Name: killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells
Uploaded: 2014-08-11T19:00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמני (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) וKFO 146 (MF), מחלקת DOD של מחשב מענק הגנה 040,972 (MO) והמכון הלאומי לבריאות מעניקים RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)

.1 ייצור של HLA-A2-איג בהתבסס KaAPC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ borate סטרילי. בצע פתרון 0.1 M של חומצה בור במים ולהתאים את רמת החומציות ל7.0. סינון סטרילי (0.22 מיקרומטר) חיץ ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לשטוף חיץ חרוז סטרילי. השתמש בופר פוספט (PBS) ללא מגנזיום וסידן. להוסיף סרום AB אנושי ל3% ריכוז סופי. הוספת חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ל2 מ&quot;מ ריכוז סופי. להוסיף אזיד הנתרן (NaN 3) ל0.01% ריכוז סופי. סינון סטרילי (0.22 מיקרומטר) חיץ ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 250 μl של חרוזים אפוקסי (כ -100 x 10 6 חרוזים) ממניות לסטרילי, לדפוק בקבוקון זכוכית עליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של חיץ borate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים בקבוקון זכוכית על מגנט ולתת חרוזים לדבוק למשך 2 דקות; לשאוב חיץ ולהסיר בקבוקון זכוכית ממגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים פעם אחת עם 1 מ&quot;ל חיץ borate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend ל550 μl של 0.018 מיקרוגרם/ מ&quot;ל ​​HLA-A2 איג ו3.64 מיקרוגרם / CD95 מב (CH11 שיבוט) מ&quot;ל אנטי אנושי ולערבב בעדינות על ידי רועד. (אנא ראה סעיף דיון לקבלת מידע נוסף.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בקבוקון זכוכית בסופו של דבר מסובב מעל הסוף, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים XG 300 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בקבוקון זכוכית על מגנט במשך 2 דקות ולשאוב &quot;פתרון טעינת KaAPC&quot;; להסיר בקבוקון זכוכית ממגנט, להוסיף 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף חרוז וresuspend בקפידה על ידי רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.10 פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בקבוקון זכוכית על הכתף על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות בחיץ לשטוף חרוז 1 מ&quot;ל. בשלב זה, כל החלבון שיורית אתרי קישור יהיה חסום על ידי סרום AB האנושי הכלול במאגר לשטוף חרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים XG 300 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכוכית מקום בקבוקון על מגנט במשך 2 דקות ולשטוף חיץ חרוז לשאוב; להסיר בקבוקון זכוכית מהמגנט ולהחליף פתרון עם 1 מ&quot;ל של PBS. </li></ol> .2 טוען בקרת האיכות, פפטיד, Washing, חפצים, ויציבות של KaAPC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 1.5 x 10 5 KaAPC לתוך צינור FACS ולשטוף עם 1 מ&quot;ל FACS לשטוף חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים גלולים ב100 μl FACS הצפה לשטוף ולהוסיף 1 μl של אנטי עכבר IgG1 PE (לצורך זיהוי של חלק Fc של HLA-A2 איג) וμl 1 של אנטי העכבר IgM FITC (שיבוט R6-60.2, לגילוי של מב CD95 אנטי האנושי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 15 דקות ב 4 ° C, לשטוף עם 1 מ&quot;ל FACS לשטוף חיץ, וגלול ב250 FACS μl לשטוף הצפה ולקרוא הכתמה על ידי cytometry זרימה. </li></ol><img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 כתם QC של אצווה KaAPC עשה כאמור בסעיף בפרוטוקול. מכתים בוצע כפי שתואר בסעיף 2 פרוטוקול HLA-A2 איג זוהה באמצעות אנטי עכבר IgG1 PE מב, ואילו אנטי אנושי-CD95 (Anti-Fas) זוהה עם אנטי עכבר IgM FITC מב (ראה פרוטוקול section 2.2) (קו כחול). גרפים שחורים מילאו לייצג חרוזים ריקים מוכתמים אנטי עכבר IgG1 PE מב או אנטי עכבר IgM FITC מב, בהתאמה. מספרים בפינה הימנית העליונה מצביעים על עוצמת הניאון הממוצעת (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעברת טעינת פפטיד 20 x 10 6 KaAPC לתוך בקבוקון זכוכית סטרילית חדש, למקם על גבי מגנט במשך 2 דקות, חרוזים לשאוב PBS והגלול ל500 PBS μl טרי עם 5 פפטיד מיקרוגרם (זכרו, פפטידים HLA-A2 רק מוגבלים יהיו להיקשר אל דימר!). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות עמוסה KaAPC ב 4 ° C עד שימוש, לפחות 3 ימים כדי לאפשר טעינת פפטיד מספיק על דימר HLA-A2 איג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לפני השימוש, לשטוף את הפפטיד הטעון KaAPC כפי שצוין ב1.14; חזור על שלב זה לפחות 6x. הערה: מדוברת בצעד חיוני כדי להבטיח כי יש פפטיד החופשי to להסיר לחלוטין, כדי למנוע תוצאות הרג חיוביות כוזבות; פפטיד החופשי השיורי הוכח לגרום למות תאים מתוכנת בתרביות תאי T אנטיגן הספציפיים 9. כדי לשלול השפעת פפטיד מסיסה, להפעיל דגימות שליטת supernatant של הפפטיד הטעון ורחץ KaAPC (ראה 3.8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור החרוזים באמצעות hemocytometer ותווית עם תאריך, שמו של פפטיד וריכוז. הערה: טעון KaAPC להישאר פונקציונלי ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד לפחות. לאחר חודש אחד, מחדש טעינה עם אותו פפטיד מאפשרת KaAPC כדי להיות מנוצלת לעד שנה. </li></ol> Assay הריגת 3 KaAPC במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת תרבות משותפת. להכין מדיום RPMI מלא בתוספת 3% גורם גדילת תאי T (שנעשה במעבדה 6) ו -3% הפלזמה אוטולוגית תורם. אם פלזמה אוטולוגית תורם אינה זמינה, להשתמש בסרום AB אנושי חום מומת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הכנת חיץ מחייב AnnexinV. לפזר 8.12 כלוריד גרם נתרן (NaCl) ו0.12 ​​calc גרםכלוריד ium (CaCl 2) ל990 DDH מ&quot;ל 2 O.Add 10 מ&quot;ל חיץ 1M HEPES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר תאי T אנטיגן ספציפי לאדם. (לפרוטוקול מפורט בבקשה לראות פרסום קודם 7 ניצול תאים מלאכותיים הצגת אנטיגן (aAPC)). ודא שהספציפיות פפטיד היא לפחות&gt; 75% כפי שנקבע על ידי מכתים tetramer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימת דגירה 2 x 10 5 תאי T אנטיגן ספציפי היטב (בצלחת תחתונה 96 גם עגולה) ב200 μl של מדיום התרבות המשותפת ב1 /: 1 יחס עם KaAPC ל48 שעות בחממה humidified על 37 מעלות C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות קציר ולהעביר לתוך צינור FACS; לשטוף עם 1 מ&quot;ל AnnexinV מאגר מחייב, ספין למטה XG 300 5 דקות, להשליך supernatant וגלול בשל חיץ מחייב AnnexinV 100 μl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות כתם עם μl 1 AnnexinV FITC ו5 μl 7-AAD ל10-15 דקות ב RT, לשטוף עם 1 מ&quot;ל חיץ מחייב AnnexinV; ספין למטה XG 300 5 דקות, להשליך supernatantresuspend ד בחיץ מחייב 250 μl AnnexinV </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו דגימות באופן מיידי על זרימת cytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הדגימות הבאות כדי לקבוע הרג אנטיגן הספציפי על ידי KaAPC: תאי T בלבד; תאי T אנטי CD95 + המסיס; תאי T + פרק KaAPC; + פפטיד שאינו מאותו מקור התאים T נטען KaAPC; + פפטיד מקור תאי T נטען KaAPC; תאים + supernatant T של פפטיד המקור טעון KaAPC. </li></ol><img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> . איור 2 KaAPC assay הרג פפטיד טעון KaAPC או חרוזים שליטה (HLA-A2 איג רק חרוזים) היו בתרבית למשך 48 שעות ב1: 1 עם תאי CMVpp65 ספציפיים T (~ 80%), שנקטפו ולאחר מכן מוכתם בAnnexinV ויודיד propidium (PI) כדי לקבוע אפופטוזיס על ידי cytometry זרימה (ראה סעיף פרוטוקול 3.3-3.7). &quot;מאותו המקור&quot; מתייחס לחרוזים עמוסים CMVpp65 ו&quot; שאינו מאותו המקור &quot;להיותמודעות עמוסות בפפטיד מארט-1. מספרים מציינים את אחוז תאי T קיימא ברבע השמאלי התחתון של כל עלילה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע שתי וערב-ניסויים, לייצר תאי T אנטיגן הספציפי של שתי ספציפיות שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך להעריך את הדלדול-יכולות אנטיגן ספציפי של KaAPC עם ניתוח סימולטני של חיסול אנטיגן הספציפי של תאי T באוכלוסיית תאי T הטרוגנית. (לפרוטוקול מפורט בבקשה לראות אל שיץ et. 10). </li></ol>

<ol>
	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

יש לי CS וMF שום דבר לגלות. תחת הסכם רישוי בין NexImmune ואוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס, בני הזוג. שנק וOelke זכאים למניות של תמלוגים שהתקבלו על ידי האוניברסיטה במכירות של מוצרי aAPC המתוארים במאמר זה. הם גם בעלי מניות NexImmune, אשר כפופה למגבלות מסוימות על פי פוליסת אוניברסיטה. ד&quot;ר שנק הוא חבר של חברת המועצה של &quot;המנהלים וועדה מדעית מייעצת. המונחים של הסדר זה מנוהלים על ידי אוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס בהתאם לסכסוך שלה של מדיניות ריבית.

השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא להבטיח היחס המתאים של (פפטיד MHC) אות 1 ואות 2 (אנטי Fas מב). אנחנו ביצענו ניסויי טיטרציה אינטנסיביים כדי להגדיר את היחס המושלם לאות 1 ו -2; התברר כי וריאציות מינימליות, בשל הבדלים בדימר HLA-A2 איג או ריכוזי מב-Fas אנטי יכולות להפריע לפעולה התקינה של KaAPC. לפיכך, הריכוז של שני האותות תמיד צריך להיות מאומת ואיכות של שני החלבונים יש לעתים קרובות נבדקה גם אם זה הוזמן ממקור מסחרי. יתר על כן, תמיד צריכים להיקבע הריכוזים על ידי אותו assay כמבחני זיהוי שונים עלולים לגרום לריכוזים שונים. הפונקציונליות של HLA-A2 איג גם יכולה להיפגע בשל refolding שלם ו / או טעינת פפטיד לא יעילה. יתר על כן מולקולות דימר יכולות לצבור בדרגות שונות, אשר עשוי להשפיע על הפעילות הפונקציונלית של החלבון. לכן, actuסכום אל של דימר דרוש לדור של KaAPC פונקציונלי וספציפי עשויים להשתנות. בנוסף, מצאנו כי הטווח האידיאלי למוות גרימת אות נגד פאס מב על KaAPC הוא הדוק ביותר. בכמויות הידיים שלנו גדול יותר 3.64 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​יגרום להרג הלא ספציפי של תאי T החיובי Fas ואילו סכומים מתחת 3.64 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​הביאו לפעילות הרג מופחתת בהתאם מינון. בעוד תנאים אלה נראים די הדוקים, תשומת לב לפרטים אלה יגרום לדור של KaAPC פונקציונלי וספציפי. בעוד פנוטיפ KaAPC הנוכחי הוא פונקציונלי לדלדול של תאים מופעלים אנטיגן ספציפי T, ניסויים ראשוניים מיקוד תאי T אנטיגן הספציפי לנאיביים או מנוחה לא גילה אינדוקציה משמעותית של אפופטוזיס אנטיגן הספציפי לאוכלוסיות אלה הקטינו ביטוי Fas. לכן, אפשר לדמיין הוספת אות שיתוף גירוי על KaAPC לגרום עד תקנה של פאס במנוחת תאי T כדי להפוך להפוך אותם<html> ליעד לKaAPC. אמנם זה אפשרי כל שלושת האותות יצטרכו להיות טיטרציה בקפידה כדי להבטיח פנוטיפ KaAPC פונקציונלי. התאמת פלטפורמת חרוז למטריצה ​​ביולוגית או מתכלה תשפר KaAPC בתחולת vivo. לאחרונה, שן et al. דיווחו מוצלח בשימוש vivo של KaAPC ניצול 5 חרוזים לטקס מיקרומטר מצומדת לנגד פאס (שיבוט Jo2) ואנטי / H2-K ב -TRP2 11. אנחנו כבר הצלחנו להראות כי הרעיון הכללי של תאים מלאכותיים הצגת אנטיגן (aAPC) ניתן להעביר בהצלחה ממיקרומטר בגודל חלקיקים בגודל ננומטר 12 ופונקציונליות שמושפעת מגיאומטרית חלקיקי 13. כך, על ידי שינוי הגודל ו / או צורה של KaAPC עתיד עיצובים אחד יוכל להשפיע על הפונקציונליות in vivo ו ביו הפצה, אשר יכול להיות מפתח לטיפול מוצלח במחל אוטואימוניות מסוימות איבר. ילדה = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC להתגבר על החסרונות העיקריים של אסטרטגיות שחסכו בתאים מבוססים כקלה לשימוש &quot;מהמדף&quot;, זמן וגישה יעילה עלות שאינו תלוי במצב תורם וטיפול מקדים. KaAPC אינו מטרה של עצמי או איתות הרג אוטוקריני ואינו רגישה לפונקציות מפעיל cytolytic של CTL. KaAPC ידרוש זיהוי של אנטיגן המחלה הרלוונטי ולהסתמך על סוג HLA הספציפי שלהם. בעוד אנטיגנים HLA-A2 מוגבלים רבים כיום מתאימים לסוכרת מהסוג 1, מחלת שתל נגד מאחסן וטרשת כפולות זוהו 2, פיתוח של נוספת HLA כיתה אני דימר מולקולות כמו גם זיהוי השוטף של אנטיגנים רלוונטיים אוטואימוניות חדשים יגדיל עוד יותר ולהרחיב את תחולתו של KaAPC. יתר על כן אחד יכול לחשוב על שימוש KaAPC מכוון אפיטופים שונים כדי למקד אנטיגנים מרובים בו זמנית. לסיכום, KaAPC מייצג פלטפורמה טכנולוגית גמישה לtigen ספציפי שחסך בתאי T. הטבע &quot;כמו לגו-&quot; שלהם מאפשר ההכללה של אותות חדשים כגון אותות נוספים שיתוף גירוי או מעכבות כגון PD1 או TRAIL על מטריצות שונות, אשר יכול להרחיב ולשפר הבאים שלהם במבחנה ובתחולת vivo. אנחנו במסמך זה נציג את פרוטוקול צעד אחר צעד כדי ליצור KaAPC, הגישה מבוססת חרוז הראשון לחיסולם של תאי T אנטיגן ספציפי מתערובות תא T עם ספציפיות שונות. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3 KaAPC לחסל CTL באופנת אנטיגן ספציפי PKH26 שכותרתו הופעלה CTL מפעיל זיכרון Fas + וPKH67 שכותרתו CTL CMVpp65 הספציפי מאותו התורם היו מעורב ל1:. יחס 1 ושיתוף תרבותי עם CMVpp65 KaAPC ל48 שעות. טופלו תרבויות שליטה עם KaAPC נפרק, או 1 מיקרוגרם / מ&quot;לשל מסיס נגד פאס-מב (CH11 שיבוט). הפסד מינימאלי של תאי קיימא נקבע בתרבויות שלא טופלו מעורבות CTL (תערובת T). נתונים FACS מקוריים לכל אוכלוסיית CTL של תמהיל T מוצגים. ניתוח של אפופטוזיס בוצע כפי שפורסם בעבר על ידי gating הנפרד בשתי אוכלוסיות תאי T 10. מספרים המתוארים ברביעים שמאלי העליונים מייצגים% מתאים בסך הכל. הדמות הממחישה נגזרת מניסוי נציג אחד מתוך שלושה ניסויים בלתי תלויים. מחקר זה פורסם במקור בדם. . שיץ, ג et al Killer תאי מציגי אנטיגן מלאכותיים: אסטרטגית רומן למחוק תאי T ספציפיים דם.. 2008; 111, 3,546-52. כל הזכויות שמורות האגודה להמטולוגיה האמריקנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

במהלך שני העשורים האחרונים התקדמות רבה נעשתה בהבנת המנגנונים פתוגניים של מחלות אוטואימוניות. עם זאת, הטיפולים הנפוצים ביותר עדיין מסתמכים על סטרואידים, כמו גם תרופות לדיכוי מערכת חיסון כגון תחליפי פורין, סוכני אלקילציה ומעכבי calcineurin 1. השימוש בתרופות מסוג זה שיפר מאוד את סיכויי ההחלמה של חולים, עדיין הטיפול אינו מספק תרופה של התקלה החיסונית הבסיסית. יתר על כן, החולים נעשים פגיעים לזיהומים ולהתפתחות של הסרטן. מכאן המטרה האולטימטיבית לטיפול במחל תאי T בתיווך אוטואימוניות ודחייה של שתל היא למקד מחלה רק גורמת לתאי T בזמן, באותו הזמן, והשאיר את המערכת החיסונית שנותרה ללא שינוי ומוסמך להילחם בהפרעות חיסוניות ספציפי. תאי מציגי אנטיגן ניצול (APC) כטיפול לדיכוי תגובות תא T היקפיים תוארו לראשונה מוקדם ככל1970s על ידי מספר קבוצות. מאז רבות גישות מבוססות תאים פותחו (שנסקר בשיץ et al. 2). אסטרטגיות באמצעות להביע מקאל רוצח-APC כתאי immunoregulatory הראו תוצאות מבטיחות מציינות פוטנציאל טיפולי לטיפול במחלת חיסון עצמי, דחייה של שתל וזיהומים כרוניים. עם זאת, קיימות מגבלות משמעותיות באסטרטגיות ניצול מקאל Killer-APC שסופו של דבר מוגבל היישום הקליני שלהם; דור (i) או בידוד של APC הוא זמן, עבודה ועלות אינטנסיבית (ii) לחולים הסובלים מcytopenia בשל דיכוי חיסוני לספק כמויות ואיכות של תאים מוגבלים (iii) ציפוי או התמרה של APC עם אותות אפופטוזיס גרימה כגון תוצאות מקאל במאוד פנוטיפים משתנים ו( iv) Killer-APC רגיש לציטוטוקסיות פונקציות מפעיל של תאי T וכתוצאה מכך צמצום הפוטנציאל הטיפולי שלהם. לכן, קשה להבטיח pheno Killer-APC מוגדר לשחזורסוג שיכול להיות מנוצל לאפנון אנטיגן הספציפי של תגובות תא T in vivo. בהתבסס על העבודה הקודמת שלנו עם מקאל להביע Killer-APC 3-5 ותאים מלאכותיים הצגת אנטיגן (aAPC) 6,7 פיתחנו גישה המבוססת על חרוז (KaAPC) לעיכוב אנטיגן ספציפי או חיסול של תאי T אוטומטי-reactive ב מבחנה. KaAPC מורכב של דימר HLA-A2 איג (אות 1) ומב נגד פאס (אות גרימת אפופטוזיס) המשותק קוולנטית על גבי משטח של 4.5 מיקרומטר חרוז לטקס פאראמגנטיים. הם מרוקנים את תאי T אנטיגן ספציפי באופנה בתיווך Fas / מקאל מתרביות תאי T של ספציפיות מרובות באופן אנטיגן ספציפי ועצמאיים של המוות של תאי הפעלה מושרה המסלול (AICD). אפופטוזיס התלוי מינון בתאי T ממוקד מושרה במהירות כבר לאחר 30 דקות 8. KaAPC יכול להיות שנוצר בקלות בצורה מבוקרת להבטיח מוגדר מphenot המדףype ולהתגבר על רוב החסרונות של אסטרטגיות שחסכו בתאים מבוססים. כתוצאה מכך, KaAPC להציג פוטנציאל גדול לטיפול במחל תאי T בתיווך אוטואימוניות ודחייה של שתל, קידום תחום אסטרטגיות טיפול ספציפיים תא T.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

טיפול שוטף של מחלות אוטואימוניות בתיווך תא T מסתמך בעיקר על אסטרטגיות של דיכוי חיסוני הגלובלי, אשר, בטווח הארוך, מלווה בתופעות לוואי שליליות כגון יכולת מופחתת לשלוט זיהומים או ממאירויות. לכן, גישות חדשות צריכים להיות מפותחות המתמקדים רק תאי המחלה תיווך ולעזוב את המערכת החיסונית שנותרה ללא פגע. בעשור האחרון במגוון של אסטרטגיות טיפול חיסוני תא מבוסס לווסת תגובות חיסוניות תא בתיווך T פותחו. רוב הגישות אלו מסתמכות על תאים וישכנע סובלנות הצגת אנטיגן (APC). עם זאת, בנוסף להיותו קשה ומסורבל מבחינה טכנית, גישות מבוססות תאים כאלה הן רגישות מאוד לתגובות רעילות לתאי T תא, אשר מגבילה את היכולת הטיפולית שלהם. כאן אנו מציגים פרוטוקול לדור של תאי הצגת אנטיגן מלאכותיים רוצח בלתי תאי (KaAPC), המאפשר לדלדול של תאי T פתולוגיים תוך השארת מחדשמערכת חיסונית נותרת ללא שינוי ופונקציונלי. KaAPC הוא פתרון חלופי לטיפול חיסוני התאי שבו יש פוטנציאל לטיפול במחלות אוטואימוניות ודחיות של שתל על ידי ויסות תגובות תא T לא רצויות באופנה ספציפית אנטיגן.

התכונות של פרוטוקול זה כוללות את הדור מוגדר של פנוטיפ KaAPC שמציג HLA-A2 איג (אות 1) ונגד פאס מב (אות אפופטוזיס) באותו הזמן, אשר בהשוואה לגישות המבוססות על תא אינו משתנה על ידי ציפוי או יכול להיות מווסת efficacies ותמרה בקלות במהלך הייצור (איור 1). יתר על כן, KaAPC, אינם רגיש לפונקציות מפעיל ציטוטוקסיות של תאי T והפונקציונליות שלהם אינו תלוי באיכות של תאי מציגי אנטיגן אוטולוגי לפני ואחרי במניפולצית מבחנה. KaAPC מסוגל כלה את תאי T אנטיגן ספציפי במבחנה כאשר היא עמוסה עם פפטיד המקור, בעוד שאינו מאותו המקור טעון KaAPC לא לרוקן תאי T (איור 2). לכן, KaAPC לגרום למות תאים מתוכנת של תאי T באופן אנטיגן ספציפי. בהמשך לכך, אנו משמשים KaAPC לדלדול סלקטיבית של תאי T אנטיגן ספציפי מתערובת של SPE תא T שונהcificities, הוכחה שרק רעיל מינימאלי היה דולף לתוך תאי T השכן (איור 3). לפיכך, KaAPC מייצג כלי מעולה לדלדול אנטיגן ספציפי במבחנה של תאי T אנטיגן ספציפי לאדם פעיל עם יישום קליני פוטנציאלי לטיפול במחלות אוטואימוניות ובדחיות של שתל.

Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

הנחיות מוצגות עבור הדור של אנטיגן המלאכותי רוצח הצגת תאים, KaAPC, כלי יעיל לדלדול במבחנה של תאי T אנטיגן ספציפי לאדם ולפתרון חלופי לטיפול חיסוני תאי לטיפול במחלות אוטואימוניות בתיווך תא T בantigen- אופנה ספציפית מבלי להתפשר על המערכת החיסונית שנותרה.

תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל<em&gt; במבחנה</em&gt; דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

אנטיגן ספציפי In vivo להרוג Assay באמצעות תווית CFSE תאים היעד

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-איג בהתבסס Antigen תאים מלאכותיים הצגת עבור יעיל לשעבר vivo הרחבת CTL האדם

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Antigen המלאכותי הצגת תא הפעלה (aAPC) מתווכות והרחבת תאי T קטלניים טבעיים

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...