Name: isolation of murine valve endothelial cells
Uploaded: 2014-08-21T16:00:00
Duration: 9 min 34 s
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Damos las gracias a la Universidad Estatal de Ohio Centro Integral del Cáncer Analítica Citometría de instalación, específicamente Katrina Moore, para la asistencia técnica con el análisis FACS. Además reconocemos Dr. William Pu y su grupo por sus conocimientos científicos. Este trabajo fue apoyado por el NIH HL091878 (JL) y el Centro Cardiaco del Hospital Nacional de Niños.

1 Preparación de Equipos y Soluciones <ol><li> Esterilizar las herramientas de disección - tijeras de tejidos finos para extraer corazones adultos y 2 pinzas finas para la disección de la región valvular - en autoclave en una bandeja de instrumentos cubierto. Pulverizar herramientas con 70% de etanol (EtOH) antes de la disección. </li><li> Preparar todas las soluciones inmediatamente antes del experimento y esterilizar soluciones haciéndolas pasar a través de un filtro estéril de 0,2 micras. Mantenga las soluciones en hielo hasta su uso. <ol><li> Estéril tampón de disociación (15 ml total / muestra). Combine 1.2 ml de colagenasa IV, 300 l 2,5% de tripsina y 150 l de suero de pollo. Se ajusta el volumen hasta 15 ml con solución salina equilibrada de Hank (HBSS). </li><li> Estéril Clasificación Buffer (12 ml en total). Combinar 25 l 0,5 M de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y 12 l de DNasa I (libre de RNasa). Se ajusta el volumen hasta 12 ml con HBSS. </li><li> VEC Medios de Cultivo. Gro endoteliales Mixwth medios de comunicación de acuerdo con las instrucciones del fabricante (véase el material de hoja de cálculo) mediante la adición de los componentes del kit se dividió en alícuotas de 500 ml de medio EBM2. </li><li> GFP Negativo Medios de cultivo (medios de comunicación de células no endoteliales). Mezclar 445 ml de Medio 199 1x con 5 ml de penicilina / estreptomicina (penicilina / estreptomicina) (concentración final 1%) y 50 ml de FBS (concentración final 10%). </li></ol></li></ol> 2. Disección de la región valvular de ratones adultos y embriones E14.5 <ul><li> Fueron aprobados y realizados de acuerdo con las directrices del Instituto de Investigación del Hospital del IACUC del Nationwide Children Todos los procedimientos con animales. </li><li> Ratones Tie2-GFP fueron adquiridos de Jackson Laboratories (código RS 003.658) 14 y se mantuvieron como los genotipos homocigotos en un fondo FVB / N, y por lo tanto asegurar que toda la GFP expresa fuera de la primavera en las células endoteliales Tie2-positivas. </li><li> Para la separación FACS, preparar una edad acompañados samp negativole que no contiene GFP como C57 / Bl6 para establecer los parámetros de compuerta GFP para la separación FACS. NOTA: Este protocolo y resultados representativos se basan en el uso de tres, ratones adultos de cuatro meses de edad o una camada en el día embrionario (E) 14.5. </li></ul><ol><li> Los ratones adultos: Inmediatamente después del sacrificio por el CO 2 anoxia, utilizan tijeras de disección para abrir suavemente la cavidad del pecho y exponer el corazón y los pulmones. Una vez expuesto, el corazón agarre con pinzas en las grandes arterias y alejarse del cuerpo. Retire el tejido pulmonar si intacta, y colocar el corazón en HBSS fría para enjuagar. Retire el ventrículo y alejarse de las aurículas dejar &quot;anillo&quot; del canal atrioventricular y regiones de la aorta intacta. Hacer una incisión en el lado del canal auriculoventricular de abrir el &quot;anillo&quot; y exponer las estructuras valvulares. Retire el miocardio y las regiones de la aorta proximal por burlas suavemente con unas pinzas. Identificar las valvas de la válvula como el blanco, el tejido denso sobre el miocardio rosa. Deta suavementech las cuerdas tendinosas de las válvulas auriculoventriculares y eliminar la mayor cantidad de miocardio restante que sea posible. Tenga cuidado de no tirar o raspar las valvas de la válvula durante este proceso, ya que los VEC pueden ser desalojadas. Coloque regiones valvulares recortadas en un tubo eppendorf de 1,5 ml que contiene 1 ml de HBSS y mantener en hielo. NOTA: la disección cuidadosa es fundamental para eliminar las células endoteliales no valvular que podrían contaminar la muestra. </li><li> Los embriones: Sacrificio ratones hembras 14,0 días después de que se observó enchufe cópula (mañana del tapón de la cópula = 0,5 días). <ol><li> Inmediatamente después del sacrificio, diseccionar el útero (que contiene los embriones) y lavar en frío HBSS. Diseccionar embriones individuales de útero y extraer el saco vitelino embrionario que rodea cada embrión. Quite los corazones de cada uno de los embriones y siga el paso 2.1. (NOTA: una leve presión en el embrión con una pinza justo debajo de los apéndices superiores debe ayudar para exponer el corazón y hacer más fácil la remoción.) </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Disociación celular y preparación para FACS <ol><li> Utilizando puntas de pipeta estériles, retire HBSS desde el tubo eppendorf que contiene las regiones valvulares. </li><li> Reemplazar con 1 ml de tampón de disociación y 4 l de DNasa I. </li><li> Gire los tubos a 37 ° C durante 7 minutos. </li><li> Pipeta hacia arriba y abajo 3 veces y luego dejar que la muestra se conforma con 15 seg. Recoger el sobrenadante (que contiene las células disociadas) en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Para detener la reacción colagenasa, añadir 125 l de suero de caballo al tubo de recogida. Mantener el tubo de recogida en hielo. </li><li> Repita los pasos de disociación (3.2 a 3.5) en nueve ocasiones para recoger nueve fracciones de sobrenadante. </li><li> Pasar la recogida fraccionada a través de un filtro de nylon de 70 micras en un nuevo tubo de recogida para asegurar una suspensión de células individuales mediante la eliminación de los desechos y grupos. </li><li> Haga girar la suspensión a 400 g durante 5 min para sedimentar las células. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 1 ml Clasificación Buffer ymantener en hielo hasta FACS. </li></ol> 4. FACS Ordenación GFP VEC positivo <ol><li> Establezca puertas para dispersión frontal y lateral para excluir los desechos y capturar células individuales; excluir dobletes mediante el uso de gating discriminación doblete. Registre la muestra de control negativo y definir ajustes de puerta con el fin de comparar y definir con precisión la población de células GFP-positivas en la muestra Tie2-GFP. </li><li> Analice las células GFP positivas a través de FACS y refinar ajustes de la compuerta. </li><li> Ordenar la muestra Tie2-GFP y recoger tanto las células GFP-positivas y negativas-GFP. Si se usan las células para la extracción de RNA, clasificar directamente a la Clasificación Buffer. Para células de cultivo después de FACS, recoger las células GFP positivas en un tubo estéril que contenía 1 ml de medio de VEC con 1 ml de FBS, y recoger las células negativas de GFP en 1 ml de medio no endoteliales con 1 ml de FBS. Utilice esta combinación de medios / 50% de suero de 50% para mejorar la viabilidad celular. Mantener en hielo hasta su análisis posteriores FACS. </li></ol> 5. Mensaje FACS Analysis <ol><li> La extracción de RNA: <ol><li> Inmediatamente después de FACS, las células GFP positivas y negativas centrifugar a 1500 xg durante 8 min. </li><li> Pipetear con cuidado el sobrenadante (tampón de clasificación) y deseche. </li><li> Resuspender el botón celular (pellet no es visible para los tamaños de las muestras recomendadas aquí) en 200 l Trizol. </li><li> Congelación a -80 ° C o comenzar la extracción con fenol-cloroformo estándar para aislar ARNm total, como se describe anteriormente por nuestro laboratorio 15. </li><li> Utilice 50-200 ng de ARN para la síntesis de ADNc usando la mezcla maestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Asunto ADNc para la amplificación por PCR cuantitativa utilizando sondas IDT Primetime qPCR contra marcadores de células endoteliales de ratón (CD31, factor von Willebrand (vWF)), marcadores de células intersticiales de válvula (actina de músculo liso α-(α-SMA), periostina (POSTN)), miocitos marcadores (Mhc6, Mhc7) y GAPDH. </li></ol&gt; </li><li> El cultivo de murino VEC: <ol><li> Después de la separación FACS y la recogida de células (paso 4.3), centrifugar las células a 300 xg durante 5 min. </li><li> Pipetear con cuidado el sobrenadante (clasificación tampón + medios de comunicación) y deseche. </li><li> Resuspender el sedimento de células GFP-positivas en 1 ml de medio de VEC y el sedimento-GFP negativa en 1 ml de medios de comunicación no endoteliales. </li><li> Placa de cada muestra en un pocillo de un portaobjetos de cámara de plástico y crecer hasta confluencia. Cultura durante aproximadamente 1 semana para células negativas GFP para ser confluente y más de 2 semanas para células GFP positivas para ser confluente (de una muestra de 3, ratones adultos). Cambie los medios de comunicación cada dos días. </li></ol></li><li> La tinción de inmunofluorescencia: <ol><li> Retire el medio de las células y fijar en 4% de paraformaldehído (PFA) durante 30 min a TA. Lavar las células fijadas tres veces durante 5 min cada uno en solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Retire pozos de cámara de diapositiva y bloque en suero bovino 5% de albúmina / 1x PBS durante 1 hora a RT. </li><li> Incubardiapositivas O / N a 4 ° C con anticuerpos primarios (CD31, 1: 1000 o α-actina de músculo liso (α-SMA), 1: 100). Lave 3x durante 5 minutos en PBS. </li><li> Diluir el anticuerpo secundario (Alexa-Fluor 568 cabra anti-rata) 1: 400 en PBS, añadir a las diapositivas, y se incuba 1 hora a temperatura ambiente. Lavar los portaobjetos 3x durante 5 minutos en PBS. </li><li> Monte en Vectashield que contiene DAPI e incubar 1 hora a 4 ° C antes de ver. </li></ol></li></ol>

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E., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+expression+of+collagens+during+murine+atrioventricular+heart+valve+development+and+maintenance.">Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).</li><li>Levay, A. 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Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se describe por primera vez, un nuevo método para el aislamiento de los VEC murinas embrionarias y adultas de ratones Tie2-GFP. Mientras que esta línea de ratón se ha utilizado ampliamente para el aislamiento de poblaciones de células endoteliales, este es el primer informe que muestra aislamiento selectivo de VEC. Debido a la fragilidad de la población VEC, hemos desarrollado un protocolo estricto que permite el aislamiento de células individuales de células positivas para GFP (GFP y negativo) de las válvulas del corazón de ratones embrionarios y adultos. En comparación con la publicación original usando embriones u órganos enteros de Tie2-GFP ratones 14, hemos optimizado pasos de colagenasa y disección sobre la base de la baja abundancia de esta población de células endoteliales frágil para aislar una población seleccionada de células. Aislamientos VEC sólo han sido reportados previamente en modelos animales grandes con herramientas genéticas y biomoleculares limitados. Estas herramientas están bien establecidos en ratones y, por tanto, el abidad de aislar los VEC murinos permite un conjunto ampliado de diseños experimentales que se utilizarán para la investigación de la válvula del corazón. Por lo tanto, una ventaja significativa de este enfoque es que los VEC se pueden aislar temporalmente a partir de ratones de tipo salvaje, y modelos de enfermedad de la válvula y lesiones. Una segunda ventaja es que los VEC pueden ser aislados y analizados casi inmediatamente después de la disección, la preservación de los patrones de expresión que reflejan la situación in vivo con más precisión. Además, este protocolo de aislamiento es suficiente para eliminar de cultivo celular para la expansión número y, por tanto, posibles cambios fenotípicos inducidos por el ambiente in vitro se ven impedidos. A pesar de las novedades y beneficios experimentales de este protocolo, reconocemos que todavía existen limitaciones. Primero, el tamaño de la población dentro de VEC válvulas murinos es muy pequeña y, por lo tanto, se necesitan múltiples camadas embrionarias cronometrados a fin de generar suficiente ARN para el análisis de la expresión génica. Mientras this se pueden superar usando múltiples criadores, que podría tener un impacto en la aplicación de algunas herramientas de análisis post-aislamiento. Esta limitación ha sido un reto particular para el establecimiento de cultivos confluentes de los VEC GFP-positivas con el fin de realizar análisis más exhaustivos de fenotipos VEC incluyendo perfiles moleculares y ensayos funcionales. Por lo tanto, reconocemos que no todas las dificultades han sido superadas por nuestro enfoque, pero esto es un área de interés que estamos tratando de superar. Este enfoque de aislar VEC de regiones valvulares introduce la posibilidad de contaminación a partir de células Tie-GFP-positivos, no valvular endoteliales de la endocardio, o estructuras vasculares dentro del miocardio ventricular. Hasta la fecha, la distinción molecular de VEC de otras poblaciones de células endoteliales cardíacas no han sido identificados. Sin embargo, una región potenciadora del gen NFATc1 ha sido identificado y se muestra para etiquetar específicamente VEC que no lo hacensometerse a EMT, y ninguna otra población de células endoteliales dentro del corazón 18. Como modelo Cre (NFATc1 encre) está disponible, los estudios futuros podrían utilizar la especificidad de esta línea para minimizar los riesgos de contaminación. Además de las células positivas Tie2-GFP no valvular, siempre existe la posibilidad de contaminación de miocitos en el punto donde las valvas de la válvula se unen a la región anular de la septal y paredes miocárdicas murales. En los datos no se muestran aquí, que inicialmente comenzó los estudios para aislar los VEC de regiones valvulares diseccionados usando perlas conjugadas con anticuerpos recubiertos con anti-GFP y anti-CD31. Si bien este enfoque fue un éxito para aislar las células endoteliales, hemos experimentado aglutinación celular significativa de tipos de células adyacentes, no endoteliales y por lo tanto VICs y células del miocardio contaminados nuestra muestra experimental. Esto se ha evitado el uso de análisis de FACS como se han establecido parámetros para aislar sólo suspensión de células individualess y análisis de PCR para detectar la expresión de genes específicos-miocitos ha controlado de esta limitación (Figura 3). Mientras que nuestra contaminación se puede juzgar como mínimo, sigue siendo un potencial complejidad experimental que podría evitarse en el futuro con la doble selección de buenas prácticas agrarias y los marcadores de superficie específicos de células endoteliales. El uso de este protocolo, tenemos VEC éxito aislados de ratones embrionarios y adultos y dieron ejemplos de cómo este enfoque puede ser utilizado para el aislamiento de ARN y cultivo celular de las poblaciones de células positivas y negativas GFP GFP. Sin embargo, este enfoque no se limita a estas aplicaciones y se puede utilizar para una gran variedad de enfoques moleculares, celulares y funcionales. Además, el fondo Tie2-GFP pueden ser criados con modelos de ratón genéticos que permitan estudios comparativos de poblaciones de VEC en la salud y la enfermedad. El desarrollo de esta nueva metodología, por primera vez, permitir estudios focalizadosexaminar la contribución de los VEC en el desarrollo de la válvula y el mantenimiento y podría revelar los mecanismos anteriormente menospreciados de enfermedad de la válvula dependiente del endotelio.

La válvula madura se compone de tres capas estratificadas de matriz especializada extracelular (ECM) intercaladas con células intersticiales de válvula (VIC) y encapsulado por una sola capa de células endoteliales válvulas del corazón (VEC) 1. El papel de la ECM es proporcionar todas las propiedades biomecánicas necesarias para soportar los constantes cambios en la fuerza hemodinámica durante el ciclo cardiaco. Facturación de la ECM de la válvula en la válvula de adultos está estrechamente regulada por VICs que son en gran medida de reposo y de fibroblastos-como en la ausencia de enfermedad. Además de la población VIC, las células endoteliales de la válvula cardíaca (VEC) forman un endotelio ininterrumpida sobre la superficie de las cúspides de la válvula 2. Si bien la importancia de la ECM y VICs para la estructura y función de la válvula se han descrito por nosotros y otros, el papel de los VEC es menos conocido. Sin embargo, esta población de células relativamente pequeño es crítico para la formación de la válvula en el embrión y se describe como disfuncional en la válvulaenfermedad. Formación de la válvula del corazón en el embrión comienza cuando un subconjunto de células endoteliales dentro de las regiones y del tracto de salida del canal atrioventricular someterse endotelial a la transformación mesenquimal (EMT) e hinchazones forma conocida como cojines endocárdicos 1,3. Las células mesenquimales recién transformadas dentro de estas estructuras se diferencian en más tarde VICs y forman las válvulas maduros. Una vez EMT es completa, las células endoteliales que rodean los cojines, denominados VEC, forman una capa de células endoteliales ininterrumpida que protege la válvula contra la lesión madura. Además, VEC detectan el entorno hemodinámico y se ha demostrado que molecularmente comunicarse con VICs subyacentes para regular la homeostasis 1,3 ECM. En las válvulas enfermas, la monocapa VEC se interrumpe en asociación con cambios anormales en la organización del ECM y la biomecánica alterada 4,5. Además, los estudios en modelos de ratón sugieren que la disfunción VEC es la causa subyacente de la válvula dNFERMEDAD 1,6-9. Como VEC juegan un papel importante en el desarrollo de la válvula, el mantenimiento, y la enfermedad, es importante que definamos plenamente sus fenotipos temporales con el fin de avanzar en el campo y comprender los mecanismos de la enfermedad. Anteriores trabajos de varios laboratorios han aislado con éxito los VEC de porcinos y ovinos modelos 10-12. Debido al gran tamaño de estas válvulas, a través de aislamientos limpiando y / o digestión enzimática, seguido de un número de diferentes métodos de aislamiento, incluyendo la separación de células con perlas magnéticas y de una sola célula expansión clonal ha sido eficaz para generar poblaciones puras 11-13. Sin embargo, estos modelos pueden ser restrictivo debido a la anotación de los genomas incompletos porcino y ovino que limitan la disponibilidad de herramientas moleculares, además de los altos costos. Por lo tanto la experimentación de porcino y ovino VEC después del aislamiento puede ser restrictiva. Los modelos de ratón son preferibles debido a las muchas posibilidades de manipula genética, pero hasta la fecha, no se han reportado aislamientos VEC en modelos animales pequeños ción y las herramientas moleculares en el embrión y el adulto. Esto es probablemente debido a la dificultad de trabajar con pequeñas muestras de tejido que incluyen una población de células minoría que actualmente carecen de identidad única de marcadores específicos de VEC, evitando de este modo los métodos de aislamiento basados ​​en anticuerpos. En este artículo, se presenta un nuevo método para el aislamiento directo de los VEC murinos en las etapas embrionarias y adultas. Este protocolo se aprovecha de los ratones Tie2-GFP, que expresan GFP en todos los tipos de células endoteliales y se han utilizado ampliamente para estudiar poblaciones de células endoteliales 14. Sin embargo, la novedad de este estudio es que estos ratones, por primera vez se han utilizado para aislar células endoteliales de las válvulas. Mediante una cuidadosa disección del tejido de la válvula y una serie de nueve digestiones enzimáticas seguido por la separación FACS, VEC pueden ser aislados y utilizados para diversas técnicas experimentales enINCLUYENDO extracción de ARN y la cultura, directamente después de la clasificación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>		
<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">A-11077</td>
			<td style="width:148px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:107px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:107px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">2.5% Trypsin</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:107px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:107px;">553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Chick Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16110-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">17104-019</td>
			<td>Prepared according to manufactuer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">DNase I, RNase free (10,000 Units)</td>
			<td style="width:107px;">Roche</td>
			<td style="width:107px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC3156</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">EDTA, 0.5M Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Hoefer</td>
			<td style="width:107px;">03-500-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">EGM2 SingleQuot, Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC-4176</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td style="width:107px;">Hyclone</td>
			<td style="width:107px;">SH3007103IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16050-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Hybridization Oven</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">230301V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Medium 199 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Paraformaldehyde 16% Solution EM grade</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:107px;">MP-Biomed</td>
			<td style="width:107px;">ICN1670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Permanox sterile chamber slide with cover</td>
			<td style="width:107px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:107px;">177429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">PrimeTime Mini qPCR Assay</td>
			<td style="width:107px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:107px;">Acta2 (&#945;SMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:107px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:107px;">4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">SuperScript VILO Mastermix</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">11755050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tie2-GFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">3658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tissue forceps #5 11cm</td>
			<td style="width:107px;">Dumont</td>
			<td style="width:107px;">14096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Trizol</td>
			<td style="width:107px;">Ambion</td>
			<td style="width:107px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">&#945;-SMA anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:115px;">VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:107px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine valve endothelial cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

Células Tie2-GFP co-localizar con marcadores de células endoteliales en las válvulas cardíacas embrionarias y adultas. Con el fin de confirmar la especificidad de la expresión de Tie2-GFP en VEC de ratones embrionarias y adultas, se realizó inmunofluorescencia para determinar la co-localización con el marcador de células endoteliales, CD31 en secciones de tejido preparadas a partir de E14.5 y 3 meses de edad adulta Tie2-GFP ratones utilizando métodos publicados anteriormente por nuestro laboratorio 16. Como se muestra en la Figura 1, VEC co-expresan GFP (Figura 1 A, B, E, F) y CD31 (Figura 1 C, D, E, F), tanto en adultos (Figura 1 B, D, F) y embrionario ( Figura 1 etapas A, C, E), por lo tanto, la validación de nuestro modelo para el posterior aislamiento VEC. FACS análisis identifica las poblaciones de células GFP-positivas y negativas-GFP distintas en las válvulas cardíacas embrionarias y adultas aisladas de ratones Tie2-GFP. T Salvajeipo ratones C57 / Bl6 se utilizaron para establecer los parámetros de GFP y aproximadamente el 2% de las células de un solo cerrada de ratones Tie2-GFP muestran un enriquecimiento significativo en las células positivas para GFP mediante análisis FACS en ambas muestras embrionarias y adultas (Figura 2). Basado en estudios de co-localización mostrados en la Figura 1, estas células se consideran los VEC y producen un promedio de 61.800 células totales (muestras rango de 39,000-77,000 células / muestra) en muestras de adultos (n = 3), y 8.928 células (8,015- 11.000 células / basura) de una camada de embriones E14.5. Análisis de PCR confirma enriquecimiento de marcadores de células endoteliales en células GFP-positivas y válvulas marcadores de células intersticiales en células GFP-negativos aislados de ratones Tie2-GFP. La expresión de genes de las poblaciones de células GFP positivas y negativas por qPCR siguientes FACS muestran perfiles moleculares distintos. En comparación con las poblaciones de células GFP negativas aisladas de embriones Tie2-GFP y adults, las células positivas para GFP se enriquecen para la expresión de marcadores de células endoteliales CD31 y vWF, (Figura 3). Además, la expresión de marcadores de miocitos (MYH6, MYH7) en estas poblaciones de células es muy baja, lo que demuestra una contaminación mínima de las células no endoteliales. En contraste, las células GFP negativas aisladas a partir de ratones adultos Tie2-GFP y embriones E14.5 están enriquecidas en células intersticiales (VIC) marcadores de válvulas, las células positivas α-SMA y Periostin (POSTN) relativos a GFP. Enriquecimiento de estos marcadores es mayor en las células GFP negativas aisladas de muestras E14.5 comparación con los adultos debido al fenotipo quiescente de VICs adultos y por lo tanto una baja expresión de los marcadores activados. Células GFP-positivas aisladas de ratones adultos Tie2-GFP pueden ser cultivadas in vitro. La capacidad de la cultura células positivas y negativas GFP GFP aisladas a partir de muestras de adultos se examinó la based sobre la morfología celular y tinción inmunohistoquímica. Usando los protocolos descritos anteriormente por nosotros 17 nos muestran en la Figura 4 que las células positivas para GFP aparecen redonda en la morfología (Figura 4A) y co-expresa GFP con el CD31 marcador de células endoteliales después de dos semanas en cultivo (Figura 4C). En contraste, las células no endoteliales son negativas para GFP, mostrar una morfología de tipo mesenquimal (Figura 4B) y expresar el VIC marcadores α-SMA después de nueve días (Figura 4D). <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" width="400" /> Figura 1.-Tie2 células GFP-positivas co-localizar con CD31 en las válvulas cardiacas embrionarias y adultas. Inmunofluorescencia para mostrar asociación de (Tie2-) la expresión de GFP (A, B) con el marcador de células endoteliales, CD31 (C, D) en s losfolletos eptal de la válvula mitral en E14.5 (A, C, E) y adulto (B, D, F) etapas. La región de la válvula se resalta en A, C, E. (E, F) las imágenes fusionadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. VEC Tie2-GFP-positivas pueden ser identificados por FACS. Comparado con los controles C57 / Bl6 de la misma edad (A, C), válvulas aisladas de embriones Tie2-GFP (B) y adultos (D) contienen una GFP distinta población celular positiva, como se indica en verde. Eventos-GFP negativa, que se muestran en rojo se recogieron como control. Los números entre (B) y (D) indican el% promedio de las buenas prácticas agrarias-pcélulas seropositivos, del número total de eventos ordenados por FACS (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. células GFP-positivas se enriquecen de marcadores de células endoteliales mientras que las células GFP-negativos expresan genes asociados con las células intersticiales de válvula. Representante qPCR de marcadores de células endoteliales (CD31, factor von Willebrand (vWF)) y adultos (MYH6) y fetales ( MYH7) marcadores de miocitos en células GFP-positivas aisladas de regiones valvulares de E14.5 (A) y adultos (B) ratones Tie2-GFP. Nota enriquecimiento de marcadores de células endoteliales y niveles muy bajos de genes de miocitos-asociado. (C, D) Doble changes en la expresión de marcadores de células intersticiales de válvula de α-SMA y POSTN en células GFP-negativos aislados de E14.5 (C) y adultos (D) ratones Tie2-GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. células Tie2-GFP-positivas mantienen la expresión de marcadores de células endoteliales in vitro. Siguiendo FACS, GFP positiva (A, C) y negativo (B, D) las poblaciones de células de ratones adultos fueron cultivadas hasta confluencia y sujetas a la fase de formación de imágenes de contraste (A, B) y la inmunotinción fluorescente (C, D). Células GFP-positivas expresan CD31 (rojo) (C) después de10 días de cultura. En contraste, la expresión de GFP no se detectó en la población de células negativa, que se tiñe positivo para α-SMA, un marcador de VICs activados (D).

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Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Aislamiento de las células murinas de la válvula endoteliales

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

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