Name: killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells
Uploaded: 2014-08-11T19:00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Detta arbete har stöd av den tyska Research Foundation (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) och KFO 146 (MF), DOD försvarsdepartementet bidrags PC 040.972 (MO) och National Institute of Health ger RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)

1 Generering av HLA-A2-IG Baserat KaAPC <ol><li> Förbered steril boratbuffert. Lägg till en 0,1 M lösning av borsyra i vatten och justera pH till 7,0. Sterilfiltrera (0,22 | im) buffert och förvaras vid 4 ° C. </li><li> Förbered steril vulst tvättbuffert. Använd fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan magnesium och kalcium. Lägg humant AB-serum för 3% slutkoncentration. Lägg etylendiamintetraättiksyra (EDTA) för 2 mM slutlig koncentration. Lägg natriumazid (NaN 3) för 0,01% slutkoncentration. Sterilfiltrera (0,22 | im) buffert och förvaras vid 4 ° C. </li><li> Överför 250 l av epoxi pärlor (ca 100 x 10 6 pärlor) från lager i en steril, skruvlock glasflaska. </li><li> Lägg 250 | il boratbuffert. </li><li> Placera glasflaska på en magnet och låta pärlorna vidhäfta under 2 min; aspirera buffert och ta bort glasflaska från magneten. </li><li> Tvätta pärlor gång med 1 ml boratbuffert. </li><li> Återsuspendera pärlorna i 550 pl av 0,018 ^ g/ Ml HLA-A2-Ig och 3,64 ng / ml anti-human CD95 mAb (klon CH11) och blanda försiktigt genom skakning. (Se diskussionen avsnitt för ytterligare information.) </li><li> Inkubera glasampuU på en rotator ände över ände, vid 4 ° C under 24 tim. </li><li> Centrifugera ner pärlor vid 300 xg under 2 min. </li><li> Placera glasflaska på en magnet för 2 min och aspirera &quot;KaAPC laddningslösning&quot;; ta bort glasflaska från magneten, tillsätt 1 ml pärla tvättbuffert och slamma noga genom att skaka. </li><li> Upprepa steg 1,10 två gånger. </li><li> Inkubera glasampuU på en rotator vid 4 ° C under 24 h i 1 ml kula tvättbuffert. Vid denna punkt, kommer all kvarvarande proteinbindningsställen blockeras av humant AB-serum innehöll i pärlan tvättbuffert. </li><li> Centrifugera ner pärlor vid 300 xg under 2 min. </li><li> Placera glasflaska på en magnet för 2 min och aspirera vulst tvättbuffert; ta bort glasflaska från magneten och ersätta lösningen med 1 ml PBS. </li></ol> 2 Kvalitetskontroll, peptid Laddar, Wföraskning, lagring och stabilitet KaAPC <ol><li> Överför 1,5 x 10 5 KaAPC till ett FACS-rör och tvätta med 1 ml FACS-tvättbuffert. </li><li> Återsuspendera pärlorna i 100 | il FACS-tvättbuffert och tillsätt 1 pl av anti-mus-lgG1 PE (för detektering av Fc-delen av HLA-A2-Ig) och 1 | il av anti-mus-IgM-FITC (klon R6-60.2, för detektion av anti-human CD95 mAb). </li><li> Inkubera under 15 minuter vid 4 ° C, tvätta med 1 ml FACS-tvättbuffert, och återsuspendera i 250 | il FACS-tvättbuffert och läs-färgning genom flödescytometri. </li></ol><img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1 QC fläck av en KaAPC sats gjord såsom anges i protokollet avsnittet. Färgning utfördes enligt beskrivningen i protokoll avsnitt 2 HLA-A2-Ig detekterades med hjälp av en anti-mus-IgG 1 PE mAb, medan anti-human-CD95 (anti-Fas) detekterades med ett anti-mus-IgM-FITC-mAb (se protokoll SOÅtgärd 2.2) (blå linje). Fyllda svarta Bilden representerar tomma pärlor färgade med anti-mus-IgG 1 PE mAb eller anti-mus-IgM FITC mAb, respektive. Siffror i övre högra hörnet visar den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <ol start="4"><li> För peptidladdningsöverföring 20 x 10 6 KaAPC till en ny steril flaska glas, lägg på en magnet för 2 minuter, aspirera PBS och resuspendera pärlor i 500 l färska PBS med 5 mikrogram peptid (Tänk bara HLA-A2 begränsade peptider kommer binda till dimeren!). </li><li> Store laddad KaAPC vid 4 ° C fram till användning, under minst 3 dagar för att ge tillräcklig peptid lastning på HLA-A2-Ig dimer. </li><li> Omedelbart före användning, tvätta peptiden laddad KaAPC som anges i 1.14; Upprepa detta steg minst 6x. OBS: Detta är ett avgörande steg för att se till att fri peptid har to tas bort helt för att undvika falska positiva dödande resultat; återstående fria peptiden har visats inducera apoptos i antigen-specifika T-cellkulturer 9. För att utesluta en löslig peptid effekt, kör överstående kontrollprover av peptid laddad och tvättas KaAPC (se 3.8). </li><li> Räkna pärlor använder hemocytometer och etikett med datum, namn på peptid och koncentration. OBS: Laddad KaAPC vara funktionella vid 4 ° C under minst en månad. Efter en månad, omlastning med samma peptid gör KaAPC att utnyttjas i upp till ett år. </li></ol> 3 KaAPC in vitro Killing analysen <ol><li> Förbered co-odlingsmedier. Förbered komplett RPMI-medium kompletterat med 3% T-cellstillväxtfaktor (gjord i labbet 6) och 3% donator autolog plasma. Om givaren autolog plasma är tillgänglig kan du använda värmeinaktiv humant AB-serum. </li><li> Förbered AnnexinV bindningsbuffert beredning. Lös 8,12 g natriumklorid (NaCl) och 0,12 g calcium klorid (CaCl 2) i 990 ml DDH 2 O.Add 10 ml 1 M HEPES-buffert. </li><li> Generera humana antigenspecifika T-celler. (För en detaljerad protokoll se en tidigare publikation 7 utnyttjar artificiella antigenpresenterande celler (AAPC)). Se till att peptid specificitet är minst&gt; 75% bestämt med tetramer färgning. </li><li> För varje prov inkubera 2 x 10 5 antigenspecifika T-celler / brunn (i en 96 brunnars rundbottenplatta) i 200 pl av sam-odlingsmedium vid en 1: 1-förhållande med KaAPC för 48 h i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2. </li><li> Harvest prover och överför till en FACS-rör; tvätta med 1 ml AnnexinV bindningsbuffert, spinn ner vid 300 xg under 5 minuter, släng supernatanten och återsuspendera i 100 pl av AnnexinV bindningsbuffert </li><li> Stain prover med 1 pl AnnexinV FITC och 5 ^ 7-AAD i 10-15 min vid RT, tvätta med 1 ml AnnexinV bindningsbuffert; spinn ner vid 300 xg under 5 minuter, kassera supernatanten end återsuspendera i 250 | il AnnexinV bindningsbuffert </li><li> Läs prover omedelbart flödescytometer. </li><li> Förbered följande prover för att bestämma antigenspecifika dödande av KaAPC: endast T-celler; T-celler + löslig anti-CD95; T-celler + lossas KaAPC; T-celler + icke-besläktade peptid laddad KaAPC; T-celler + besläktat peptid laddad KaAPC; T-celler + supernatant av besläktat peptid laddad KaAPC. </li></ol><img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> . Figur 2. KaAPC dödande assay Peptid laddad KaAPC eller kontrollkulor (HLA-A2-Ig enbart pärlor) odlades under 48 h vid en 1: 1-förhållande med CMVpp65 specifika T-celler (~ 80%), skördades och färgades därefter med AnnexinV och propidiumjodid (PI) för att bestämma apoptos med flödescytometri (se protokoll avsnitt 3,3-3,7). &quot;cognate&quot; avser pärlor laddade med CMVpp65 och &quot;icke-cognate&quot; att varaannonser laddade med Mart-1-peptiden. Siffrorna anger andelen livsdugliga T-celler i nedre vänstra kvadranten av varje tomt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <ol start="9"><li> För att utföra korsmönster-experiment, generera antigenspecifika T-celler från två olika specificiteter. </li><li> Ytterligare utvärdera antigenspecifika utarmnings-förmågor av KaAPC med en samtidig analys av antigen-specifik eliminering av T-celler i heterogen T-cell population. (För en detaljerad protokoll se Schütz et al. 10). </li></ol>

<ol>
	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CS och MF har inget att lämna ut. Enligt ett licensavtal mellan NexImmune och Johns Hopkins University, Drs. Schneck och Oelke har rätt till aktier av royalty som inkommer till universitetet på försäljning av AAPC produkter som beskrivs i den här artikeln. De äger också NexImmune lager, vilket är föremål för vissa begränsningar enligt University policy. Dr Schneck är medlem i bolagets &quot;styrelse och vetenskapliga råd. Villkoren för detta arrangemang hanteras av Johns Hopkins University i enlighet med dess intressekonfliktpolitik.

Det mest kritiska steget i protokollet är att säkerställa en lämplig förhållandet mellan signal 1 (peptid MHC) och signal 2 (anti-Fas mAb). Vi har utfört intensiva titreringsexperiment att definiera den perfekta förhållande för signal 1 och 2; det blev uppenbart att minimala variationer på grund av skillnader i HLA-A2 Ig dimer eller anti-Fas mAb koncentrationer kan störa funktionaliteten i KaAPC. Sålunda bör alltid verifieras koncentrationen av båda signalerna och kvaliteten på både proteiner bör regelbundet testas, även om det beställdes från en kommersiell källa. Dessutom bör koncentrationerna alltid att bestämmas av samma analys som olika detektionsanalyser kan resultera i olika koncentrationer. Funktionalitet för HLA-A2-Ig kan också vara nedsatt på grund av ofullständig veckning och / eller ineffektiv peptid lastning. Dessutom dimer molekyler kan aggregera till olika grader, vilket skulle kunna påverka den funktionella aktiviteten hos proteinet. Därför actual mängden dimer som behövs för generering av en funktionell och specifik KaAPC kan variera. Dessutom fann vi att det önskade området för döden inducera signalen anti-Fas mAb på KaAPC är mycket snävt. I våra händer mängder större 3,64 mikrogram / ml leda till ospecifik dödandet av Fas positiva T-celler medan mängder under 3.64 g / ml resulterade i en dos-beroende minskat dödande aktivitet. Även om dessa förhållanden verkar ganska tight, kommer uppmärksamma dessa uppgifter leda till uppkomsten av en funktionell och specifik KaAPC. Medan den nuvarande KaAPC fenotypen är funktionell för utarmning av aktiverade antigenspecifika T-celler, initiala experiment riktar naiva eller vilande antigenspecifika T-celler visade ingen signifikant induktion av antigenspecifik apoptos som dessa populationer har minskat Fas uttryck. Därför kan en envision tillsats av en samstimulerande signal på KaAPC att inducera uppreglering av Fas på vilande T-celler att aktivera demin ett mål för KaAPC. Även om detta är genomförbart alla tre signaler måste titreras noggrant för att säkerställa en funktionell KaAPC fenotyp. Justering vulsten plattform till ett biokompatibelt eller biologiskt nedbrytbar matris kommer att förbättra KaAPC in vivo tillämpbarhet. Nyligen, Shen et al. Har rapporterat en framgångsrik in vivo-användning av KaAPC utnyttja 5 um latexpärlor konjugerade till anti-Fas (klon Jo2) och anti-His / H2-K b -TRP2 11. Vi har kunnat visa att det allmänna begreppet artificiella antigenpresenterande celler (AAPC) kan framgångsrikt överföras från um dimensionerad för att nm stora partiklar 12 och att funktionaliteten påverkas av partikelgeometri 13. Således, genom att variera storlek och / eller form av framtida KaAPC designs man skulle kunna påverka den in vivo funktionalitet och bio-distribution, som kan vara nyckeln till framgångsrik behandling av organspecifika autoimmuna sjukdomar. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC vinna de stora bristerna i cellbaserade utarmning strategier som ett lättanvänt &quot;från hyllan&quot;, tid och kostnadseffektiv metod som är oberoende av givar tillstånd och förbehandling. KaAPC inte mål för själv eller parakrint dödande signalering och inte känslig för cytolytiska effektorfunktioner av CTL. KaAPC kräver identifiering av den relevanta sjukdomen antigen och lita på deras specifika HLA-typ. Även idag många lämpliga HLA-A2 begränsade antigener för typ 1-diabetes, har GvHD och multiplar skleros identifierats 2, utveckling av ytterligare HLA klass I dimer molekyler samt den pågående identifiera nya autoimmuna relevanta antigener kommer att öka och bredda tillämpningen av KaAPC. Dessutom skulle man kunna tänka på att använda KaAPC riktas mot olika epitoper att rikta flera antigener samtidigt. Sammanfattningsvis KaAPC representera en flexibel plattform teknik för entigen-specifika T-cellstömning. Deras &quot;lego-liknande&quot; naturen gör att nya signaler såsom ytterligare samarbete stimulerande eller hämmande signaler såsom PD1 eller objekt på olika matriser, som skulle kunna bredda och förbättra deras senare in vitro och in vivo tillämpbarhet. Vi presenterar häri den steg-för-steg-protokoll för att generera KaAPC, den första vulsten baserad strategi för elimineringen av antigenspecifika T-celler från T-cell-blandningar med olika specificiteter. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3. KaAPC eliminera CTL på ett antigenspecifikt sätt PKH26-märkta aktiverade Fas + effektor-minnes-CTL och PKH67-märkta CMVpp65-specifik CTL från samma donator blandades till en 1:. Ett förhållande och samodlades med CMVpp65 KaAPC för 48 timmar. Kontrollkulturer behandlades med obelastad KaAPC, eller 1 pg / mllösligt anti-Fas-mAb (klon CH11). Minimal förlust av livsdugliga celler bestämdes i obehandlade blandade CTL-kulturer (T-blandning). Original FACS data för varje CTL population av T mix visas. Analys av apoptos utfördes som tidigare publicerats av separata gating både T-cellpopulationer 10. Siffror som avbildas i den övre vänstra kvadranterna representerar% av totala celler. Den illustrerar Siffran kommer från ett representativt experiment av tre oberoende försök. Denna forskning publicerades ursprungligen i blod. . Schütz, C. et al Killer artificiella antigenpresenterande celler: en ny strategi för att ta bort specifika T-celler Blood.. 2008, 111, 3546-52. Upphovsrätt American Society of Hematology. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Under de senaste två decennierna har stora framsteg gjorts när det gäller att förstå de patogena mekanismerna hos autoimmuna sjukdomar. Men de vanligaste behandlingarna fortfarande är beroende kortikosteroider samt immunosuppressiva läkemedel såsom purinanaloger, alkylerande medel och kalcineurinhämmare 1. Användningen av sådana läkemedel har förbättrat prognosen för patienter, men behandlingen inte ger ett botemedel på den underliggande immunologiska fel. Dessutom patienter blir utsatta för infektioner och utveckling av cancer. Därav det yttersta målet för behandling av T-cellsmedierade autoimmuna sjukdomar och allograftavstötning är att särskilt inrikta enda sjukdom som orsakar T-celler medan, samtidigt, lämnar återstående immunförsvar orörd och kompetent att slåss immunologiska sjukdomar. Utnyttja antigenpresenterande celler (APC) såsom en behandling för att undertrycka perifera T-cellsvar revs först så tidigt som1970-talet med flera grupper. Sedan dess har många cellbaserade metoder har utvecklats (över i Schütz et al. 2). Strategier som använder FasL uttrycker killer-APC som immunreglerande celler visade lovande resultat som indikerar terapeutisk potential för behandling av autoimmunitet, allograftavstötning och kroniska infektioner. Det finns dock betydande begränsningar med strategier som utnyttjar FasL Killer-APC som i slutändan har begränsat deras kliniska tillämpning; (I) produktion eller isolering av APC är tid, arbete och kostnadskrävande (ii) patienter som lider av cytopeni grund av immunosuppression ger begränsade belopp och kvalitet celler (iii) beläggning eller transduktion av APC med apoptos inducerande signaler såsom FasL ger mycket variabla fenotyper och (iv) Killer-APC är känsliga för cytotoxisk effektorfunktioner av T-celler därmed minska deras terapeutiska potential. Därför är det svårt att garantera en definierad reproducerbar Killer-APC fenotyp, som kan utnyttjas för antigen-specifik modulering av T-cellsvar in vivo. Baserat på vår tidigare arbete med FasL uttrycker Killer-APC 3-5 och artificiella antigenpresenterande celler (AAPC) 6,7 utvecklade vi en pärla baserad metod (KaAPC) för antigenspecifik hämning eller eliminering av autoreaktiva T-celler i vitro. KaAPC bestå av en HLA-A2-Ig-dimer (signal 1) och en anti-Fas mAb (apoptosinducerande signal) kovalent immobiliserad på en yta av ett 4,5 | im paramagnetisk latexpärla. De utarma antigenspecifika T-celler i ett Fas / FasL-medierad mode från T-cellkulturer av multipla specificiteter i ett antigenspecifikt sätt och oberoende av aktiveringen inducerad celldöd (AICD) reaktionsvägen. Dosberoende apoptos i riktade T-celler induceras snabbt redan efter 30 min 8. KaAPC lätt kan alstras på ett kontrollerat sätt säkerställer en definierad från hyllan phenotYP och övervinna de flesta av bristerna i cellbaserade utarmningsstrategier. Följaktligen KaAPC visar stor potential för behandling av T-cellsmedierade autoimmuna sjukdomar och allograftavstötning, avancera inom T-cellspecifika behandlingsstrategier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

Nuvarande behandling av T-cellsmedierade autoimmuna sjukdomar bygger mestadels på strategier för global immunsuppression, vilket på lång sikt, åtföljs av negativa biverkningar, såsom en minskad förmåga att kontrollera infektioner eller maligniteter. Därför nya metoder behöver utvecklas som endast rikta den sjukdoms medla cellerna och lämna resterande immunförsvar intakt. Under det senaste decenniet en mängd cellbaserad immunoterapi strategier för att modulera T-cellmedierade immunsvar har utvecklats. De flesta av dessa metoder är beroende av toleransframkallande antigenpresenterande celler (APC). Men förutom att vara tekniskt svårt och besvärligt, sådana cellbaserade metoder är mycket känsliga för cytotoxiska T-cellssvar, vilket begränsar deras terapeutiska kapacitet. Här presenterar vi ett protokoll för generering av icke-cellulär mördar artificiella antigenpresenterande celler (KaAPC), vilket medger uttömning av patologiska T-celler medan de lämnar reåterstående immunförsvar orörd och funktionella. KaAPC är en alternativ lösning till cellulär immunterapi, som har potential för behandling av autoimmuna sjukdomar och allograft-avstötningar genom kontroll av oönskade T-cellsvar på ett antigen-specifikt sätt.

Funktionerna i detta protokoll omfattar definierade generationen av en KaAPC fenotyp som visar HLA-A2-Ig (signal 1) och anti-Fas mAb (apoptos signal) på samma gång, vilket i jämförelse med cellbaserade metoder inte förändras genom beläggning eller transduktion effekter och kan lätt moduleras under produktion (Figur 1). Vidare KaAPC, är inte känsliga för cytotoxiska effektorfunktioner av T-celler och deras funktionalitet är inte beroende av kvaliteten av autologa antigenpresenterande celler före och efter in vitro-manipulation. KaAPC är kapabla nedbrytande antigenspecifika T-celler in vitro när den är lastad med cognate peptid, medan icke-besläktat laddad KaAPC kommer inte utarma T-celler (Figur 2). Därför KaAPC inducera T-cell apoptos i ett antigen-specifikt sätt. Därefter använde vi KaAPC för selektiv utarmning av antigenspecifika T-celler från en blandning av olika T-cell-specicificities, som visar att endast minimal cytotoxicitet läckte in i grann T-celler (Figur 3). Således KaAPC utgör en utsökt verktyg för in vitro-antigenspecifik utarmning av mänskliga aktiverade antigenspecifika T-celler med potential klinisk tillämpbarhet för behandling av autoimmuna sjukdomar och allograft avslag.

Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Riktlinjer presenteras för generering av mördaren artificiella antigenpresenterande celler, KaAPC, ett effektivt verktyg för in vitro utarmning av humana antigenspecifika T-celler och en alternativ lösning på cellulär immunterapi för behandling av T-cellsmedierade autoimmuna sjukdomar i en antigen specifikt sätt utan att kompromissa med de återstående immunsystem.

Killer Artificiell antigenpresenterande celler (KaAPC) för effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Utarmning av humant antigen-specifika T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigenspecifikt In Vivo Killing analysen med CFSE Märkta målceller

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-IG Baserat Konstgjord antigenpresenterande celler för effektiv Ex vivo Utbyggnad av mänskliga CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Konstgjord antigenpresenterande cell (AAPC) medierad aktivering och utbyggnad av naturliga mördarceller T

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinisk tillämpning av<em&gt; Törnrosa</em&gt; Konstgjord och antigenpresenterande celler för att genetiskt modifiera T celler från perifert och navelsträngsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Utveckling av ett antigen-driven kolit modell för att studera Presentation av antigener genom antigenpresenterande celler till T-celler

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Alstrande<em&gt; De Novo</em&gt; Antigenspecifika Human T-cellreceptorer från Retroviral Transduction av Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Utveckling av stamcellshärledda antigen-specifika regulatoriska T-celler mot autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detection och anrikning av sällsynta antigenspecifika B-celler för analys av Fenotyp och funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test för påvisande av Antigen-specifika T-cell cytolytisk funktion använder en Vaccination modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generation av diskriminerande humana monoklonala antikroppar från sällsynta Antigen-specifika B-celler som cirkulerar i blodet

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...