Name: killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells
Uploaded: 2014-08-11T19:00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) et KFO 146 (MF), le ministère de la Défense DOD subvention PC 040972 (MO) et l&#39;Institut national de la santé accorde RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)

1 Production de HLA-A2-Ig Based KaAPC <ol><li> Préparer le tampon de borate stérile. Ajouter une solution 0,1 M d&#39;acide borique dans l&#39;eau et ajuster le pH à 7,0. Filtre stérile (0,22 um) tampon et conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer le tampon de lavage des billes stérile. Utiliser une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium et magnésium. Ajouter sérum AB humain pour 3% de concentration finale. Ajouter de l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 2 mM de concentration finale. Ajouter de l&#39;azoture de sodium (NaN 3) pour une concentration finale de 0,01%. Filtre stérile (0,22 um) tampon et conserver à 4 ° C. </li><li> Transférer 250 ul de billes époxy (environ 100 x 10 6 billes) en stock dans un stérile, bouchon à vis du flacon de verre. </li><li> Ajouter 250 ul de tampon borate. </li><li> Mettez flacon de verre sur un aimant et laissez perles adhèrent pendant 2 min; tampon aspirer et enlever flacon en verre de l&#39;aimant. </li><li> Lavez perles une fois avec 1 ml de tampon borate. </li><li> Remettre les billes dans 550 pl de 0,018 pg/ Ml HLA-A2-Ig et 3,64 pg / ml d&#39;anticorps anti-CD95 humain mAb (clone CH11) et mélanger doucement en secouant. (S&#39;il vous plaît voir la section de discussion pour plus d&#39;informations.) </li><li> Incuber flacon en verre à une extrémité de la coiffe sur l&#39;extrémité, à 4 ° C pendant 24 heures. </li><li> Isoler perles à 300 g pendant 2 min. </li><li> Placez flacon de verre sur un aimant pendant 2 minutes et aspirer la «solution de chargement KaAPC&quot;; enlever flacon en verre de l&#39;aimant, ajouter 1 ml de tampon de lavage de perles et remettre soigneusement en secouant. </li><li> Répétez l&#39;étape deux fois 1,10. </li><li> Incuber flacon en verre sur un rotateur à 4 ° C pendant 24 h dans 1 ml de tampon de lavage des billes. A ce stade, tous les sites de liaison de protéines résiduel sera bloqué par du sérum AB humain contenu dans le tampon de lavage des billes. </li><li> Isoler perles à 300 g pendant 2 min. </li><li> Lieu flacon en verre sur un aimant pendant 2 minutes et aspirer tampon de lavage de perles; enlever flacon en verre à partir de l&#39;aimant et de remplacer la solution avec 1 ml de PBS. </li></ol> 2 Contrôle de la qualité, le peptide en cours de chargement, Wincinération, stockage, et la stabilité de KaAPC <ol><li> Transférer 1,5 x 10 5 KaAPC dans un tube FACS et laver avec 1 ml FACS tampon de lavage. </li><li> Remettre les billes dans 100 pl de tampon de lavage FACS et ajouter 1 pl d&#39;anti-IgG1 de souris PE (pour la détection de la partie Fc de la molécule HLA-A2-Ig) et 1 pi d&#39;anticorps anti-IgM de souris FITC (clone R6-60.2, pour la détection de l&#39;anticorps monoclonal anti-CD95 humain). </li><li> Incuber pendant 15 min à 4 ° C, laver avec 1 ml FACS tampon de lavage, et remettre en suspension dans 250 ul de tampon de lavage FACS et lire coloration par cytométrie en flux. </li></ol><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1 QC tache d&#39;un lot KaAPC fait comme indiqué dans la section de protocole. Coloration a été réalisée comme décrit dans la section 2 du protocole HLA-A2-Ig a été détectée en utilisant un anticorps anti-souris-IgG1 mAb PE, alors que l&#39;anti-CD95 humain, (anti-Fas) a été détectée avec un anticorps anti-souris-FITC IgM mAb (voir protocole en soiction 2.2) (ligne bleue). Graphiques noirs pleins représentent billes vides colorées avec un anticorps anti-souris-PE IgG1 ou mAb anti-souris-FITC IgM mAb, respectivement. Numéros dans le coin supérieur droit indiquent l&#39;intensité de fluorescence moyenne (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="4"><li> Pour peptide transfert de charge 20 x 10 6 KaAPC dans un nouveau flacon de verre stérile, placer sur un aimant pendant 2 minutes, aspirer PBS et remettre les billes dans 500 ul de PBS frais de 5 ug de peptide (Gardez à l&#39;esprit, les peptides que HLA-A2 restreint sera lier sur le dimère!). </li><li> Magasin chargé KaAPC à 4 ° C jusqu&#39;à l&#39;utilisation, pendant au moins 3 jours pour donner suffisamment de peptide chargement sur le dimère HLA-A2-Ig. </li><li> Immédiatement avant utilisation, lavez le peptide chargé KaAPC comme indiqué dans 1.14; répétez cette étape au moins 6x. NOTE: Il s&#39;agit d&#39;une étape cruciale pour assurer que le peptide libre a to être complètement supprimé pour éviter les faux résultats positifs de mise à mort; peptide libre résiduel a été montré pour induire l&#39;apoptose dans les cultures de cellules T antigène-spécifiques 9. Pour exclure un effet de peptide soluble, exécuter les échantillons de contrôle surnageant de peptide chargé et lavé KaAPC (voir 3.8). </li><li> Comptez perles en utilisant hémocytomètre et étiqueter avec la date, le nom de peptide et de la concentration. REMARQUE: Loaded KaAPC restent fonctionnelles à 4 ° C pendant au moins un mois. Après un mois, le rechargement avec le même peptide permet KaAPC à être utilisé pendant un an. </li></ol> 3. KaAPC Essai in vitro de tuer <ol><li> Préparez le support de co-culture. Préparer un milieu RPMI complet additionné de 3% de T facteur de croissance de cellules (fabriqué au laboratoire 6) donneur et 3% de plasma autologue. Si donneur de plasma autologue n&#39;est pas disponible, utiliser du sérum humain AB inactivé par la chaleur. </li><li> Préparer la liaison préparation tampon AnnexinV. Dissoudre 8,12 g de chlorure de sodium (NaCl) et de 0,12 g calcchlorure de ium (CaCl 2) dans 990 ml ddH 2 O.Add 10 ml de tampon HEPES 1M. </li><li> Générer des cellules T spécifiques de l&#39;antigène humain. (Pour un protocole détaillé s&#39;il vous plaît voir une publication précédente 7 en utilisant des cellules présentatrices de l&#39;antigène artificielles (VAMP)). Assurez-vous que la spécificité de peptide est au moins&gt; 75% tel que déterminé par tétramère coloration. </li><li> Pour chaque échantillon, incuber 2 x 10 5 cellules T spécifiques de l&#39;antigène / puits (dans une plaque à 96 puits à fond rond) dans 200 ul de milieu de co-culture à un ratio de 1: 1 avec KaAPC pendant 48 heures dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Échantillons de récolte et transférer dans un tube FACS; laver avec 1 ml AnnexinV tampon de liaison, centrifuger à 300 g pendant 5 min, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 100 pi de tampon de liaison AnnexinV </li><li> échantillons de taches avec 1 pi AnnexinV FITC et 5 pi 7-AAD pendant 10-15 min à température ambiante, laver avec 1 ml de tampon de liaison AnnexinV; centrifuger à 300 g pendant 5 min, éliminer le surnageant uned remettre en suspension dans un tampon de liaison 250 pi AnnexinV </li><li> Lire immédiatement les échantillons sur cytomètre de flux. </li><li> Préparer les échantillons suivants pour déterminer la destruction spécifique de l&#39;antigène par KaAPC: cellules T seulement; Lymphocytes T anti-CD95 + soluble; Cellules T + déchargés KaAPC; Cellules T + peptide non apparenté chargé KaAPC; Cellules T + peptide apparenté chargé KaAPC; T + surnageant de cellules peptide apparenté KaAPC chargé. </li></ol><img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> . Figure 2 KaAPC dosage tuant peptide chargé KaAPC ou des billes de commande (HLA-A2-Ig seulement perles) ont été cultivées pendant 48 heures à un rapport de 1: 1 avec des cellules CMVpp65 spécifiques de T (~ 80%), récolté et ensuite coloré avec du AnnexinV et l&#39;iodure de propidium (PI) pour déterminer l&#39;apoptose par cytométrie de flux (voir la section 3.3 à 3.7 du protocole). &quot;apparenté&quot; se réfère à des billes chargées de CMVpp65 et «non apparentée» pour êtreannonces chargés de Mart-1 peptide. Les chiffres indiquent le pourcentage de cellules T viables dans le quadrant inférieur gauche de chaque parcelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="9"><li> Pour effectuer les expériences s&#39;entrecroisent-, générer des cellules T spécifiques de l&#39;antigène de deux spécificités différentes. </li><li> En outre évaluer les capacités d&#39;appauvrissement spécifique de l&#39;antigène de KaAPC avec une analyse simultanée de l&#39;élimination spécifique d&#39;un antigène des cellules T dans la population hétérogène de cellules T. (Pour un protocole détaillé s&#39;il vous plaît voir Schütz et al. 10). </li></ol>

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	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. 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CS et MF n&#39;ont rien à divulguer. En vertu d&#39;un accord de licence entre NexImmune et de l&#39;Université Johns Hopkins, les Drs. Schneck et Oelke ont droit à des actions de la royauté reçues par l&#39;Université sur les ventes de produits AAPC décrites dans cet article. Ils possèdent également NexImmune actions, qui est soumise à certaines restrictions au titre de la politique de l&#39;Université. Dr Schneck est un membre de la société »du Conseil d&#39;administration et du conseil consultatif scientifique. Les termes de cet arrangement sont gérés par l&#39;Université Johns Hopkins, conformément à son conflit d&#39;intérêts politiques.

L&#39;étape la plus critique dans le protocole est d&#39;assurer le rapport approprié de signaux 1 (peptide CMH) et le signal 2 (anti-Fas mAb). Nous avons effectué des expériences de titrage intensifs à définir le rapport idéal pour le signal 1 et 2; il est devenu évident que des variations minimes en raison de différences dans le dimère HLA-A2 Ig ou concentrations des anti-Fas mAb peuvent interférer avec le fonctionnement du KaAPC. Ainsi, la concentration des deux signaux doit toujours être vérifiée et la qualité des deux protéines doit être testé fréquemment, même si il est ordonné à partir d&#39;une source commerciale. En outre, les concentrations doivent toujours être déterminées par le même essai que différents tests de détection peut résulter en des concentrations différentes. La fonctionnalité de la molécule HLA-A2-Ig peut également être altérée en raison de repliement incomplètes et / ou inefficace peptide chargement. En outre molécules dimères peuvent agréger à des degrés divers, ce qui pourrait avoir un impact sur l&#39;activité fonctionnelle de la protéine. Par conséquent, l&#39;actual quantité de dimère nécessaire pour la génération d&#39;un KaAPC fonctionnel spécifique et peut varier. En outre, nous avons constaté que la gamme idéale pour la mort de signal induisant anti-Fas mAb sur KaAPC est extrêmement serré. Dans nos mains quantités supérieures 3,64 pg / ml conduit à la destruction non spécifique des cellules T Fas positif alors que les montants ci-dessous 3,64 pg / ml ont abouti à une activité de destruction réduit la dose en fonction. Bien que ces conditions semblent assez serré, attention à ces détails se traduira par la création d&#39;un KaAPC fonctionnelle et spécifique. Bien que le phénotype courant KaAPC est fonctionnel pour la déplétion des cellules T activées spécifiques de l&#39;antigène, des expériences initiales ciblant les cellules T spécifiques de l&#39;antigène ou naïves au repos démontré aucune induction significative de l&#39;apoptose spécifique de l&#39;antigène que ces populations ont réduit l&#39;expression de Fas. Par conséquent, on pourrait envisager l&#39;ajout d&#39;un signal de co-stimulation sur le KaAPC pour induire la régulation à la hausse de Fas sur cellules T au repos pour faire tourner lesdans une cible pour la KaAPC. Même si cela est possible les trois signaux devront être titré soigneusement pour assurer un phénotype fonctionnel KaAPC. Réglage de la plate-forme de bourrelet à une matrice biocompatible ou biodégradable améliorera KaAPC en application vivo. Récemment, Shen et al. Ont rapporté le succès de l&#39;utilisation in vivo de KaAPC utilisant des billes 5 um de latex conjuguées à l&#39;anti-Fas (clone Jo2) et anti-His / H2-K b -TRP2 11. Nous avons pu montrer que le concept général de cellules présentatrices de l&#39;antigène artificielles (AAPC) peut être transféré avec succès à partir um dimensionné pour des particules de taille nm 12 et que la fonctionnalité est influencé par la géométrie des particules 13. Ainsi, en faisant varier la taille et / ou la forme de la future KaAPC designs on peut être capable d&#39;avoir un impact sur ​​la fonctionnalité in vivo et la bio-distribution, qui pourrait être essentiel pour la réussite du traitement de maladies auto-immunes spécifiques d&#39;organes. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC surmonter les principales faiblesses des stratégies d&#39;épuisement à base de cellules comme un outil facile à utiliser &quot;off the shelf&quot;, le temps et le coût approche efficace qui est indépendante de l&#39;état des bailleurs de fonds et de pré-traitement. KaAPC ne sont pas des cibles de soi ou de signalisation de meurtre paracrine et pas sensible aux fonctions effectrices cytolytiques de CTL. KaAPC nécessitera l&#39;identification de l&#39;antigène de la maladie concernée et compter sur leur type HLA spécifique. Bien qu&#39;actuellement de nombreux antigènes HLA-A2 restreint appropriés pour le diabète de type 1, GvHD et multiples sclérose ont été identifiés 2, le développement de plus HLA de classe I dimère molécules ainsi que l&#39;identification permanente de nouveaux antigènes pertinents auto-immunes va encore accroître et d&#39;élargir l&#39;applicabilité de KaAPC. En outre on pourrait envisager d&#39;utiliser KaAPC réalisé à différents épitopes de cibler des antigènes multiples simultanément. En résumé, KaAPC représentent une technologie de plate-forme flexible pour unespécifiques à Tigen de déplétion des lymphocytes T. Leur nature &quot;lego-like&quot; permet l&#39;inclusion de nouveaux signaux tels que co-stimulation ou d&#39;inhibition supplémentaires tels que PD1 ou TRAIL sur différentes matrices, ce qui pourrait élargir et d&#39;améliorer leur ultérieure in vitro et in vivo applicabilité. Nous présentons ici le protocole étape par étape pour générer KaAPC, l&#39;approche basée sur le premier bourrelet pour l&#39;élimination des cellules T spécifiques de l&#39;antigène à partir de mélanges de cellules T avec des spécificités différentes. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3 KaAPC éliminer CTL d&#39;une façon spécifique à l&#39;antigène marqué PKH26 activé Fas + CTL effecteurs mémoire et PKH67 marqué CMVpp65 CTL spécifique du même donneur ont été mélangés à un rapport 1:. Rapport 1 et co-cultivées avec des CMVpp65 KaAPC pendant 48 h. Des cultures témoins ont été traitées avec KaAPC déchargé, ou 1 ug / mldes anti-Fas soluble-mAb (clone CH11). Une perte minimale de cellules viables a été déterminée dans des cultures de CTL mixtes non traités (T mix). Données de FACS originales pour chaque population de CTL du mélange T sont présentés. Analyse de l&#39;apoptose a été effectuée comme précédemment publié par déclenchement séparé des deux populations de cellules T 10. Numbers représentées dans les quadrants supérieur gauche représente% du nombre total de cellules. La figure illustrant est dérivé d&#39;une expérience représentative de trois expériences indépendantes. Cette recherche a été publié à l&#39;origine dans le sang. . Schütz, C. et al tueur Les cellules présentatrices de l&#39;antigène artificielles: une nouvelle stratégie pour supprimer les cellules T spécifiques de sang.. 2008; 111, 3546-52. Droit d&#39;auteur de l&#39;American Society of Hematology. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Au cours des deux dernières décennies, beaucoup de progrès ont été réalisés dans la compréhension des mécanismes pathogènes de maladies auto-immunes. Cependant, les traitements les plus courants comptent encore sur les corticostéroïdes, ainsi que des médicaments immunosuppresseurs tels que les analogues de la purine, des agents alkylants et des inhibiteurs de la calcineurine 1. L&#39;utilisation de ces médicaments a considérablement amélioré le pronostic des patients, mais le traitement ne fournit pas un remède du dysfonctionnement immunologique sous-jacente. En outre, les patients deviennent vulnérables aux infections et au développement d&#39;un cancer. Par conséquent, le but ultime pour le traitement de maladies auto-immunes de cellules T à médiation et le rejet d&#39;allogreffe est de cibler spécifiquement seulement les cellules T provoquant une maladie alors que, en même temps, laissant le système immunitaire restant intacte et compétente pour lutter contre les troubles immunologiques. En utilisant des cellules présentatrices d&#39;antigène (APC) comme un traitement pour supprimer les réponses de cellules T périphériques a été décrite pour la première dèsles années 1970 par plusieurs groupes. Depuis de nombreuses approches à base de cellules ont été développés (revue dans Schütz et al. 2). Stratégies utilisant FasL exprimant killer-APC que les cellules immunomodulatrices ont montré des résultats prometteurs indiquant un potentiel thérapeutique pour le traitement de l&#39;auto-immunité, le rejet d&#39;allogreffe et les infections chroniques. Cependant, il ya des limites importantes des stratégies utilisant FasL Killer-APC qui ont finalement limité leur applicabilité clinique; (I) la production ou l&#39;isolement d&#39;APC est temps, du travail et coûteux (ii) des patients atteints de cytopénie dû à une immunosuppression fournissent des quantités et de la qualité des cellules limitées (iii) le revêtement ou la transduction des APC avec les signaux induisant l&#39;apoptose tels que les résultats de FasL dans très phénotypes variables et (iv) Killer-APC sont sensibles à des fonctions effectrices cytotoxiques de lymphocytes T en réduisant par conséquent leur potentiel thérapeutique. Par conséquent, il est difficile de garantir une reproductibilité phéno Killer-APC définitype qui peut être utilisé pour la modulation spécifique de l&#39;antigène de réponses des lymphocytes T in vivo. Sur la base de nos travaux précédents avec FasL exprimer Killer-APC 3-5 et les cellules présentatrices de l&#39;antigène artificielles (AAPC) 6,7 nous avons développé une approche basée perles (KaAPC) pour l&#39;inhibition ou l&#39;élimination spécifique de l&#39;antigène des cellules T auto-réactifs dans vitro. KaAPC se composent d&#39;un dimère HLA-A2-Ig (signal 1) et un mAb anti-Fas (signal inducteur de l&#39;apoptose) immobilisé de manière covalente sur une surface d&#39;une perle paramagnétique 4,5 um de latex. Ils épuiser les cellules T spécifiques de l&#39;antigène de manière à médiation par Fas / FasL à partir de cultures de multiples spécificités de lymphocytes T de façon spécifique à l&#39;antigène et indépendant de l&#39;activation induite par la mort des cellules (AICD) voie. Dose apoptose dépendante dans les cellules T cibles est rapidement induite déjà après 30 min 8. KaAPC peut être facilement généré de manière contrôlée assurant un défini sur l&#39;étagère phenotype et de surmonter la plupart des lacunes des stratégies d&#39;épuisement à base de cellules. Par conséquent, KaAPC afficher un grand potentiel pour le traitement de maladies auto-immunes de lymphocytes T médiation et le rejet d&#39;allogreffe, faire progresser le domaine des stratégies de traitement de lymphocytes T spécifiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

Le traitement actuel de cellules T immunes médiées repose essentiellement sur les stratégies d&#39;immunosuppression globale, ce qui, à long terme, est accompagné par des effets secondaires indésirables comme une diminution de la capacité de lutter contre les infections ou les tumeurs malignes. Par conséquent, de nouvelles approches doivent être développées que les cellules cibles que la maladie de médiation et de laisser le système immunitaire reste intact. Au cours de la dernière décennie, une variété de stratégies d&#39;immunothérapie à base de cellules de moduler T à médiation cellulaire réponses immunitaires ont été développés. La plupart de ces approches reposent sur des cellules présentatrices d&#39;antigènes induisant une tolérance (APC). Cependant, en plus d&#39;être techniquement difficile et encombrant, de telles approches à base de cellules sont très sensibles aux réponses des cellules T cytotoxiques, ce qui limite leur capacité thérapeutique. Ici, nous présentons un protocole pour la génération de cellules présentatrices de l&#39;antigène artificielles tueuses non cellulaire (KaAPC), ce qui permet la déplétion des cellules T pathologiques tout en laissant la resystème immunitaire restant intact et fonctionnel. KaAPC est une solution alternative à l&#39;immunothérapie cellulaire qui a un potentiel pour le traitement de maladies auto-immunes et les rejets d&#39;allogreffes par la régulation des réponses des cellules T indésirables d&#39;une manière spécifique de l&#39;antigène.

Les caractéristiques de ce protocole comprennent la génération définie d&#39;un phénotype KaAPC qui affiche HLA-A2-Ig (signal 1) et anti-Fas mAb (signal d&#39;apoptose) en même temps, ce qui par rapport à des approches à base de cellules n&#39;est pas modifiée par revêtement ou des efficacités de transduction et peut être facilement modulés lors de la fabrication (figure 1). En outre, KaAPC, ne sont pas sensibles à des fonctions effectrices cytotoxiques des cellules T et leur fonction ne dépend pas de la qualité de cellules présentatrices d&#39;antigènes autologues avant et après la manipulation in vitro. KaAPC sont capables d&#39;épuiser les cellules T spécifiques de l&#39;antigène in vitro, lorsqu&#39;elles sont chargées avec le peptide apparenté, tandis que les non-apparenté chargé KaAPC sera pas épuiser les cellules T (figure 2). Par conséquent, KaAPC induire l&#39;apoptose des cellules T d&#39;une manière spécifique de l&#39;antigène. Par la suite, nous avons utilisé pour KaAPC déplétion sélective des cellules T spécifiques de l&#39;antigène à partir d&#39;un mélange de différents spe des lymphocytes Tcificities, démontrant que seule la cytotoxicité minimale fuyait dans les cellules voisines T (figure 3). Ainsi, KaAPC représentent un outil exquise pour déplétion in vitro spécifique d&#39;un antigène des cellules T spécifiques de l&#39;antigène humains activés par application clinique potentielle pour le traitement de maladies auto-immunes et les rejets d&#39;allogreffes.

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Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Lignes directrices sont présentées pour la production de l&#39;antigène artificiel de tueur des cellules présentatrices, KaAPC, un outil efficace pour la déplétion in vitro de lymphocytes T spécifiques de l&#39;antigène humain et une solution alternative à l&#39;immunothérapie cellulaire pour le traitement de T maladies auto-immunes à médiation cellulaire à un antigène de façon spécifique sans compromettre le système immunitaire reste.

Tueur antigène artificielle cellules présentatrices (KaAPC) d&#39;utilisation efficace<em&gt; In Vitro</em&gt; L&#39;épuisement des lymphocytes T humains spécifiques de l&#39;antigène

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Specific Antigen In Vivo</emTuer Assay> en utilisant des cellules CFSE cible marquée

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Recherche

Immunologie et infection

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

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HLA-Ig des cellules à base Antigène artificielle Présentation d&#39;Efficient Ex vivo Extension du CTL humaines

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Présentatrice d&#39;antigène artificielle d&#39;activation à médiation cellulaire (AAPC) et l&#39;expansion des cellules T tueuses naturelles

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Application clinique de<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Et artificielle cellules présentatrices d&#39;antigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Développement d&#39;un modèle Colite antigène conduit à étudier la présentation des antigènes par les cellules présentatrices d&#39;antigènes aux cellules T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Générateur<em&gt; De Novo</em&gt; Spécifiques de l&#39;antigène T Human cellulaires Receptors par rétrovirale transduction de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Développement de cellules souches dérivées de cellules T régulatrices spécifiques de l&#39;antigène contre Autoimmunité

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Détection et enrichissement des rares cellules B spécifiques de l&#39;antigène pour l&#39;analyse des Phénotype et fonction

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test pour la détection de cellules T spécifiques de l’antigène fonction cytolytique en utilisant un modèle de Vaccination

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...