Name: killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells
Uploaded: 2014-08-11T19:00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Dette arbeidet har vært støttet av den tyske Research Foundation (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) og KFO 146 (MF), DOD Department of Defence stipend PC 040972 (MO) og National Institute of Health gir RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)

1. Generering av HLA-A2-Ig Basert KaAPC <ol><li> Forbered steril boratpuffer. Foreta en 0,1 M oppløsning av borsyre i vann og justere pH til 7,0. Sterilfilter (0,22 mikrometer) buffer og oppbevar ved 4 ° C. </li><li> Forbered steril perle vaskebuffer. Bruk fosfatbufret saltvann (PBS) uten magnesium og kalsium. Legg humant AB serum i 3% sluttkonsentrasjon. Legg etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i 2 mM sluttkonsentrasjon. Legg natriumazid (NaN 3) for 0,01% sluttkonsentrasjon. Sterilfilter (0,22 mikrometer) buffer og oppbevar ved 4 ° C. </li><li> Overfør 250 mL av epoxy perler (ca 100 x 10 6 perler) fra lager til en steril, skrukork hetteglass. </li><li> Tilsett 250 ul av boratbuffer. </li><li> Sett hetteglass på en magnet og la perlene holder seg i 2 min; aspirer buffer og fjerne glassflaske fra magnet. </li><li> Vask en gang med perlene 1 ml boratbuffer. </li><li> Suspender perler inn 550 mL av 0,018 mikrogram/ Ml HLA-A2-Ig og 3,64 mikrogram / ml anti-human CD95 mAb (klone CH11) og forsiktig bland ved å riste. (Vennligst se diskusjonskapittelet for mer informasjon.) </li><li> Inkuber hetteglass på en rotator ende-over-ende, ved 4 ° C i 24 timer. </li><li> Spinn ned perler ved 300 x g i 2 min. </li><li> Plasser hetteglass på en magnet for 2 min og aspirer &quot;KaAPC lasting løsning&quot;; fjerne hetteglass fra magnet, tilsett 1 ml perle vaskebuffer og resuspender nøye ved å riste. </li><li> Gjenta trinn 1.10 to ganger. </li><li> Inkuber hetteglass på en rotator ved 4 ° C i 24 timer i 1 ml vulsten vaskebuffer. På dette punkt, vil all gjenværende proteinbindingsseter blokkeres av humant AB serum inneholdes i vulsten vaskebuffer. </li><li> Spinn ned perler ved 300 x g i 2 min. </li><li> Plasser glass hetteglass på en magnet for 2 min og aspirer perle vaskebuffer; fjerne hetteglass fra magneten og erstatte løsning med 1 ml PBS. </li></ol> 2. Quality Control, Peptide Laster, Wforaskningen, lagring og stabilitet av KaAPC <ol><li> Overfør 1,5 x 10 5 KaAPC inn i en FACS røret og vask med 1 ml FACS vaskebuffer. </li><li> Suspender perler i 100 mL FACS vaskebuffer og tilsett 1 mL av anti-mus IgG1 PE (for påvisning av Fc delen av HLA-A2-Ig) og 1 mL av anti-mus IgM FITC (klone R6-60.2, for påvisning av anti-human CD95-mAb). </li><li> Inkuber i 15 min ved 4 ° C, vaskes med 1 ml FACS vaskebuffer, og resuspender i 250 ul vaskebuffer og FACS farging les ved strømningscytometri. </li></ol><img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1. QC flekk av en KaAPC batch fremstilt som angitt i protokollinformasjonen. Farging ble utført som beskrevet i protokollen delen 2. HLA-A2-Ig ble detektert ved bruk av et anti-mus-IgG 1 PE mAb, mens anti-human CD95- (anti-Fas) ble påvist med et anti-mus-IgM-FITC mAb (se protokoll seDette skjer 2.2) (blå linje). Fylt sorte grafer representerer tomme perler farget med anti-mus-IgG1 PE mAb eller anti-mus-IgM FITC mAb, henholdsvis. Tall i øvre høyre hjørne angir gjennomsnittlig fluorescerende intensitet (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <ol start="4"><li> For peptid lasting overføring 20 x 10 6 KaAPC inn i en ny steril hetteglass, legg på en magnet for 2 min, aspirer PBS og resuspender perler inn 500 mL frisk PBS med 5 mikrogram peptid (Husk, bare HLA-A2 bundne peptider vil binde på dimer!). </li><li> Oppbevares lastet KaAPC ved 4 ° C inntil bruk, i minst tre dager for å tillate tilstrekkelig peptid lasting på HLA-A2-Ig dimer. </li><li> Umiddelbart før bruk, vask peptidet lastet KaAPC som angitt i 1,14; gjenta dette trinnet minst 6x. MERK: Dette er et viktig skritt for å sikre at gratis peptid har to fjernes helt for å unngå falske positive draps resultater; gjenværende frie peptid har blitt vist å indusere apoptose i antigen-spesifikke T-cellekulturer 9. For å utelukke en løselig peptid effekt, kjøre supernatanten kontrollprøver av peptid lastet og vasket KaAPC (se 3.8). </li><li> Telle perler bruker hemocytometer og merk med dato, navn på peptid og konsentrasjon. MERK: Lastet KaAPC være funksjonell ved 4 ° C i minst en måned. Etter en måned, re-lasting med samme peptid kan KaAPC å bli utnyttet for inntil ett år. </li></ol> 3. KaAPC In Vitro Killing analysen <ol><li> Forbered co-kultur media. Forbered komplett RPMI-medium supplert med 3% T-cellevekstfaktor (laget i laboratoriet 6) og 3% donor autologt plasma. Hvis donor autolog plasma er tilgjengelig, bruker varme-inaktivert menneskelig AB serum. </li><li> Forbered AnnexinV bindingsbuffer forberedelse. Oppløs 8,12 g natriumklorid (NaCl) og 0,12 g calcium-klorid (CaCl 2) i 990 ml DDH 2 O.Add 10 ml 1M HEPES-buffer. </li><li> Generer humane antigen-spesifikke T-celler. (For en detaljert protokoll kan du se en tidligere publikasjon 7 utnytte kunstige antigenpresenterende celler (AAPC)). Påse at peptid spesifisitet er minst&gt; 75% som bestemt ved tetramer farging. </li><li> For hver prøve inkuberes med 2 x 10 5 antigen-spesifikke T-celler / brønn (i en 96 brønn rundbunnet plate) i 200 pl av ko-kulturmedium i en 1: 1-forhold med KaAPC i 48 timer i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2. </li><li> Slakte prøver og overføre til en FACS tube; vask med 1 ml AnnexinV bindingsbuffer, spinne ned ved 300 xg i 5 min, kast supernatanten og resuspender i 100 mL av AnnexinV bindingsbuffer </li><li> Stain prøver med 1 pl AnnexinV FITC og 5 mL 7-AAD for 10-15 min ved RT, vask med 1 ml AnnexinV bindingsbuffer; spinne ned ved 300 xg i 5 minutter, kaste supernatant end resuspender i 250 mL AnnexinV bindingsbuffer </li><li> Les prøvene umiddelbart på flowcytometeret. </li><li> Forbered følgende prøver å bestemme antigen-spesifikke drap etter KaAPC: T-celler bare; T-celler + løselig anti-CD95; T-celler + losset KaAPC; T celler + ikke-beslektet peptid lastet KaAPC; T celler + beslektet peptid lastet KaAPC; T celler + supernatant av beslektet peptid lastet KaAPC. </li></ol><img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> . Figur 2. KaAPC drepe analysen Peptide lastet KaAPC eller kontrollperler (HLA-A2-Ig bare perler) ble dyrket i 48 timer på en 1: 1-forhold med CMVpp65 spesifikke T-celler (~ 80%), høstet og deretter farget med AnnexinV og propidium jodid (PI) for å bestemme apoptose ved strømningscytometri (se protokoll avsnitt 3.3 til 3.7). &quot;beslektet&quot; refererer til perler som er lastet med CMVpp65 og &quot;ikke-beslektet&quot; bliannonser lastet med Mart-en peptid. Tallene angir prosentandelen av levedyktige T-celler i nedre venstre kvadrant av hver tomt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <ol start="9"><li> For å utføre krysskrave-eksperimenter, genererer antigen-spesifikke T-celler fra to forskjellige spesifisiteter. </li><li> Ytterligere evaluering av antigenspesifikke uttømming-evnene KaAPC med en samtidig analyse av antigen-spesifikk eliminering av T-celler i heterogen T-celle-populasjonen. (For en detaljert protokoll se Schütz et al. 10). </li></ol>

<ol>
	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CS og MF har ingenting å avsløre. Under en lisensavtale mellom NexImmune og Johns Hopkins University, Drs. Schneck og Oelke har rett til aksjer i royalty mottatt av Universitetet på salg av AAPC produktene som er beskrevet i denne artikkelen. De eier også NexImmune lager, som er underlagt visse restriksjoner under Universitetet politikk. Dr. Schneck er medlem av selskapet &quot;s styre og Scientific Advisory Board. Vilkårene i denne ordningen blir administrert av Johns Hopkins University i samsvar med sin konflikt interessepolitikk.

Den mest kritiske trinn i protokollen, er å sikre riktig forhold mellom signal 1 (peptid-MHC) og signal 2 (anti-Fas mAb). Vi har utført intensive titrering eksperimenter for å definere et perfekt forholdet for signalet 1 og 2; det ble klart at minimale variasjoner på grunn av forskjeller i HLA-A2 Ig dimer eller anti-Fas Mab konsentrasjoner kan forstyrre funksjonaliteten til KaAPC. Således bør konsentrasjonen av begge signaler alltid verifiseres og kvaliteten på begge proteiner bør ofte testet selv om det ble beordret fra en kommersiell kilde. Videre bør konsentrasjonene alltid bli bestemt av den samme assay som forskjellige deteksjonsanalyser kan resultere i forskjellige konsentrasjoner. Funksjonalitet av HLA-A2-Ig kan også bli svekket på grunn av ufullstendig refolding og / eller ineffektiv peptid lasting. Videre dimer-molekyler kan aggregere til forskjellige grader, noe som kunne påvirke den funksjonelle aktiviteten av proteinet. Derfor actual mengde av dimer som er nødvendig for generering av et funksjonelt og spesifikk KaAPC kan variere. I tillegg fant vi at den ideelle området for drapet induserende signal anti-Fas mAb på KaAPC er svært stramt. I våre hender større mengder 3,64 ug / ml føre til ikke-spesifikk dreping av Fas-positive T-celler, mens mengder under 3,64 ug / ml resulterte i en dose-avhengig dreping redusert aktivitet. Selv om disse betingelser synes ganske stramt, vil hensyn til disse detaljer resultere i generering av en funksjonell og spesifikk KaAPC. Mens den aktuelle KaAPC fenotype er funksjonell for uttømming av aktivt antigen-spesifikke T-celler, innledende forsøk rettet mot naive eller hvilende antigen-spesifikke T-celler viste ingen signifikant induksjon av antigen-spesifikk apoptose som disse populasjonene har redusert Fas ekspresjon. Derfor kan man tenke seg å legge et ko-stimulerende signal på KaAPC å indusere den opp-regulering av Fas på hvilende T-celler til å slå deminn et mål for KaAPC. Selv om dette er mulig alle tre signaler må nøye kontrolleres for å sikre en funksjonell KaAPC fenotype. Justere perle plattform til en biokompatible eller biologisk nedbrytbar matrise vil styrke KaAPC in vivo anvendbarhet. Nylig, har rapportert Shen et al. Den vellykkede in vivo-bruk av KaAPC benytte 5 mikrometer latekskuler konjugert til anti-Fas (klon Jo2) og anti-His / H2-K b -TRP2 11. Vi har vært i stand til å vise at det generelle begrepet kunstige antigenpresenterende celler (AAPC) kan med hell overføres fra mikrometer dimensjonert til nm størrelse partikler 12 og at funksjonaliteten er påvirket av partikkel geometri 13. Således, ved å variere størrelsen og / eller formen på fremtidig KaAPC design man kan være i stand til å påvirke den in vivo funksjonalitet og bio-fordeling, noe som kan være avgjørende for vellykket behandling av organspesifikke autoimmune sykdommer. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC vinne de store svakhetene i cellebasert uttømming strategier som en enkel å bruke &quot;hyllevare&quot;, tid og kostnadseffektiv tilnærming som er uavhengig av donor tilstand og forbehandling. KaAPC er ikke et mål for selv eller parakrint drap signale og ikke følsomme for cytolytiske effektorfunksjoner av CTL. KaAPC krever identifikasjon av den aktuelle sykdom antigen og stole på sin spesifikke HLA-type. Mens for tiden tallrike egnede HLA-A2 bundne antigener for type 1-diabetes, har GvHD og multipler sklerose blitt identifisert 2, utvikling av ytterligere HLA klasse I dimer-molekyler, så vel som den pågående identifisering av nye autoimmune relevante antigener vil ytterligere øke og utvide anvendbarheten KaAPC. Videre kunne man tenke på å bruke KaAPC rettet mot ulike epitoper å målrette flere antigener samtidig. I sammendraget, KaAPC representerer en fleksibel plattform-teknologi for enTigen spesifikke T-celle uttømming. Deres &quot;lego-lignende&quot; natur gjør at inkludering av nye signaler eksempel ekstra co-stimulerende eller hemmende signaler som PD1 eller sti på ulike matriser, som kan utvide og forbedre deres påfølgende in vitro og in vivo anvendbarhet. Vi her presentere steg-for-steg-protokollen for å generere KaAPC, den første perlen basert tilnærming for eliminering av antigen-spesifikke T-celler fra T-celle blandinger med ulike særegenheter. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3. KaAPC eliminere CTL i et antigen-spesifikt mote PKH26-merkede aktiverte Fas + effektor-minne CTL og PKH67-merket CMVpp65-spesifikke CTL fra den samme donor, ble blandet til en 1:. 1 forhold og ko-dyrket med CMVpp65 KaAPC i 48 timer. Kontrollkulturene ble behandlet med losset KaAPC, eller 1 pg / mlav løselige anti-Fas-MAB (klone CH11). Minimalt tap av levedyktige celler ble bestemt i ubehandlede blandede kulturer (CTL T blanding). Originale FACS data for hver CTL befolkningen i T-mix blir vist. Analyse av apoptose ble utført som tidligere publisert av separate gating på begge T-cellepopulasjoner 10. Numrene beskrevet i de øvre venstre kvadrantene representerer% av totalt antall celler. Den illustrerer figuren er avledet fra en representativt eksperiment av tre uavhengige eksperimenter. Denne forskningen ble opprinnelig publisert i Blood. . Schütz, C. et al Killer kunstige antigenpresenterende celler: en roman strategi for å slette spesifikke T-celler Blood.. 2008; 111, 3546-52. Copyright American Society of Hematology. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

I løpet av de siste to tiårene mye fremgang har blitt gjort i å forstå de sykdomsfremkallende mekanismene for autoimmune sykdommer. Men de mest vanlige behandlinger fremdeles er avhengige av kortikosteroider, samt immunosuppressive midler som purin-analoger, alkylerende midler og kalcineurinhemmere en. Bruken av slike stoffer har i høy grad forbedret prognosen for pasienter, men behandlingen gir ikke en helbredelse av den underliggende immunologiske funksjonsfeil. Videre pasienter blir utsatt for infeksjoner, og til utvikling av kreft. Derfor er det endelige mål for behandling av T-celle-medierte autoimmune sykdommer og allograft-avvisning er spesifikt mot bare sykdomsfremkallende T-celler, mens, på samme tid, slik at den resterende immunsystem urørt og i stand til å bekjempe lidelser i immunsystemet. Utnytte antigen-presenterende celler (APC) som en behandling for å undertrykke perifere T-celle-responser ble først beskrevet så tidlig som i1970 av flere grupper. Siden da mange cellebaserte tilnærminger har blitt utviklet (anmeldt i Schütz et al. 2). Strategier bruker Fasl-uttrykke killer-APC som immunoregulatory celler viste lovende resultater indikerer terapeutisk potensial for behandling av autoimmunitet, allograft avvisning og kroniske infeksjoner. Men det er betydelige begrensninger med strategier utnytte Fasl Killer-APC som har til slutt begrenset deres kliniske anvendbarhet; (I) generering eller isolering av APC-er tid, arbeids-og kostnadskrevende (ii) pasienter som lider av cytopeni på grunn av immunsuppresjon gi begrensede mengder og kvalitet av celler (iii) belegg eller transduksjon av APC til apoptose som induserer signaler slik som Fasl resulterer i sterkt variable fenotyper og (iv) Killer-APC er følsomme overfor cytotoksiske effektor funksjoner av T-celler som dermed reduserer deres terapeutiske potensial. Derfor er det vanskelig å garantere en definert reproduserbar Killer-APC phenotype som kan utnyttes for antigen-spesifikke modulering av T-celle responser in vivo. Basert på vår tidligere arbeid med Fasl uttrykker Killer-APC 3-5 og kunstige antigenpresenterende celler (AAPC) 6,7 vi utviklet en kulebasert tilnærming (KaAPC) for antigen-spesifikk inhibering eller eliminering av auto-reaktive T-celler i vitro. KaAPC består av HLA-A2-Ig-dimer (signal 1) og et anti-Fas mAb (apoptose induserende signal) kovalent immobilisert på en overflate av et 4,5 mikrometer paramagnetiske lateksperle. De utarme antigen-spesifikke T-celler i en Fas / Fasl mediert mote fra T-celle-kulturer av multiple spesifisiteter i en antigen-spesifikk måte og uavhengig av aktivering indusert celledød (AICD) pathway. Doseavhengig apoptose i målrettede T-celler er indusert raskt allerede etter 30 min 8. KaAPC kan enkelt genereres på en kontrollert måte som sikrer en definert hyllevare phenotype og overvinne de fleste av svakhetene i cellebasert uttømming strategier. Følgelig KaAPC viser et stort potensiale for behandling av T-celle-medierte autoimmune sykdommer og allograft-avvisning, fremme innen T-celle-spesifikke behandlingsstrategier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

Nåværende behandling av T-celle-medierte autoimmune sykdommer avhenger for det meste på strategier for global immunsuppresjon, som i det lange løp, er ledsaget av uønskede bivirkninger, for eksempel en redusert evne til å kontrollere infeksjoner eller kreftformer. Derfor er nye fremgangsmåter må utvikles som er rettet mot bare den sykdomsmedierende celler og la det resterende immunsystemet intakt. I løpet av det siste tiår en rekke cellebaserte immunterapi strategier for å modulere T-celle medierte immunresponser er blitt utviklet. De fleste av disse metodene er avhengige av toleranseinduserende antigen-presenterende celler (APC). Imidlertid, i tillegg til å være teknisk vanskelig og tungvint, slike cellebaserte tilnærminger er svært følsomme for cytotoksiske T-celle-responser, som begrenser deres terapeutiske kapasitet. Her presenterer vi en protokoll for generering av ikke-cellulær morderen kunstige antigenpresenterende celler (KaAPC), som gjør det mulig for uttømming av patologiske T-celler og samtidig la reværende immunsystem urørt og funksjonell. KaAPC er en alternativ løsning til cellulær immunterapi som har potensiale for behandling av autoimmune sykdommer og allograft-avvisning ved å regulere uønskede T-celle responser på en antigenspesifikk måte.

Funksjonene i denne protokollen er den definerte generering av et KaAPC fenotype som viser HLA-A2-Ig (signal 1) og anti-Fas mAb (apoptose-signal) på samme tid, som i forhold til cellebaserte tilnærminger ikke endres av belegg eller transduksjon efficacies og kan enkelt modulert under produksjon (figur 1). Videre KaAPC, ikke er følsomme overfor cytotoksiske effektor-funksjoner av T-celler og deres funksjon ikke er avhengig av kvaliteten av autologe antigen-presenterende celler før og etter in vitro-manipulasjon. KaAPC er i stand til å tappe antigenspesifikke T-celler in vitro når lastet med beslektet peptid, mens ikke-beslektet lastet KaAPC vil ikke utarme T-celler (figur 2). Derfor KaAPC indusere T-celle-apoptose i en antigen-spesifikk måte. Deretter brukte vi KaAPC for selektiv uttømming av antigen-spesifikke T-celler fra en blanding av forskjellige T-celle specificities, viser at bare minimal cytotoksisitet var lekker i nabo T-celler (figur 3). Således KaAPC representerer en utsøkt verktøy for in vitro antigen-spesifikk uttømming av humane aktiverte antigen-spesifikke T-celler med potensiell klinisk anvendbarhet for behandling av autoimmune sykdommer og allograft-avvisning.

Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Retningslinjer er presentert for generering av spekk kunstig antigen-presenterende celler, KaAPC, et effektivt verktøy for in vitro uttømming av humane antigen-spesifikke T-celler, og en alternativ løsning for å cellulær immunterapi for behandling av T-celle-medierte autoimmune sykdommer i et antigen bestemt måte uten at det går utover den gjenværende immunsystemet.

Killer Kunstig antigenpresenterende celler (KaAPC) for effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Nedbryting av humant antigen-spesifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Kunstig antigenpresenterende Cell (AAPC) mediert aktivering og utvidelse av Natural Killer T celler

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinisk anvendelse av<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; Og kunstig antigenpresenterende celler å genmodifisere T celler fra perifert og navlestrengsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Utvikling av en Antigen-drevet kolitt modell for å studere presentasjon av antigener ved hjelp av antigenpresenterende celler til T-celler

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generering<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spesifikke humane T-cellereseptorer etter retroviral transduksjon av Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Utvikling av stamcelle-avledet Antigen-spesifikke Regulatoriske T-cellene mot autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Oppdagelse og berikelse av Rare antigen-spesifikke B-celler for analyse av fenotype og funksjon

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

I Vivo Analysen for påvisning av Antigen-spesifikke T-celle Cytolytic funksjon med en vaksinasjon modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generasjon av Discriminative menneskelige monoklonale antistoffer fra sjeldne Antigen-spesifikke B celler i blodet

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...