2 minuten. </li><li> Plaats glazen flacon op een magneet voor 2 min en zuig kraal wasbuffer; verwijder glazen flacon van magneet en vervang oplossing met 1 ml PBS. </li></ol> 2 Quality Control, Peptide Laden, Wverassing, opslag, en de stabiliteit van KaAPC <ol><li> Transfer 1.5 x 10 5 KaAPC in een FACS buis en wassen met 1 ml FACS wassen buffer. </li><li> Resuspendeer kralen in 100 ui FACS wasbuffer en voeg 1 pl anti-muizen IgG1 PE (voor detectie van het Fc gedeelte van het HLA-A2-Ig) en 1 pl anti-muis IgM FITC (kloon R6-60.2, voor detectie van de anti-humaan CD95 mAb). </li><li> Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C, wassen met 1 ml FACS wasbuffer en resuspendeer in 250 ul FACS wasbuffer en lees kleuring door flowcytometrie. </li></ol><img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1 QC vlek van een KaAPC batch gemaakt zoals in het protocol. Kleuring werd uitgevoerd zoals in paragraaf 2 beschreven protocol HLA-A2-Ig werd gedetecteerd met een anti-muis-IgG1 PE mAb, terwijl anti-humaan-CD95 (anti-Fas) werd gedetecteerd met een anti-muis IgM-FITC mAb (zie protocol sectie 2.2) (blauwe lijn). Gevulde zwarte grafieken tonen lege korrels gekleurd met anti-muis-IgG1 PE mAb en anti-muis IgM-FITC mAb, respectievelijk. Nummers in de rechter bovenhoek geven de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <ol start="4"><li> Voor peptidebelading overdracht 20 x 10 6 KaAPC in een nieuwe steriele glazen flesje, leg op een magneet voor 2 min, aspireren PBS en resuspendeer kralen in 500 ul verse PBS met 5 ug peptide (Houd in gedachten, alleen HLA-A2 beperkte peptiden zal binden op het dimeer!). </li><li> WINKEL geladen KaAPC bij 4 ° C tot gebruik, gedurende ten minste 3 dagen voldoende peptide geladen op het HLA-A2-Ig dimeer mogelijk. </li><li> Onmiddellijk vóór gebruik wassen peptide geladen KaAPC zoals aangegeven in 1,14; Herhaal deze stap minimaal 6x. OPMERKING: Dit is een cruciale stap om ervoor te zorgen dat de vrije peptide heeft to volledig verwijderd vals positieve resultaten te vermijden doden; resterende vrije peptide werd aangetoond dat apoptose in antigeen-specifieke T cel cultures 9 induceren. Om uit te sluiten een oplosbaar peptide effect, lopen supernatant controlemonsters van peptide geladen en gewassen KaAPC (zie 3.8). </li><li> Count kralen met behulp van hemocytometer en label met datum, naam van de peptide en concentratie. OPMERKING: Geladen KaAPC functioneel blijven bij 4 ° C gedurende ten minste een maand. Na een maand, worden opnieuw geladen met hetzelfde peptide maakt KaAPC worden gebruikt voor maximaal een jaar. </li></ol> 3 KaAPC In Vitro Killing Assay <ol><li> Bereid co-cultuur media. Bereid compleet RPMI medium gesupplementeerd met 3% T cel groeifactor (in het lab 6) en 3% donor autoloog plasma. Als donor autoloog plasma beschikbaar is, gebruikt warmte geïnactiveerd humaan AB serum. </li><li> Bereid AnnexinV binding buffer voorbereiding. Los 8.12 g natriumchloride (NaCl) en 0,12 g calcium chloride (CaCl2) in 990 ml DDH 2 O.Add 10 ml 1 M HEPES buffer. </li><li> Genereer humaan antigeen-specifieke T-cellen. (Voor een gedetailleerd protocol zie een eerdere publicatie 7 gebruik te maken van kunstmatige antigeen presenterende cellen (AAPC)). Zorg ervoor dat peptide specificiteit ten minste&gt; 75%, zoals bepaald door tetrameer kleuring. </li><li> Voor elk monster incubeer 2 x 10 5 antigenspecifieke T-cellen / putje (in een 96 putjes ronde bodemplaat) in 200 pl co-kweekmedium bij een 1: 1 verhouding met KaAPC gedurende 48 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Harvest monsters en overbrengen naar een FACS buis; wassen met 1 ml AnnexinV bindingsbuffer gedeactiveerd bij 300 xg gedurende 5 min, gooi supernatant en resuspendeer in 100 ul bindingsbuffer AnnexinV </li><li> Stain monsters met 1 pl AnnexinV FITC en 5 ul 7-AAD voor 10-15 min bij KT, wassen met 1 ml AnnexinV binding buffer; spin down bij 300 g gedurende 5 minuten, supernatant een gooid resuspendeer in 250 ul AnnexinV binding buffer </li><li> Lees monsters direct op flowcytometer. </li><li> Bereid de volgende monsters antigeen-specifieke doding bepalen door KaAPC: voor T-cellen; T-cellen + oplosbaar anti-CD95; T-cellen + gelost KaAPC; T-cellen + niet-verwante peptide geladen KaAPC; T-cellen + verwant peptide geladen KaAPC; T-cellen + supernatant van verwante peptide geladen KaAPC. </li></ol><img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> . Figuur 2 KaAPC killing assay Peptide geladen KaAPC of controlekorrels (HLA-A2-Ig alleen korrels) werden gekweekt gedurende 48 uur bij een 1: 1 verhouding met CMVpp65 specifieke T-cellen (~ 80%), geoogst en vervolgens gekleurd met AnnexinV en propidium jodide (PI) apoptose te bepalen door middel van flowcytometrie (zie protocol paragraaf 3.3-3.7). &quot;verwant&quot; verwijst naar beads geladen met CMVpp65 en &quot;niet-verwant&quot; zijnadvertenties geladen met Mart-1 peptide. Cijfers geven het percentage van levensvatbare T-cellen in het kwadrant linksonder van elk perceel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <ol start="9"><li> Om wirwar-experimenten, genereren antigeen-specifieke T-cellen van twee verschillende specificiteiten. </li><li> Verder antigeen-specifieke depletie-mogelijkheden van KaAPC evalueren een gelijktijdige analyse van de antigeen-specifieke eliminatie van T-cellen in T heterogene celpopulatie. (Voor een gedetailleerd protocol zie Schütz et al. 10). </li></ol>

<ol>
	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CS en MF hebben niets te onthullen. Onder een licentieovereenkomst tussen NexImmune en de Johns Hopkins University, Drs. Schneck en Oelke hebben recht om aandelen van royalty door de universiteit ontvangen op de verkoop van AAPC de producten die in dit artikel wordt beschreven. Ze bezitten ook NexImmune voorraad, die is onderworpen aan bepaalde beperkingen uit hoofde van de Universiteit beleid. Dr Schneck is lid van het bedrijf &quot;s Raad van Bestuur en de Scientific Advisory Board. De voorwaarden van deze regeling worden beheerd door de Johns Hopkins University in overeenstemming met haar beleid van belangenverstrengeling.

De meest cruciale stap in het protocol is de geschikte verhouding van signaal 1 (peptide MHC) signaal 2 (anti-Fas mAb) waarborgen. We hebben intensief titratie-experimenten uitgevoerd om de perfecte verhouding voor signaal 1 en 2 te definiëren; bleek dat minimale verschillen als gevolg van verschillen in de HLA-A2 Ig dimeer of anti-Fas mAb concentraties kan het functioneren van de KaAPC. Aldus is de concentratie van beide signalen moeten altijd gecontroleerd en kwaliteit van beide eiwitten moet regelmatig worden getest ook al werd besteld bij een commerciële bron. Bovendien moeten de concentraties altijd worden bepaald door dezelfde test als verschillende detectie-assays kan resulteren in verschillende concentraties. Functionaliteit van het HLA-A2-Ig kan worden belemmerd door onvolledige opnieuw vouwen en / of inefficiënte peptide geladen. Bovendien kan dimeer moleculen aggregeren in verschillende mate, die van invloed kunnen op de functionele activiteit van het eiwit. Daarom is de actual dimeer nodig voor het genereren van een functioneel en specifieke KaAPC kunnen variëren. Bovendien vonden we dat het geschikt bereik voor het doodinducerend signaal anti-Fas mAb op KaAPC bijzonder krap. In onze handen grotere hoeveelheden 3,64 ug / ml tot niet-specifieke doding van Fas positieve T-cellen tijdens bedragen dan 3,64 ug / ml resulteerde in een dosis-afhankelijk verminderde dodende activiteit. Hoewel deze condities lijken heel strak wordt aandacht deze gegevens resulteren in de vorming van een functioneel en specifieke KaAPC. Terwijl de huidige KaAPC fenotype werkt bij uitputting van geactiveerde antigeen-specifieke T-cellen, eerste experimenten gericht op naïeve of rusten antigeen-specifieke T-cellen geen significante inductie van antigeen-specifieke apoptose als deze populaties Fas expressie verminderde. Daarom zou men voor ogen het toevoegen van een co-stimulerend signaal op de KaAPC om de up-regulatie van Fas op rustende T-cellen om te zetten hen ertoein een doelstelling voor de KaAPC. Hoewel dit mogelijk is alle drie de signalen zal moeten zorgvuldig worden getitreerd om een ​​functionele KaAPC fenotype zorgen. Aanpassen kraal platform een biocompatibele of biologisch afbreekbare matrix KaAPC verbeteren in vivo toepassing. Onlangs, Shen et al. Hebben gemeld succesvolle in vivo gebruik van KaAPC gebruik 5 urn latex beads geconjugeerd anti-Fas (Jo2 kloon) en anti-His / H2-K b -TRP2 11. We hebben kunnen aantonen dat het algemene concept van kunstmatige antigeen-presenterende cellen (AAPC) met succes kan worden overgedragen van micrometer bemeten nm deeltjes 12 en dat de functionaliteit wordt beïnvloed door deeltje geometrie 13 geweest. Aldus, door het variëren van de grootte en / of vorm van toekomstige KaAPC ontwerp zou men kunnen invloed hebben op de in vivo functionaliteit en bio-distributie, die essentieel voor een succesvolle behandeling van orgaanspecifieke autoimmuunziekten zijn. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC overwinnen van de grote tekortkomingen van cellen gebaseerde uitputting strategieën als een makkelijk te gebruiken &quot;van de plank&quot;, tijd en kosten efficiënte aanpak, die onafhankelijk is van de donor conditie en voorbehandeling. KaAPC zijn geen doelstellingen van zichzelf of paracrine doden signalering en niet gevoelig zijn voor cytolytische effector functies van CTL. KaAPC zal de identificatie van de desbetreffende ziekte antigeen nodig hebben en vertrouwen op hun specifieke HLA-type. Terwijl nog talrijke geschikte HLA-A2 beperkte antigenen van type 1 diabetes, zijn GvHD en multiples sclerose geïdentificeerd 2, ontwikkeling van aanvullende HLA klasse I moleculen dimeer en de voortdurende identificatie van nieuwe auto relevante antigenen verder verhogen en verbreden van de toepasbaarheid van KaAPC. Verder kan gedacht worden aan gebruik KaAPC tegen verschillende epitopen van meerdere antigenen tegelijkertijd richten. Samengevat, KaAPC vormen een flexibel platform technologie voortigen-specifieke T-cel depletie. Hun &quot;lego-achtige&quot; karakter maakt de opname van nieuwe signalen zoals aanvullende co-stimulerende of remmende signalen zoals PD1 of TRAIL op diverse matrices, die kunnen verbreden en versterken de daaropvolgende in vitro en in vivo toepassing. We presenteren hier de protocol stap voor stap KaAPC, de eerste parel gebaseerde benadering voor het voorkomen van antigeen-specifieke T-cellen van T cel mengsels met verschillende specificiteiten te genereren. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> Figuur 3 KaAPC elimineren CTL in een antigeen-specifieke wijze PKH26-gemerkte Fas + geactiveerde effector-geheugen CTL en PKH67-gemerkte CMVpp65-specifieke CTL uit dezelfde donor werden gemengd in een 1:. 1 verhouding en co-gekweekt met CMVpp65 KaAPC gedurende 48 uur. Controle kweken werden behandeld met gelost KaAPC of 1 ug / mlvan oplosbare anti-Fas-mAb (kloon CH11). Minimaal verlies van levensvatbare cellen werd bepaald onbehandeld ongesorteerd CTL kweken (T mix). Originele FACS data voor elk CTL bevolking van de T mix worden getoond. Analyse van apoptose werd uitgevoerd zoals eerder door afzonderlijke gating gepubliceerd op beide T-celpopulaties 10. Getallen afgebeeld in de linker kwadrant vertegenwoordigt% van de totale cellen. De illustreren cijfer wordt verkregen ve representatief experiment uit drie onafhankelijke experimenten. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Blood. . Schütz, C. c.s. Killer kunstmatige antigeenpresenterende cellen: een nieuwe strategie voor specifieke T-cellen te verwijderen Blood.. 2008; 111, 3546-52. Copyright van de American Society of Hematology. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

In de afgelopen twee decennia veel vooruitgang geboekt in het begrijpen van de pathogene mechanismen van auto-immuunziekten. Echter, de meest voorkomende behandelingen nog steeds afhankelijk corticosteroïden en immunosuppressiva zoals purine analogen, alkyleringsmiddelen en calcineurineremmers 1. Het gebruik van dergelijke geneesmiddelen is sterk verbeterd de prognose voor patiënten, maar de behandeling geeft geen genezing van de onderliggende immunologische defect. Veel patiënten kwetsbaar voor infecties en de ontwikkeling van kanker. Vandaar het uiteindelijke doel voor de behandeling van T-cel gemedieerde auto-immuunziekten en transplantaatafstoting is specifiek te richten enige ziekte veroorzaken T-cellen terwijl tegelijkertijd, waardoor het resterende immuunsysteem intacte en bevoegd immunologische aandoeningen te bestrijden. Gebruik makend van antigenpresenterende cellen (APC) als behandeling van perifere T-cel responsen onderdrukt werd eerst beschreven al1970 door verscheidene groepen. Sindsdien hebben vele cellen gebaseerde benaderingen ontwikkeld (beoordeeld in Schütz et al. 2). Strategieën door middel van-FasL uiten killer-APC als immunoregulatoire cellen toonde veelbelovende resultaten wijzen op therapeutische mogelijkheden voor de behandeling van auto-immuniteit, allograftafstoting en chronische infecties. Er zijn echter belangrijke beperkingen met behulp van strategieën FasL Killer-APC die uiteindelijk beperkt de klinische toepasbaarheid; (I) productie of isolatie van APC tijd, arbeid en kostenintensief (ii) patiënten cytopenie gevolg van immunosuppressie bieden beperkte hoeveelheden en kwaliteit van cellen (iii) coating of transductie van APC apoptose inducerende signalen zoals FasL resultaten in sterk variabele fenotypes en (iv) Killer-APC zijn gevoelig voor effectorfuncties van T-cellen dus hun therapeutisch potentieel cytotoxische verminderen. Daarom is het moeilijk om een ​​gedefinieerde reproduceerbare Killer-APC feno garanderensoort die kan worden gebruikt voor antigeen-specifieke modulatie van T-cel responsen in vivo. Op basis van onze eerdere werk met FasL expressie Killer-APC 3-5 en kunstmatige antigeenpresenterende cellen (AAPC) 6,7 ontwikkelden we een kraal benadering (KaAPC) voor antigeen-specifieke remming of eliminatie van autoreactieve T-cellen in vitro. KaAPC bestaan ​​uit een HLA-A2-Ig dimeer (signaal 1) en een anti-Fas mAb (apoptose inducerende signaal) covalent geïmmobiliseerd op een oppervlak van een 4,5 urn paramagnetische latex bolletje. Ze afbrekende antigeen-specifieke T-cellen in een Fas / FasL gemedieerde wijze met T celkweken meerdere specificiteiten in een antigeen-specifieke wijze en onafhankelijk van de activering geïnduceerde celdood (AICD) pathway. Dosisafhankelijke apoptose in doelwit T-cellen snel geïnduceerd reeds na 30 min 8. KaAPC kan eenvoudig worden gegenereerd in een gecontroleerde manier te zorgen voor een bepaald uit de kast phenotype en overwinnen meeste van de tekortkomingen van celgebaseerde depletie strategieën. Bijgevolg KaAPC tonen groot potentieel voor de behandeling van T-cel gemedieerde auto-immuunziekten en transplantaatafstoting, bevorderen het gebied van T cel specifieke behandelingsstrategieën.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

Voor behandeling van T-cel gemedieerde auto-immuunziekten berust grotendeels over strategieën globale immunosuppressie, die op lange termijn gaat gepaard met nadelige bijwerkingen zoals een verminderd vermogen om infecties en maligniteiten regelen. Daarom moeten nieuwe benaderingen worden ontwikkeld dat alleen de ziekte mediëren doelcellen en laat de resterende immuunsysteem intact. In het afgelopen decennium verschillende celtherapie strategieën moduleren T cel gemedieerde immuun responsen ontwikkeld. De meeste van deze benaderingen afhankelijk tolerantie inducerend antigeen presenterende cellen (APC). Echter, naast het technisch moeilijk en omslachtig, zoals celgebaseerde benaderingen zijn zeer gevoelig voor cytotoxische T-cel responsen, die hun therapeutische capaciteit beperkt. Hier presenteren we een protocol voor het genereren van niet-cellulaire killer kunstmatige antigeenpresenterende cellen (KaAPC), waardoor voor de uitputting van pathologische T-cellen terwijl de reresterende immuunsysteem onaangeroerd en functioneel. KaAPC een alternatieve oplossing voor cellulaire immunotherapie die potentieel voor het behandelen van auto-immuunziekten en allotransplantaatafstotingen door het reguleren van ongewenste T-cel responsen in een antigeen-specifieke wijze heeft.

Het gebruik van deze protocollen zijn gedefinieerd genereren van een KaAPC fenotype dat HLA-A2-Ig (signaal 1) en anti-Fas mAb (apoptose signaal) tegelijkertijd, die in vergelijking met cellen benaderingen niet veranderd door coating geeft of transductie efficacies en kan gemakkelijk gemoduleerd tijdens de productie (figuur 1). Bovendien KaAPC, zijn niet gevoelig voor cytotoxische effectorfuncties van T-cellen en hun functionaliteit niet afhankelijk van de kwaliteit van autologe antigeen presenterende cellen voor en na in vitro manipulatie. KaAPC kunnen aantasten van antigeen-specifieke T-cellen in vitro beladen met verwante peptide, terwijl niet-verwante geladen KaAPC niet T-cellen (figuur 2) afbreken. Daarom KaAPC induceren T cel apoptose in een antigeen-specifieke wijze. Vervolgens gebruikten we KaAPC voor selectieve depletie van antigeen-specifieke T-cellen uit een mengsel van verschillende T-cel specificities, waaruit blijkt dat slechts minimale cytotoxiciteit lekte in buur T-cellen (figuur 3). Aldus KaAPC vormen een uitstekende hulpmiddel voor in vitro antigeen-specifieke depletie van humane geactiveerde antigeen-specifieke T-cellen met mogelijke klinische toepasbaarheid voor de behandeling van autoimmuunziekten en allotransplantaatafstotingen.

Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Richtlijnen gepresenteerd voor het genereren van killer kunstmatige antigeenpresenterende cellen, KaAPC, een efficiënt hulpmiddel voor in vitro depletie van humane antigeen-specifieke T-cellen en een alternatieve oplossing voor cellulaire immunotherapie voor de behandeling van T-cel gemedieerde auto-immuunziekten in een antigen specifieke manier, zonder afbreuk te doen aan de resterende immuunsysteem.

Killer Artificial antigeen presenterende cellen (KaAPC) voor Efficient<em&gt; In Vitro</em&gt; Uitputting van Human Antigeen-specifieke T-cellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specifieke In Vivo Killing Assay met behulp van CFSE Labeled doelcellen

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial antigeen presenterende cellen voor efficiënte Ex vivo Uitbreiding van de Mens CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Kunstmatige antigeen presenterende cel (AAPC) gemedieerde activering en uitbreiding van Natural Killer T-cellen

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinische toepassing van<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; En Kunstmatige antigeen presenterende cellen genetisch te wijzigen T-cellen uit perifeer en navelstrengbloed

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Ontwikkeling van een antigeen-gedreven Colitis Model naar Presentatie van antigenen te bestuderen door antigen presenterende cellen om T-cellen

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating<em&gt; De Novo</em&gt; Antigeen-specifieke menselijke T-cel receptoren door Retrovirale Transductie van Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Ontwikkeling van stamcel-afgeleide Antigeen-specifieke regulatoire T-cellen tegen auto-immuniteit

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detectie en Verrijking van zeldzame antigeen-specifieke B-cellen voor analyse van fenotype en functie

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay voor detectie van antigeen-specifieke T-cel cytolytische functie met behulp van een vaccinatie-Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...