Name: killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells
Uploaded: 2014-08-11T19:00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) e KFO 146 (MF), il Dipartimento della Difesa DOD sovvenzione PC 040.972 (MO) e l&#39;Istituto Nazionale della Sanità concede RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)

1 Generazione di HLA-A2-Ig Based KaAPC <ol><li> Preparare tampone borato sterile. Fare una soluzione 0,1 M di acido borico in acqua e regolare il pH a 7,0. Filtro sterile (0,22 micron) tampone e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare sterile tampone di lavaggio tallone. Utilizzare tampone fosfato salino (PBS) senza magnesio e calcio. Aggiungi siero AB umano per concentrazione finale del 3%. Aggiungi etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 2 mM di concentrazione finale. Aggiungi sodio azide (NaN 3) per la concentrazione finale 0,01%. Filtro sterile (0,22 micron) tampone e conservare a 4 ° C. </li><li> Trasferire 250 ml di perline epossidici (circa 100 x 10 6 perline) a magazzino in una sterile, con tappo a vite fiala di vetro. </li><li> Aggiungere 250 ml di tampone borato. </li><li> Mettere fiala di vetro su un magnete e lasciate perline aderire per 2 min; tampone aspirare e rimuovere flaconcino di vetro da magnete. </li><li> Lavare perline una volta con 1 ml di tampone borato. </li><li> Risospendere le sfere in 550 ml di 0.018 mcg/ Ml HLA-A2-Ig e 3.64 mg / ml di anti-umano CD95 monoclonale (clone CH11) e mescolare delicatamente agitando. (Si prega di consultare la sezione di discussione per ulteriori informazioni.) </li><li> Incubare fiala di vetro su una estremità rotatore sopra fine, a 4 ° C per 24 ore. </li><li> Spin down perline a 300 xg per 2 minuti. </li><li> Posizionare flaconcino di vetro su un magnete per 2 minuti e aspirare la &quot;soluzione di carico KaAPC&quot;; rimuovere fiala di vetro da magnete, aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio tallone e risospendere accuratamente agitando. </li><li> Ripetere il punto 1.10 due volte. </li><li> Incubare fiala di vetro su un rotore a 4 ° C per 24 ore in 1 ml di tampone di lavaggio tallone. A questo punto, tutti i siti di legame con le proteine ​​residue sarà bloccato da siero AB umano contenute nel tampone di lavaggio tallone. </li><li> Spin down perline a 300 xg per 2 minuti. </li><li> Luogo ampolla di vetro su una calamita per 2 min e tampone di aspirare tallone di lavaggio; rimuovere fiala di vetro da magnete e sostituire soluzione di 1 ml di PBS. </li></ol> 2 Controllo di qualità, Peptide Loading, Wincenerimento, conservazione e la stabilità di KaAPC <ol><li> Trasferire 1,5 x 10 5 KaAPC in un tubo FACS e lavare con 1 ml FACS tampone di lavaggio. </li><li> Risospendere le sfere in 100 ml FACS tampone di lavaggio e aggiungere 1 ml di anti-topo IgG1 PE (per il rilevamento della parte Fc di HLA-A2-Ig) e 1 ml di anti-topo IgM FITC (clone R6-60.2, per il rilevamento del CD95 mAb anti-umano). </li><li> Incubare per 15 min a 4 ° C, lavare con 1 ml FACS tampone di lavaggio, e risospendere in 250 microlitri FACS tampone di lavaggio e leggere macchie mediante citometria a flusso. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 QC macchia di un lotto KaAPC realizzata come indicato nella sezione del protocollo. Colorazione è stata eseguita come descritto nella sezione 2 del protocollo HLA-A2-Ig è stato rilevato utilizzando un anti-topo-IgG1 PE mAb, mentre anti-umano-CD95 (anti-Fas) è stata rilevata con un anti-mouse FITC IgM monoclonale (vedi protocollo section 2.2) (linea blu). Grafici nero pieno rappresentano perle vuoti colorati con anti-topo-IgG1 PE mAb o anti-topo-IgM FITC mAb, rispettivamente. I numeri in alto a destra indicano l&#39;intensità di fluorescenza media (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="4"><li> Per peptide trasferimento di carico 20 x 10 6 KaAPC in un nuovo flacone di vetro sterile, collocare su una calamita per 2 minuti, aspirare PBS e risospendere le perline in 500 microlitri PBS fresco con 5 mcg peptide (Tenete a mente, solo peptidi HLA-A2 ristretti volontà impegnare sul dimero!). </li><li> Conservare caricato KaAPC a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso, per almeno 3 giorni per consentire sufficiente peptide carico sul dimero HLA-A2-Ig. </li><li> Immediatamente prima dell&#39;uso, lavare il peptide caricata KaAPC come indicato in 1.14; ripetere questo passaggio almeno 6x. NOTA: Questo è un passo fondamentale per assicurare che il peptide libero ha to essere completamente rimosso per evitare falsi risultati positivi di sterminio; residua peptide libero ha dimostrato di indurre apoptosi in antigene-specifiche colture di cellule T 9. Per escludere un effetto peptide solubile, eseguire campioni di controllo surnatante di peptide caricato e lavato KaAPC (vedi 3.8). </li><li> Conte perline utilizzando emocitometro e l&#39;etichetta con la data, il nome del peptide e la concentrazione. NOTA: Loaded KaAPC resta funzionale a 4 ° C per almeno un mese. Dopo un mese, ri-caricamento con lo stesso peptide permette KaAPC per essere utilizzato per un massimo di un anno. </li></ol> 3. KaAPC In Vitro Assay Uccidere <ol><li> Preparare co-coltura. Preparare mezzo completo RPMI supplementato con 3% T fattore di crescita delle cellule (made in laboratorio 6) e il 3% dei donatori di plasma autologo. Se il donatore di plasma autologo non è disponibile, utilizzare siero umano AB inattivato al calore. </li><li> Preparare AnnexinV vincolante preparazione del buffer. Sciogliere 8,12 g di cloruro di sodio (NaCl) e 0,12 g calccloruro ium (CaCl 2) in 990 ml di DDH 2 O.Add 10 ml di tampone di 1M HEPES. </li><li> Generazione di cellule T antigene-specifiche umani. (Per un protocollo dettagliato consultare una pubblicazione precedente 7 artificiali utilizzando cellule presentanti l&#39;antigene (AAPC)). Assicurarsi che la specificità peptide è almeno&gt; 75% come determinato dal tetramero colorazione. </li><li> Per ogni campione incubare 2 x 10 5 cellule T antigene-specifiche / pozzetto (in una piastra inferiore 96 ben rotondo) in 200 ml di mezzo di co-coltura in un rapporto 1: 1 con KaAPC per 48 ore in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Campioni di raccolta e trasferire in una provetta FACS; lavare con 1 ml AnnexinV binding buffer, centrifugare a 300 xg per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere in 100 ml di AnnexinV binding buffer </li><li> Campioni macchia con 1 ml AnnexinV FITC e 5 microlitri 7-AAD per 10-15 min a RT, lavare con 1 ml di AnnexinV binding buffer; spin down a 300 xg per 5 minuti, scartare il surnatante und risospendere in 250 microlitri AnnexinV binding buffer </li><li> Leggi i campioni immediatamente al citofluorimetro. </li><li> Preparare i seguenti campioni per determinare uccisione antigene-specifica da KaAPC: solo le cellule T; Cellule T + solubili anti-CD95; Cellule T + scaricati KaAPC; Cellule T + peptide non-cognate caricato KaAPC; Cellule T + peptide cognate caricato KaAPC; Cellule T + surnatante del peptide cognate caricato KaAPC. </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> . Figura 2 KaAPC test uccidendo Peptide caricato KaAPC o sfere di controllo (solo HLA-A2-Ig perline) sono state coltivate per 48 ore in un rapporto 1: 1 con le cellule CMVpp65 specifici T (~ 80%), raccolte e successivamente tinto con AnnexinV e ioduro di propidio (PI) per determinare l&#39;apoptosi mediante citometria di flusso (vedi sezione protocollo 3,3-3,7). &quot;parente&quot; si riferisce a microsfere caricate con CMVpp65 e &quot;non-cognate&quot; di essereAnnunci carichi di Mart-1 peptide. I numeri indicano la percentuale di cellule T vitali nel quadrante in basso a sinistra di ogni trama. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="9"><li> Per eseguire Intersecato-esperimenti, generare cellule T antigene-specifiche delle due specificità diverse. </li><li> Ulteriori valutare le capacità di deplezione-antigene-specifiche di KaAPC con una analisi simultanea di eliminazione antigene-specifica delle cellule T nella popolazione di cellule T eterogenea. (Per un protocollo dettagliato si veda Schütz et al. 10). </li></ol>

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	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CS e MF hanno nulla da rivelare. Nell&#39;ambito di un accordo di licenza tra NexImmune e l&#39;Università Johns Hopkins, Drs. Schneck e Oelke hanno diritto alle azioni della regalità ricevute dall&#39;Università sulle vendite di prodotti AAPC descritti in questo articolo. Inoltre possiedono NexImmune magazzino, che è soggetta a determinate restrizioni nel quadro della politica University. Dr. Schneck è un membro della società &quot;s Consiglio di Amministrazione e Comitato di Consulenza Scientifica. I termini di questo accordo sono gestite dalla Johns Hopkins University in conformità con il suo conflitto di interessi politiche.

La fase più critica del protocollo è quello di garantire il corretto rapporto di segnale 1 (peptide MHC) e il segnale 2 (anti-Fas mAb). Abbiamo effettuato esperimenti di titolazione intensivi per definire il rapporto ideale per il segnale 1 e 2; divenne evidente che minime variazioni dovute a differenze nel dimero HLA-A2 Ig o concentrazioni di anti-Fas mAb possono interferire con la funzionalità del KaAPC. Pertanto, la concentrazione di entrambi i segnali deve essere sempre verificata e qualità di entrambe le proteine ​​devono essere frequentemente testato anche se è stato ordinato da una fonte commerciale. Inoltre, le concentrazioni devono sempre essere determinati dallo stesso dosaggio come diversi saggi di rilevamento potrebbero risultare in diverse concentrazioni. Funzionalità del HLA-A2-Ig può essere compromessa a causa di ripiegamento incompleta e / o inefficiente peptide carico. Inoltre le molecole dimero possono aggregare a diversi gradi, che possono influire sulla attività funzionale della proteina. Pertanto, l&#39;actuAl quantità di dimero necessaria per la generazione di un KaAPC funzionale e specifiche possono variare. Inoltre, abbiamo trovato che la gamma ideale per la morte indurre segnale anti-Fas mAb on KaAPC è estremamente stretto. Nelle nostre mani importi superiori 3.64 mcg / ml portare a non specifico uccisione di cellule T positive Fas mentre importi inferiori a 3,64 mg / ml hanno determinato una ridotta attività omicidio-dosi a seconda. Mentre queste condizioni sembrano piuttosto stretto, attenzione a questi dettagli comporterà la generazione di un KaAPC funzionale e specifico. Mentre l&#39;attuale fenotipo KaAPC è funzionale per la deplezione delle cellule T attivate antigene-specifiche, esperimenti iniziali di targeting di cellule T antigene-specifiche naïve o di riposo dimostrato alcuna significativa induzione di apoptosi antigene-specifica come queste popolazioni hanno ridotto l&#39;espressione Fas. Pertanto, si potrebbe prevedere l&#39;aggiunta di un segnale co-stimolatorio sulla KaAPC per indurre la up-regolazione di Fas su cellule T quiescenti per farli girarein un obiettivo per il KaAPC. Mentre questo è fattibile tutti e tre i segnali dovranno essere accuratamente titolata a garantire un funzionale KaAPC fenotipo. Regolazione della piattaforma tallone per una matrice biocompatibile e biodegradabile rafforzerà KaAPC di applicabilità vivo. Recentemente, Shen et al. Hanno riportato il successo nell&#39;uso vivo di KaAPC utilizzando perline 5 micron di lattice coniugate ad anti-Fas (clone Jo2) e anti-His / H2-K b -TRP2 11. Siamo stati in grado di dimostrare che il concetto generale di cellule presentanti l&#39;antigene artificiali (AAPC) può essere trasferito con successo da micron dimensionata per particelle di dimensioni 12 nm e che la funzionalità è influenzata dalla geometria della particella 13. Quindi, variando la dimensione e / o forma del futuro KaAPC disegni si potrebbe essere in grado di influire sulla funzionalità in vivo e bio-distribuzione, che potrebbe essere fondamentale per il successo del trattamento di specifiche malattie autoimmuni organo. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC superare le gravi carenze delle strategie di deplezione delle cellule basato come un facile da usare &quot;off the shelf&quot;, il tempo e l&#39;approccio efficiente costo che è indipendente dalla condizione di donatore e pre-trattamento. KaAPC non sono obiettivi di autoregolamentazione o di uccisione di segnalazione paracrina e non sensibile alle funzioni effettrici citolitiche di CTL. KaAPC richiederà l&#39;identificazione dell&#39;antigene malattia in questione e si basano sul loro tipo HLA specifico. Mentre attualmente numerosi antigeni HLA-A2 ristretti adatti per il diabete di tipo 1, GvHD e multipli di sclerosi sono stati identificati 2, lo sviluppo di ulteriori HLA di classe I dimero molecole così come la continua identificazione di nuovi antigeni rilevanti autoimmuni aumenterà ulteriormente e ampliare l&#39;applicabilità di KaAPC. Inoltre si potrebbe pensare di utilizzare KaAPC diretta a diversi epitopi di indirizzare antigeni multipli contemporaneamente. In sintesi, KaAPC rappresentano una tecnologia di piattaforma flessibile per unaspecifica-tigen deplezione delle cellule T. La loro natura &quot;lego-like&quot; permette l&#39;inserimento di nuovi segnali, come i segnali co-stimolatori o inibitori aggiuntive come PD1 o TRAIL su varie matrici, che potrebbe ampliare e migliorare la loro successiva in vitro e in vivo applicabilità. Noi qui presentiamo il protocollo step-by-step per generare KaAPC, l&#39;approccio basato primo tallone per l&#39;eliminazione delle cellule T antigene-specifiche da miscele di cellule T con differenti specificità. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 KaAPC eliminare CTL in modo specifico per l&#39;antigene PKH26-etichettato attivato Fas + CTL effettori-memoria e PKH67-etichettato CMVpp65-specifici CTL dallo stesso donatore sono stati mescolati a un 1:. Rapporto 1 e co-coltura con CMVpp65 KaAPC per 48 h. Colture di controllo sono stati trattati con scarico KaAPC, o 1 mg / mldi solubili anti-Fas-monoclonale (clone CH11). Minima perdita di cellule vitali è stata determinata in colture non trattate miste CTL (T mix). Sono mostrati i dati FACS originali per ogni popolazione CTL del mix T. L&#39;analisi di apoptosi è stata eseguita come precedentemente pubblicato da gating separato su entrambi popolazioni di cellule T 10. I numeri raffigurati nei quadranti superiori di sinistra rappresenta% delle cellule totali. La figura illustra deriva da un esperimento rappresentativo di tre esperimenti indipendenti. Questa ricerca è stata originariamente pubblicata nel sangue. . Schütz, C. et al Killer cellule presentanti l&#39;antigene artificiale: una nuova strategia per eliminare le cellule T specifiche Sangue.. 2008; 111, 3546-52. Copyright della Società Americana di Ematologia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Negli ultimi due decenni sono stati compiuti molti progressi nella comprensione dei meccanismi patogenetici delle malattie autoimmuni. Tuttavia, i trattamenti più comuni si basano ancora su corticosteroidi e farmaci immunosoppressori, come analoghi delle purine, agenti alchilanti e inibitori della calcineurina 1. L&#39;uso di tali farmaci ha notevolmente migliorato la prognosi dei pazienti, ma il trattamento non fornire una cura della disfunzione immunologica sottostante. Inoltre, i pazienti diventano vulnerabili alle infezioni e allo sviluppo del cancro. Quindi l&#39;obiettivo finale per il trattamento delle cellule T malattie autoimmuni mediate e rigetto è quello di indirizzare specificamente unica malattia che causa le cellule T, mentre, allo stesso tempo, lasciando il sistema immunitario rimanente intatto e competente a combattere i disturbi immunologici. Utilizzando cellule presentanti l&#39;antigene (APC) come trattamento per sopprimere le risposte delle cellule T periferiche è stato descritto già nel1970 da diversi gruppi. Dal momento che sono stati sviluppati poi molti approcci basati su celle (rivisto in Schütz et al. 2). Strategie che usano-FasL esprimono killer-APC come cellule immunomodulanti hanno mostrato risultati promettenti che indicano potenziale terapeutico per il trattamento di autoimmunità, rigetto e le infezioni croniche. Tuttavia, ci sono delle limitazioni significative con le strategie che utilizzano FasL Killer-APC che hanno in ultima analisi, limitato la loro applicabilità clinica; (I) la generazione o l&#39;isolamento di APC è tempo, lavoro e dispendiosa (ii) pazienti affetti da citopenia causa immunosoppressione fornire quantità limitate e la qualità delle cellule (iii) il rivestimento o trasduzione di APC con apoptosi inducendo segnali quali risultati FasL a altamente fenotipi variabili e (iv) Killer-APC sono sensibili citotossica funzioni effettrici delle cellule T di conseguenza riducendo il loro potenziale terapeutico. Pertanto, è difficile garantire una riproducibile Killer-APC feno definitatipo che può essere utilizzato per la modulazione antigene-specifica delle risposte delle cellule T in vivo. Sulla base del nostro lavoro precedente con FasL esprimono Killer-APC 3-5 e cellule presentanti l&#39;antigene artificiali (AAPC 6,7) abbiamo sviluppato un approccio basato tallone-(KaAPC) per l&#39;inibizione antigene-specifica o l&#39;eliminazione di cellule auto-reattive T in vitro. KaAPC costituiti da un dimero HLA-A2-Ig (segnale 1) e un anti-Fas mAb (segnale inducendo apoptosi) covalentemente immobilizzato su una superficie di una perlina paramagnetico lattice 4,5 micron. Essi riducono cellule T antigene-specifiche in un Fas / FasL modo mediato da colture di cellule T di molteplici specificità in maniera antigene-specifica e indipendente l&#39;attivazione indotta morte cellulare (AICD) percorso. Dose dipendente apoptosi nelle cellule T bersaglio è indotta rapidamente già dopo 30 min 8. KaAPC può essere facilmente generata in modo controllato garantire un definito al largo della phenot scaffaleipo e superare la maggior parte delle carenze di strategie di deplezione delle cellule based. Di conseguenza, KaAPC visualizzare un grande potenziale per il trattamento di cellule T malattie autoimmuni mediate e rigetto, avanzando il campo di cellule T specifiche strategie di trattamento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

Attuale trattamento di cellule T malattie autoimmuni mediate si basa principalmente su strategie di immunosoppressione globale, che, a lungo termine, è accompagnato da effetti collaterali negativi, come una ridotta capacità di controllare le infezioni o tumori. Pertanto, nuovi approcci devono essere sviluppati che colpiscono le cellule solo la malattia di mediazione e lasciare il sistema immunitario rimasta intatta. Negli ultimi dieci anni una varietà di strategie di immunoterapia a base di cellule di modulare sono stati sviluppati cellulari mediata risposte immunitarie T. La maggior parte di questi approcci si basano su cellule presentanti l&#39;antigene-tolleranza indurre (APC). Tuttavia, oltre ad essere tecnicamente difficile e ingombrante, tali approcci basati su cellule sono molto sensibili alle risposte delle cellule T citotossici, che limita la loro capacità terapeutica. Qui vi presentiamo un protocollo per la generazione di cellule presentanti l&#39;antigene artificiali non cellulari killer (KaAPC), che consente la deplezione di cellule T patologiche lasciando la risistema immunitario rimanente intatta e funzionale. KaAPC è una soluzione alternativa per l&#39;immunoterapia cellulare che ha il potenziale per il trattamento di malattie autoimmuni e rigetto allogenico regolando indesiderati risposte delle cellule T in modo specifico antigene.

Le caratteristiche di questo protocollo includono la generazione delimitati di un fenotipo KaAPC che visualizza HLA-A2-Ig (segnale 1) e anti-Fas mAb (segnale di apoptosi) Allo stesso tempo, che in confronto a quelli fondati cellulari non è influenzata dal rivestimento o di efficacia di trasduzione e possono essere facilmente modulata durante la produzione (Figura 1). Inoltre, KaAPC, non sono sensibili alle funzioni effettrici citotossiche delle cellule T e la loro funzionalità non dipende dalla qualità delle cellule presentanti l&#39;antigene autologo pre e post manipolazione in vitro. KaAPC sono in grado di deplezione delle cellule T antigene-specifiche in vitro quando caricato con peptide cognate, mentre il non-cognate caricato KaAPC non deplezione delle cellule T (Figura 2). Pertanto, KaAPC induce l&#39;apoptosi delle cellule T in modo antigene-specifica. Successivamente, abbiamo utilizzato KaAPC per deplezione selettiva di cellule T antigene-specifiche da una miscela di differenti spe cellule Tcificities, dimostrando che solo citotossicità minimo perdeva in cellule T circostanti (Figura 3). Così, KaAPC rappresentano uno strumento raffinato per deplezione in vitro antigene-specifica delle cellule T antigene-specifiche umani attivati ​​con applicabilità potenziale clinico per il trattamento di malattie autoimmuni e rigetto allogenico.

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Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Orientamenti sono presentati per la generazione di antigene artificiale assassino cellule presentanti, KaAPC, uno strumento efficace per deplezione in vitro di cellule T antigene-specifiche umani e una soluzione alternativa per immunoterapia cellulare per il trattamento delle malattie autoimmuni mediate da cellule T in un antigene modo specifico senza compromettere il sistema immunitario rimanente.

Killer artificiale cellule presentanti l&#39;antigene (KaAPC) per una efficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; L&#39;esaurimento delle Umana antigene-specifiche cellule T

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

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Immunology and Infection

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Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

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Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

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Immunologia e infezioni

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HLA-Ig celle in base Antigen Presenting artificiale per Efficiente Ex vivo Estensione dei diritti dell&#39;uomo e CTL

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Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

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Applicazione clinica della<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Artificiale e cellule presentanti l&#39;antigene per modificare geneticamente le cellule T da sangue del cordone ombelicale e periferico

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

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Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

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Generazione<em&gt; De Novo</em&gt; Antigene-specifici T umana recettori cellulari di trasduzione retrovirale di Centric Hemichain

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Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

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B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

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Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

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