Name: killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells
Uploaded: 2014-08-11T19:00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана Немецкого исследовательского фонда (DFG) Шу-2681 / 1-1 (CS) и KFO 146 (MF), DOD Департамент обороны гранта ПК 040972 (MO) и Национальный институт здравоохранения предоставляет РВЫХ1 CA108835 , РВЫХ1 Ai44129 (JPS)

1 Генерация HLA-A2-Ig Based KaAPC <ol><li> Подготовьте стерильную буфер борат. Сделать 0,1 М раствор борной кислоты в воде и доведения рН до 7,0. Стерильный фильтр (0,22 мкм) буфера и хранят при температуре 4 ° С. </li><li> Подготовьте стерильную буфер шарик стирки. С помощью забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) без магний и кальций. Добавить сыворотку человека AB для 3% конечной концентрации. Добавить этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) в течение 2 мМ конечной концентрации. Добавить азид натрия (NaN 3) для 0,01% конечной концентрации. Стерильный фильтр (0,22 мкм) буфера и хранят при температуре 4 ° С. </li><li> Перевести 250 мкл эпоксидных шариков (около 100 х 10 6 бисером) со склада в стерильный, с завинчивающейся крышкой стеклянный пузырек. </li><li> Добавить 250 мкл боратного буфера. </li><li> Поместите стеклянный флакон на магнит, и пусть шарики придерживаться в течение 2 мин; аспирируйте буфер и удалить стеклянный пузырек от магнита. </li><li> Вымойте бисером один раз 1 мл боратного буфера. </li><li> Ресуспендируйте гранул, в 550 мкл 0,018 мкг/ Мл HLA-A2-Ig и 3,64 мкг / мл анти-человеческий CD95 моноклональное антитело (клон CH11) и аккуратно перемешать путем встряхивания. (Пожалуйста, смотрите дискуссионный раздел для получения дополнительной информации.) </li><li> Инкубируйте стеклянный пузырек на конце поворотного устройства над концом, при 4 ° С в течение 24 часов. </li><li> Спин вниз бусы при 300 мкг в течение 2 мин. </li><li> Поместите стеклянный пузырек на магнит в течение 2 мин и аспирации &quot;KaAPC загрузки решение&quot;; удалить стеклянный пузырек с магнитом, добавить 1 мл борта промывочного буфера и ресуспендируйте тщательно встряхивая. </li><li> Повторите шаг 1,10 раза. </li><li> Инкубируйте стеклянный пузырек на ротатор при 4 ° С в течение 24 ч в 1 мл промывочного буфера шарик. В этот момент все остаточного белка сайты связывания будет заблокирован человека АВ сыворотки, содержащейся в буфере шарик стирки. </li><li> Спин вниз бусы при 300 мкг в течение 2 мин. </li><li> Место стеклянный флакон на магнит в течение 2 мин и аспирата стирки шарик буфера; удалить стеклянный пузырек от магнита и заменить решение с 1 мл PBS. </li></ol> 2 Контроль качества, пептид Загрузка, Wзолы, хранения, и устойчивость KaAPC <ol><li> Трансфер 1,5 х 10 5 KaAPC в FACS трубы и промыть 1 мл FACS промывочного буфера. </li><li> Ресуспендируют бусины в 100 мкл FACS буфера для промывки и добавить 1 мкл анти-мыши IgG1 PE (для обнаружения Fc части HLA-A2-Ig) и 1 мкл анти-мышиных IgM-FITC (клон R6-60.2, для обнаружения анти-человеческого CD95 МКА). </li><li> Выдержите в течение 15 мин при 4 ° С, промыть 1 мл FACS промывочного буфера, и ресуспендируют в 250 мкл FACS моющим буфером и читать окрашивание с помощью проточной цитометрии. </li></ol><img alt="Рисунок 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> Рис.1 QC пятно партии KaAPC сделал, как указано в разделе протокола. Окрашивание проводили, как описано в разделе протокола 2 HLA-A2-Ig был обнаружен с помощью анти-мышь-IgG1 PE МКА, в то время как анти-человеческого-CD95 (анти-Fas) был обнаружен с анти-IgM мыши-FITC мАт (см протокол SEводств 2.2) (синяя линия). Заполненные черные графики представляют пустые шарики, окрашенных анти-мышь-IgG1 PE МКА или против мышиного IgM FITC МКА, соответственно. Числа в правом верхнем углу указать среднюю интенсивность флуоресценции (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <ol start="4"><li> Для пептидной погрузки передачи 20 х 10 6 KaAPC в новую стерильную стеклянную пробирку, поместить на магнит в течение 2 мин, аспирация PBS и ресуспендируют гранул, в 500 мкл свежей PBS с 5 мкг пептида (Имейте в виду, только HLA-A2 ограниченные пептиды связать на димера!). </li><li> Магазин не загружен KaAPC при 4 ° С до использования, по меньшей мере, 3-х дней, чтобы обеспечить достаточное пептидный нагрузку на HLA-A2-Ig димера. </li><li> Непосредственно перед применением, мыть пептид загружалась KaAPC как указано в 1.14; повторите этот шаг, по крайней мере 6x. ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень важный шаг для того, чтобы свободный пептид имеет то полностью удалить, чтобы избежать ложных положительных результатов для убийства; Остаточный свободный пептид, как было показано, индуцирует апоптоз в антиген-специфических Т-клеток культур 9. Чтобы исключить растворимый эффект пептида, запустить образцы супернатанта управления пептида загруженной и промывают KaAPC (см 3.8). </li><li> Количество бусы, используя гемоцитометра и этикетка с датой, названием пептида и концентрации. ПРИМЕЧАНИЕ: Loaded KaAPC оставаться функциональным при 4 ° С в течение не менее одного месяца. После одного месяца, повторно загрузка с той же пептида позволяет KaAPC быть использованы на срок до одного года. </li></ol> 3 KaAPC In Vitro Убийство Анализ <ol><li> Подготовить совместно питательных сред. Подготовить всю RPMI среду, дополненную 3% T фактора роста клеток (сделано в лаборатории 6) и 3% доноров собственной плазмы. Если донор аутологичной плазмы недоступен, используйте инактивированной нагреванием сыворотку человека AB. </li><li> Подготовьте AnnexinV связывания подготовку буфера. Растворить 8,12 г хлорида натрия (NaCl) и 0,12 г вычий хлорида (CaCl 2) в 990 мл DDH 2 O.Add 10 мл 1М HEPES буфер. </li><li> Генерация человека антиген-специфических Т-клеток. (Для детального протокола смотрите предыдущую публикацию 7 с использованием искусственных антигенпредставляющих клеток (AAPC)). Убедитесь, что пептид, специфичность по крайней мере,&gt; 75%, как определено окрашиванием тетрамера. </li><li> Для каждого образца инкубируют 2 х 10 5 антиген-специфических Т клеток / лунку (в 96 и круглой нижней пластине) в 200 мкл со-культуральной средой в соотношении 1: 1 с KaAPC в течение 48 часов в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C и 5% CO 2. </li><li> Образцы промыслом и передать в FACS трубы; мыть с 1 мл AnnexinV буфера для связывания, спин вниз при 300 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант и ресуспендируют в 100 мкл AnnexinV буфера для связывания </li><li> Образцы пятен с 1 мкл AnnexinV FITC и 5 мкл 7-AAD в течение 10-15 минут при комнатной температуре, промывают 1 мл AnnexinV связывающего буфера; спин вниз при 300 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант апд ресуспендируют в 250 мкл буфера для связывания AnnexinV </li><li> Немедленно прочитаны образцы на проточном цитометре. </li><li> Подготовьте следующие образцы для определения антиген-специфическую убийство по KaAPC: только Т-клеток; Т-клетки + растворимый анти-CD95; Т-клетки + выгружен KaAPC; Т-клетки + не-родственные пептид загружалась KaAPC; Т-клетки + родственно пептид загружалась KaAPC; Т-клетки + супернатант родственного пептида загружалась KaAPC. </li></ol><img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> . Рисунок 2 KaAPC убивать анализа пептида загружалась KaAPC или контрольные шарики (HLA-A2-Ig только шарики) культивировали в течение 48 ч при соотношении 1: 1 с CMVpp65 специфических Т-клеток (~ 80%), собирают и затем окрашивают AnnexinV и пропидийиодида (PI) для определения апоптоза методом проточной цитометрии (смотрите раздел протокол 3,3-3,7). &quot;родственно&quot; относится к бисера загружалась с CMVpp65 и &quot;не-родственным&quot; бытьобъявления нагруженные Mart-1 пептида. Цифры указывают процент жизнеспособных Т-клеток в левом нижнем квадранте каждого участка. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <ol start="9"><li> Для выполнения крест-накрест-эксперименты, генерации антиген-специфических Т-клеток двух различных особенностей. </li><li> Кроме того оценить антиген-специфических обеднения способности KaAPC с одновременным анализом антиген-специфического устранения Т-клеток в Т гетерогенной клеточной популяции. (Для детального протокола смотрите Шютц и др. 10). </li></ol>

<ol>
	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CS и MF нечего раскрывать. По лицензионному договору между NexImmune и Университета Джонса Хопкинса, д-ра. Шнек и Oelke имеют право на акции роялти, полученных в университете по продажам AAPC продуктов, описанных в этой статье. Им также принадлежит NexImmune запас, который при соблюдении определенных ограничений по политике университета. Доктор Шнек является членом компании &quot;Совет директоров и Научно-консультативного совета. Условия этого соглашения в настоящее время управляется университета Джона Хопкинса в соответствии с его конфликта интересов политики.

Наиболее важным шагом в протоколе является обеспечение соответствующего соотношения сигнал 1 (пептида МНС) и сигнала 2 (анти-Fas МАБ). Мы провели интенсивные эксперименты титрования определить идеальное соотношение для сигнала 1 и 2; стало очевидно, что минимальные изменения в связи с различиями в HLA-A2 Ig димера или анти-Fas концентрации МАБ может нарушать нормальное функционирование в KaAPC. Таким образом, концентрация обоих сигналов всегда должны быть проверены и качество обоих белков должны быть проверены часто, даже если он был заказан из коммерческого источника. Кроме того, концентрации всегда должно быть определено том же анализе, поскольку различные анализы обнаружения может привести к различной концентрации. Функциональные возможности HLA-A2-Ig также может быть нарушена вследствие неполного повторной укладки и / или неэффективной пептида нагрузки. Кроме того димера молекулы могут агрегировать в разной степени, которые могут оказывать влияние на функциональную активность белка. Поэтому, кималь количество димера, необходимое для генерации конкретного функционального и KaAPC может изменяться. Кроме того, мы обнаружили, что идеальный диапазон для смерти, вызывающего сигнала анти-Fas МКА на KaAPC крайне туго. В наших руках количествах больше 3,64 мкг / мл приводит к неспецифической убийства Fas позитивных Т-клеток, а количество ниже 3,64 мкг / мл привело дозы в зависимости снижения активности убийства. Хотя эти условия кажутся довольно плотно, внимание на эти детали будут приводить к образованию функционального и конкретной KaAPC. Хотя в настоящее время фенотип KaAPC функционально истощения активированных антиген-специфических Т-клеток, первоначальных экспериментов, направленных на наивных или отдыхая антиген-специфичные Т-клетки не показали значительное индукцию антиген-специфической апоптоза как эти группы населения сократили выражение ФАС. Поэтому, можно предположить добавления дополнительных стимулирующих сигнал на KaAPC индуцировать регуляцию Fas на покоящихся Т-клеток, чтобы сделать превратить ихв мишень для KaAPC. В то время как это возможно все три сигнала должны быть тщательно титруют, чтобы обеспечить функциональную фенотип KaAPC. Регулировка борта платформы для биосовместимого или биоразлагаемого матрицы повысит KaAPC в естественных условиях применимости. Недавно, Шен и др. Сообщили успешным в использовании естественных условиях KaAPC используя 5 латексные мкм бусы конъюгированных с анти-Fas (клон JO2) и анти-Его / H2-K б -TRP2 11. Мы смогли показать, что общая концепция искусственных антиген-представляющих клеток (AAPC) могут быть успешно переведены из мкм размер, чтобы нм размера частиц 12 и что функциональность зависит от геометрии частиц 13. Таким образом, путем изменения размера и / или формы будущего KaAPC конструкций можно было бы быть в состоянии повлиять на функциональность в естественных условиях и био-распределения, которая может стать ключом для успешного лечения органов конкретных аутоиммунных заболеваний. <p cдевушка = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC преодолеть основные недостатки клеток на основе стратегий истощения как простой в использовании &quot;с полки&quot;, времени и экономически эффективным подходом, который не зависит от состояния доноров и предварительной обработки. KaAPC не являются мишенями из само- или паракринного сигнализации убийства и не чувствительны к цитолитических эффекторных функций CTL. KaAPC потребует идентификации соответствующего антигена болезни и полагаться на их конкретного типа HLA. В то время как в настоящее время многочисленных подходящих HLA-A2 ограниченных антигенов для лечения диабета 1 типа, GvHD и кратные склероз были выявлены 2, развитие дополнительного класса HLA я димера молекул, а также продолжающуюся идентификацию новых аутоиммунных соответствующих антигенов приведет к дальнейшему увеличению и расширения применимости KaAPC. Кроме того можно было думать об использовании KaAPC направленную на различных эпитопов целевой несколько антигенов одновременно. Таким образом, KaAPC представляют собой гибкую технологическую платформу дляTigen конкретных истощение Т-клеток. Их &quot;лего-как&quot; природа позволяет включение новых сигналов, таких как дополнительные костимулирующих или тормозящих сигналов, таких как ФД1 или TRAIL на различных матрицах, которые могли бы расширить и повысить их последующее в пробирке и в естественных условиях применимости. Здесь мы представляем протокол шаг за шагом, чтобы генерировать KaAPC, подход, основанный первый шарик в целях ликвидации антиген-специфических Т клеток из Т-клеток смесей с различными особенностями. <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> Рисунок 3 KaAPC исключить CTL в антиген-специфического образом PKH26 меченных активирована Fas + ЦТЛ эффектор-память и PKH67 меченных CMVpp65-специфических ЦТЛ из того же донора смешивают в соотношении 1:. Соотношении 1 и совместно культивировали с CMVpp65 KaAPC в течение 48 часов. Контрольные культуры обрабатывались с выгружается KaAPC, или 1 мкг / млрастворимого анти-Fas-МКА (клон CH11). Минимальные потери жизнеспособных клеток было определено в необработанных смешанных культур CTL (T Mix). Исходные данные FACS для каждой популяции CTL микса T показаны. Анализ апоптоза проводили, как описано ранее на отдельной стробирования на обеих популяций Т-клеток 10. Номера, изображенные в верхнем левом квадранте представляет% от общего числа клеток. Иллюстрирующая цифра получена из одного репрезентативного эксперимента из трех независимых экспериментов. Это исследование было первоначально опубликовано в крови. . Шютц, С. и др Убийца искусственные антиген-представляющих клеток: новая стратегия для удаления специфические Т-клетки крови.. 2008; 111, 3546-52. Copyright Американского общества гематологии. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

За последние два десятилетия значительный прогресс был достигнут в понимании патогенетические механизмы аутоиммунных заболеваний. Тем не менее, наиболее распространенные методы лечения все еще ​​полагаются на кортикостероиды, а также иммуносупрессивных препаратов, таких как аналоги пурина, алкилирующих агентов и ингибиторов кальциневрина 1. Использование таких препаратов значительно улучшить прогноз у больных, пока лечение не обеспечивает лечение лежащего в основе иммунологической неисправности. Кроме того, пациенты становятся уязвимыми к инфекциям и развитию рака. Таким образом, конечной целью для лечения опосредованных Т-клеток аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантата является специально предназначены только болезнетворные Т-клетки, и в то же время, в результате чего оставшийся нетронутым иммунную систему и компетентным, чтобы бороться иммунологических нарушений. Использу антиген-представляющих клеток (АРС) в качестве лечения для подавления периферических Т-клеточные реакции был впервые описан в начале1970-е годы несколько групп. С тех пор множество подходов на основе клеток были разработаны (обзор в Schütz и соавт. 2). Стратегии, использующие FasL-выражения убийца-APC как иммунорегуляторные клетки показали многообещающие результаты, указывающие терапевтический потенциал для лечения аутоиммунных заболеваний, отторжения трансплантата и хронических инфекций. Тем не менее, существуют значительные ограничения в стратегии с использованием FasL Killer-APC, которые в конечном счете ограничивается их клиническое применение; (Я) поколение или изоляция APC время, трудовых и временных затрат (II) пациенты, страдающие от цитопении вследствие иммуносупрессии предоставить ограниченное количество и качество клеток (III) покрытие или трансдукция APC с апоптоз сигналов, таких как результаты FASL в высоко переменных фенотипы и (IV) Убийца-APC чувствительны к цитотоксическим эффекторные функции Т-клеток как следствие, сокращает их терапевтический потенциал. Таким образом, трудно гарантировать определенную воспроизводимость Killer-APC Phenoтип, который может быть использован для антиген-специфической модуляции Т-клеточные ответы в естественных условиях. На основании нашей предыдущей работе с FasL выражающей Killer-APC 3-5 и искусственные антиген-представляющих клеток (AAPC) 6,7 мы разработали шарик подхода (KaAPC) для антиген-специфической торможения или ликвидации авто-реактивных Т-клеток в пробирке. KaAPC состоят из HLA-A2-Ig-димера (сигнал 1) и анти-Fas мАт (апоптоз) сигнала, ковалентно иммобилизованы на поверхности парамагнитного латексного шарика 4,5 мкм. Они истощают антиген-специфических Т-клеток в Fas / FasL опосредованно от Т-клеточных культурах нескольких особенностей в антиген-специфическим образом и не зависит от активации индуцированной гибели клеток (AICD) пути. Доза зависит апоптоз в целевых Т-клеток быстро индуцируется уже через 30 мин 8. KaAPC может быть легко сгенерирована контролируемым образом обеспечивая определяется с полки phenotип и преодолеть большинство недостатков сотовых основе стратегий истощения. Следовательно, KaAPC отображения большой потенциал для лечения Т-клетки аутоиммунные заболевания и отторжения трансплантата, продвижении поле конкретных стратегий лечения Т-клеточных.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

Современное лечение Т-клетки аутоиммунные заболевания в основном зависит от стратегии глобальной иммуносупрессии, которая, в долгосрочной перспективе, сопровождается неблагоприятными побочными эффектами, такими как снижение способности контролировать инфекции или злокачественные опухоли. Поэтому, новые подходы должны быть разработаны, что цель только болезни посредником клетки и оставить излишнее иммунную систему без изменений. За последнее десятилетие различные клеточные основе стратегий иммунотерапии для модуляции Т-клеточные иммунные ответы были разработаны. Большинство из этих подходов рассчитывать на толерантность индукции антиген-представляющих клеток (АРС). Тем не менее, в дополнение к тому, технически трудным и громоздким, такие подходы на основе клеток весьма чувствительны к цитотоксическим Т-клеточные ответы, что ограничивает их терапевтический потенциал. Здесь мы приводим протокол для генерации непористые убийцы искусственных антигенпрезентирующих клеток (KaAPC), что позволяет истощения патологических Т-клеток, оставляя реостающие иммунная система нетронутыми и функциональным. KaAPC является альтернативным решением для сотовой иммунотерапии, которая имеет потенциал для лечения аутоиммунных заболеваний и отторжение аллотрансплантата путем регулирования нежелательных Т-клеточные реакции в антигенспецифического моды.

Особенности этого протокола включают определенных поколение фенотипа KaAPC который отображает HLA-A2-Ig (сигнал 1) и анти-Fas МКА (апоптоз сигнал) в то же время, что по сравнению с подходами, основанными клеток не изменяется покрытием или трансдукции полезного действия и может быть легко модулируется в процессе производства (рисунок 1). Кроме того, KaAPC, не чувствительны к цитотоксическим эффекторных функций Т-клеток и их функциональность не зависит от качества аутологичных антиген-представляющих клеток до и после в пробирке манипуляции. KaAPC способны разрушающих антиген-специфические Т-клеток в пробирке при загрузке с родственным пептида, в то время как не-родственные загружалась KaAPC не будет истощать Т-клетки (рисунок 2). Таким образом, KaAPC индуцируют апоптоз Т-клеток в антиген-специфическим образом. Впоследствии мы использовали KaAPC для селективного истощения антиген-специфических Т-клеток из смеси различных Т-клеток SPEcificities, демонстрируя, что только минимальное цитотоксичность просачивался в соседних Т-клеток (рисунок 3). Таким образом, KaAPC представляют изысканные инструмент для в пробирке антигенспецифической истощения человека активируется антиген-специфических Т клеток с потенциалом клинической применимости для лечения аутоиммунных заболеваний и отторжение аллотрансплантата.

Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Руководство представлены для генерации убийцы искусственного антигенпредставляющих клеток, KaAPC, эффективным инструментом для истощения в пробирке человеческих антиген-специфических Т клеток и альтернативного решения сотовой иммунотерапии для лечения Т-клеточного аутоиммунных заболеваний в антиген конкретного способа без ущерба оставшуюся иммунную систему.

Убийца Искусственный антигенпредставляющих клеток (KaAPC) для эффективного<em&gt; In Vitro</em&gt; Истощение человека антиген-специфических Т-клеток

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Антиген Конкретные В Vivo Убийство методом с использованием меченых клеток CFSE Целевая

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig основе искусственного антиген представляющих клеток для эффективного Исключая виво Расширение прав CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Искусственные антигенпрезентирующей клетки (AAPC) Активация опосредованной и расширение естественных клеток-T убийца

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Клиническое применение<em&gt; Спящая красавица</em&gt; И искусственный антиген-представляющие клетки генетически модифицировать T клеток из периферической и пуповинной крови

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Разработка Антиген-ведомой колита моделью для изучения Презентация антигенами путем антигенпрезентирующих клеток, Т-клеткам

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

порождающий<em&gt; De Novo</em&gt; Антиген-специфический человеческий Т-клеточный рецепторам трансдукции ретровирусных Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Развитие стволовых клеток, полученных из антиген-специфических регуляторных Т-клеток против аутоиммунитета

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Обнаружение и обогащение редких антиген-специфических B Клетки для анализа фенотипа и функции

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

В естественных условиях Assay для обнаружения антиген специфические Т-лимфоцитов цитолитического функции с помощью вакцинации модели

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Поколение дискриминационных человеческих моноклональных антител от редких антиген специфические клетки, циркулирующие в крови

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...