Name: ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment
Uploaded: 2014-09-11T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment at JoVE.com

The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

Etik erklæring: De eksperimentelle procedurer, der beskrives i denne protokol indebærer udelukkende arbejde med Drosophila melanogaster og er ikke underlagt dyrevelfærd love i Tyskland. 1. Fremstilling af Media, værktøjer og Fluer <ol><li> Forbered modificeret kommercielt tilgængelig pulveriseret vækst i M3-medium uden kaliumbicarbonat 17. ADVARSEL: Irriterer øjne og hud. Suppler medium med 10% føtalt bovint serum, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin. Varmeinaktiverede og insekt-kultur-testet oksefosterserum for de bedste resultater. Filtreres komplette medium (herefter refereret til som medium) gennem en 0,2 um flaske-top filterenhed og opbevares i portioner ved -20 ° C. Før brug filter (0,2 um sprøjtefilter spids) mediet igen for at fjerne bundfald. </li><li> Forbered inhibitor stamopløsninger til de farmakologiske assays. Dissolve kemikalierne i passende opløsningsmiddel og butik i portioner. For eksempel forberede en stamopløsning af 28,69 mM anacardic syre (ADVARSEL: Irriterer øjnene og huden) i dimethylsulfoxid. </li><li> Forbered værktøjer til afbrydelse af dissekerede puppe testikler og dissektion af enkelte cyster. Brug to skarpe og stive nåle, snarere end en pincet. Den kapillære kraft, der udvikler sig mellem de to grene af en pincet gør dissektion af enkelte cyster i små mængder medium meget vanskeligt. For eksempel kan du bruge spidsen af ​​en rustfri stål insekt pin indsat i en podning løkke holder. </li><li> For at opnå passende alderen pupper, frø ca. 10 store kultur hætteglas (rør med diameter på 4 cm) med et tilstrækkeligt antal af voksne fluer (ca. 40-60 fluer). At analysere HP kontakten, skal du bruge fluer udtrykker H2AvD-RFP og ProtamineB-eGFP i deres endogene mønster 12,16,22. Inkubér hætteglassene under standardbetingelser ved 25, ° C i ca 4-5 dage, indtil tredje stadie larver kravle op og begynde forpupningen på væggene i hætteglas 25. </li></ol> 2. Mærkning eller Indsamling Hvid Pre-pupper får du 24-timers-gammel Pupper til Dissection <ol><li> For at teste indflydelsen af visse kemikalier på HP switch, dissekere puppe testikler ved ca 24 timers APF 12. For at få iscenesat pupper, tage den forberedte flyve kultur hætteglas med pupating larver (se afsnit 1.4) og identificere så mange hvide præ-pupper som muligt. Pre-pupper i løbet af det allerførste skridt i pupation vises som ubevægelig, ikke-fodring, snarere forkortet larver med krænget Spirakler og hvid-farvet puparium. Den puparium bliver tan-brun inden for 30 til 60 minutter, hvilket indikerer den næste fase af puppe udvikling 26. </li><li> Markere holdninger præ-pupper med en permanent markør på ydersiden af ​​hætteglassene. Inkuber hætteglas ved 25 ° C i ca 24 timer. <ol><li> Alternativtgå forud for pupper fra siden af ​​hætteglassene med en lille børste fugtet med PBS-buffer. Derefter overfører den præ-pupper til siden af en frisk 50 ml reagensglas og inkuberes ved 25 ° C i ca 24 timer. </li></ol></li></ol> 3. Dissektion af puppe testikler ved ca 24 timer efter Puparium Formation <ol><li> Fordel flere dråber (ca. 80 ul hver) medium på en 10 cm plast cellekultur eller en petriskål. Ved hjælp af en bred pincet eller en pensel fugtet med medium, pluk pupper på 24 timers APF etape fra de inkuberede hætteglas (se afsnit 2). Overfør en puppe til hver dråbe medium på fad. </li><li> For dissektion, bruge et stereo-mikroskop udstyret med en fiberoptisk lampe. Må ikke opvarmes testiklerne ovenfor RT under dissektion, da dette kan forhindre korrekt udvikling i kultur. <ol><li> Dissekere pupper med to par nr 5 pincet. Med et par, tag fat i puppe på dens mest bagestedel (de bageste Spirakler), og hold den på plads. </li><li> Grib de forreste Spirakler med det andet par pincet og åbn puppe Laag ved dens forreste ende. Skrælle puppe tilfælde indtil mindst en del af thorax er udsat for. </li><li> Fortsæt med at holde puppe i stilling ved dens mest bageste ende. For at frigøre det indre tryk i puppe, indsætte begge arme af en pincet ind i hovedet region puppe. </li><li> Rip puppe åben ved at åbne tangen og bevæge tangen i den forreste retning. Sikre, at åbningen frembragt med denne bevægelse er så stort som muligt i første forsøg. Undgå at beskadige puppe ved sin bageste ende, inden trykket er blevet frigivet som dette kan resultere i testiklerne blive skubbet direkte gennem den lille åbning og oftest bliver forstyrret. </li><li> Bemærk, at når puppe åbnes, frigives indre tryk i puppe presser agglomerater af fedt kroppens celler og væv gennem laRGE åbning i hovedet regionen. Kontroller, om puppe testikler allerede er blevet skubbet ud af puppe med dette materiale; dette sker i nogle tilfælde. Testiklerne er ikke forbundet til noget andet væv ved 24 timers APF, og derfor kan blive bortvist let fra puppe 23. </li><li> Undgå at klemme puppe med pincet da det kan beskadige testiklerne, hvis de forbliver i puppe. Forøg størrelsen af ​​åbningen ved hjælp af en pincet. </li><li> Hold derefter puppe på sit mest bageste ende. Luk det andet par pincet og forsigtigt stribe ud indholdet af puppe fra posterior til anterior frigive testiklerne fra puppe. </li></ol></li><li> Saml testiklerne ved at trække dem ind i en pre-cut 200 ul pipettespids. Forsøger at overføre kun en meget lille mængde af mediet for at reducere antallet af fedt kroppens celler overført med testiklerne. Placer testiklerne til medium i en frisk kultur fad. Vask testiklerne flere gange med medium indtil kun få fedt kroppen celler tilbage. </li><li> For levende billedbehandling, overføre testiklerne til en glas-bund dyrkningsskål med medium og bruge en omvendt billedbehandling mikroskop. For farmakologiske assays fortsætte med trin 5. </li></ol> 4. Dissektion af Male Kim-line cyster og Live-Imaging <ol><li> Overfør en eller flere puppe testikler til en glas-bund kultur fad. </li><li> Brug et stereomikroskop med fiberoptisk belysning og to rustfrit stål nåle (se afsnit 1.3) for dissektion af mandlige kim-line cyster. <ol><li> Med en nål, omhyggeligt forsøge at pin ned én testikel ved dens forreste eller bageste ende. Hold den på plads. Sæt den anden nål ind i testiklen og forstyrre testiklerne kappe ved at flytte nålen sidelæns. Mange af cyster vil blive frigivet fra testiklerne af denne bevægelse. </li><li> Fortsæt med at holde testiklerne på plads med en nål. Forsigtigt stribe de resterende cyster fra testiklerne med den anden nål. </li><li> Separate aggregerede cyster enten ved gently flytte en nål sidelæns gennem klynge af cyster eller ved at overføre de cyster til en frisk dyrkningsskål med medium ved anvendelse af en 200 ul pipettespids. </li></ol></li><li> Flyt dyrkningsskålen til et omvendt imaging mikroskop for levende billeddannelse af enkelte cyster. Disperse cyster igen med en nål, hvis nødvendigt. <ol><li> Identificer den fase af cyster ved hjælp af fasekontrast og fluorescens mikroskopi. </li><li> Fokus på en cyste på den ønskede scene. Bekræft fokus og position cyste hyppigt under længere billeddannelse eksperimenter, da cyster ikke holde sig til bunden af ​​dyrkningsskålen, og derfor har en tendens til at flyde ud af fokus. BEMÆRK: Coating fadet med poly-L-lysin til immobilisering er til skade for udviklingen af ​​tidlige kim-line cyster. I stedet kan de enkelte cyster isoleres. Med lidt øvelse, er det muligt at pege på en bestemt cyste ved meget forsigtigt at skubbe det med nålen. Dette vil gøre det muligt at overføre enkelte cyster til særskilt kultUre retter med en glas Pasteur-pipette med en langtrukken spids, der passer ind i synsfeltet for mikroskopet. De isolerede cyster så let kan flyttes i dyrkningsskålene selv efter langvarig inkubation. </li></ol></li></ol> 5. Farmakologisk Assay med intakt puppe Testikler <ol><li> Fyld hver brønd af en 24-brønds celledyrkningsplade med 500 pi medium til et eksperiment af 12 gentagelser. Overfør en puppe testis til hver brønd, ved hjælp af en pre-cut 200 ul pipettespids. <ol><li> Kontroller tilstedeværelsen af ​​protaminer i de isolerede testiklerne anvendelse af et omvendt fluorescens mikroskop. Testiklerne skal være fri for ProtamineB-eGFP signal, som angiver, at HP kontakten ikke har fundet sted i nogen af ​​cyster. Udskift testikler, der allerede viser ProtamineB-eGFP-positive cyster. </li><li> Til de første 12 brønde tilsættes 500 pi medium indeholdende fortyndet inhibitorforbindelse (anacardic syre) for at opnå den ønskede slutkoncentration(150 uM) i 1 ml medium per brønd. Brug de resterende brønde som ubehandlede kontroller; tilsættes 500 pi medium med den samme mængde opløsningsmiddel, der anvendes som de inhibitorforbindelser. Bemærk: Hvis der anvendes mange forskellige forbindelser og opløsningsmidler, kan det være mere effektivt at anvende medium alene som kontrol og til at teste indflydelsen af ​​stigende koncentrationer af opløsningsmidler i separate eksperimenter. </li></ol></li><li> Inkubér pladen ved 25 ° C i 24 timer i mørke. </li><li> Kontroller igen for tilstedeværelsen af ​​protaminer i de inkuberede testikler som beskrevet ovenfor. De kontrolforanstaltninger testikler bør nu vise en eller flere ProtamineB-eGFP-positive cyster, hvilket indikerer overgangen via HP switch. </li><li> Ved hjælp af en pipette med en 200 ul spids, overfører testiklerne til poly-L-lysin-coatede objektglas, gør squash præparater og plet med passende fluorescerende antistoffer som beskrevet andetsteds 12,27,28. </li></ol>

<ol>
	<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+cell+proliferation+and+differentiation+in+Drosophila+spermatogenesis.">Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 9 (4), 433-444 (1998).</li><li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+niche:+lessons+from+the+Drosophila+testis.">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138 (14), 2861-2869 (2011).</li><li>Tokuyasu, K. T., Peacock, D. W. J., Hardy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+spermiogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Dynamics of spermiogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 124 (4), 479-506 (1972).</li><li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130 (9), 1805-1816 (2003).</li><li>Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can&#8217;t+live+without+them,+can+live+with+them:+roles+of+caspases+during+vital+cellular+processes.">Can&#8217;t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes.</a> Apoptosis. 14 (8), 980-995 (2009).</li><li>Govin, J., Caron, C., Lestrat, C., Rousseaux, S., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+histones+in+chromatin+remodelling+during+mammalian+spermiogenesis.">The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis.</a> Eur. J. Biochem. 271 (17), 3459-3469 (2004).</li><li>Hecht, N., Behr, R., Hild, A., Bergmann, M., Weidner, W., Steger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+marmoset+(Callithrix+jacchus)+as+a+model+for+histone+and+protamine+expression+during+human+spermatogenesis.">The common marmoset (Callithrix jacchus) as a model for histone and protamine expression during human spermatogenesis.</a> Hum. Reprod. 24 (3), 536-545 (2009).</li><li>Kanippayoor, R. L., Alpern, J. H. M., Moehring, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamines+and+spermatogenesis+in+Drosophila+and+Homo+sapiens.">Protamines and spermatogenesis in Drosophila and Homo sapiens.</a> Spermatogenesis. 3 (2), (2013).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2013).</li><li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells.">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Jayaramaiah-Raja, S., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+from+a+nucleosome-based+to+a+protamine-based+chromatin+configuration+during+spermiogenesis+in+Drosophila.">Transition from a nucleosome-based to a protamine-based chromatin configuration during spermiogenesis in Drosophila.</a> J. Cell Sci. 120 (9), 1689-1700 (2007).</li><li>Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+acetylation+is+essential+to+proceed+from+a+histone-+to+a+protamine-based+chromatin+structure+in+spermatid+nuclei+of+Drosophila+melanogaster.">Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone- to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster.</a> Syst. Biol. Reprod. Med. 56 (1), 44-61 (2010).</li><li>Olivieri, G., Olivieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+nucleic+acid+synthesis+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Autoradiographic study of nucleic acid synthesis during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. Mut. 2 (4), 366-380 (1965).</li><li>Gould-Somero, M., Holland, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+RNA+synthesis+for+spermiogenesis+in+organ+cultures+ofDrosophila+melanogaster+testes.">The timing of RNA synthesis for spermiogenesis in organ cultures ofDrosophila melanogaster testes.</a> Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 174 (2), 133-148 (1974).</li><li>Barreau, C., Benson, E., Gudmannsdottir, E., Newton, F., White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-meiotic+transcription+in+Drosophila+testes.">Post-meiotic transcription in Drosophila testes.</a> Development. 135 (11), 1897-1902 (2008).</li><li>Barckmann, B., Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+levels+of+regulation+lead+to+protamine+and+Mst77F+expression+in+Drosophila.">Three levels of regulation lead to protamine and Mst77F expression in Drosophila.</a> Dev. Biol. 377 (1), 33-45 (2013).</li><li>Cross, D. P., Shellenbarger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis+in+in+vitro+cultures.">The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 53 (1), 345-351 (1979).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C., Henderson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Imaging+of+Male+Meiosis+by+Phase-Contrast+and+Fluorescence+Microscopy.">Time-Lapse Imaging of Male Meiosis by Phase-Contrast and Fluorescence Microscopy.</a> Drosophila Cytogenetics Protocols. , 77-87 (2004).</li><li>Kawamoto, T., Kawai, K., Kodama, T., Yokokura, T., Niki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+differentiation+of+Drosophila+spermatogonia+in+vitro.">Autonomous differentiation of Drosophila spermatogonia in vitro.</a> Dev. Growth Differ. 50 (7), 623-632 (2008).</li><li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output.">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138 (16), 3367-3376 (2011).</li><li>Leser, K., Awe, S., Barckmann, B., Renkawitz-Pohl, R., Rathke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromodomain-containing+protein+tBRD-1+is+specifically+expressed+in+spermatocytes+and+is+essential+for+male+fertility.">The bromodomain-containing protein tBRD-1 is specifically expressed in spermatocytes and is essential for male fertility.</a> Biol. Open. 1 (6), 597-606 (2012).</li><li>Jayaramaiah Raja, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+by+Drosophila+melanogaster+Protamines+and+Mst77F+of+Histones+during+Chromatin+Condensation+in+Late+Spermatids+and+Role+of+Sesame+in+the+Removal+of+These+Proteins+from+the+Male+Pronucleus.">Replacement by Drosophila melanogaster Protamines and Mst77F of Histones during Chromatin Condensation in Late Spermatids and Role of Sesame in the Removal of These Proteins from the Male Pronucleus.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (14), 6165-6177 (2005).</li><li>Bodenstein, D., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postembryonic+development+of+Drosophila.">The postembryonic development of Drosophila.</a> Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).</li><li>Susic-Jung, L., Hornbruch-Freitag, C., Kuckwa, J., Rexer, K. H., Lammel, U., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multinucleated+smooth+muscles+and+mononucleated+as+well+as+multinucleated+striated+muscles+develop+during+establishment+of+the+male+reproductive+organs+of+Drosophila+melanogaster.">Multinucleated smooth muscles and mononucleated as well as multinucleated striated muscles develop during establishment of the male reproductive organs of Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 370 (1), 86-97 (2012).</li><li>Ashburner, M., Roote, J., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Culture+of+Drosophila.">Laboratory Culture of Drosophila.</a> Drosophila Protocols. , 585-599 (2000).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66 (1), 57-80 (1981).</li><li>Hime, G. R., Brill, J. A., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+ring+canals+in+the+male+germ+line+from+structural+components+of+the+contractile+ring.">Assembly of ring canals in the male germ line from structural components of the contractile ring.</a> J. Cell Sci. 109, 2779-2788 (1996).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., W, S. u. l. l. i. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatocyte+growth+and+male+meiosis+in+Drosophila+melanogaster.">Cytological analysis of spermatocyte growth and male meiosis in Drosophila melanogaster.</a> Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).</li><li>Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+testes+in+Drosophila.+I.+The+relation+between+vas+deferens+and+testis+within+various+species.">The growth of testes in Drosophila. I. The relation between vas deferens and testis within various species.</a> J. Exp. Zool. 87 (1), 113-158 (1941).</li><li>Lim, J. G. Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cell+lineage+is+required+for+differentiation+and+not+maintenance+of+germline+stem+cells+in+Drosophila+testes.">Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes.</a> PNAS. 109 (45), 18477-18481 (2012).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Braun, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+paternal+chromosomes+with+protamine.">Packaging paternal chromosomes with protamine.</a> Nature Genet. 28 (1), 10-12 (2001).</li><li>G&#246;risch, S. M., Wachsmuth, M., T&#243;th, K. F., Lichter, P., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+increases+chromatin+accessibility.">Histone acetylation increases chromatin accessibility.</a> J. Cell Sci. 118 (24), 5825-5834 (2005).</li><li>Demerec, M., Kaufmann, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Guide: Introduction to the Genetics and Cytology of Drosophila melanogaster. , (1996).</li><li>Wang, W., Yoder, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Pupal+Abdomen+Immunohistochemistry.">Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. (56), (2011).</li><li>Sang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Quantitative+Nutritional+Requirements+of+Drosophila+Melanogaster.">The Quantitative Nutritional Requirements of Drosophila Melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 33 (1), 45-72 (1956).</li><li>Meynadier, G., Vago, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aseptic rearing of invertebrates for tissue culture. In: Invertebrate tissue culture. 1, (1971).</li><li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+acetyltransferase+activity+by+anacardic+acid+sensitizes+tumor+cells+to+ionizing+radiation.">Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation.</a> FEBS Lett. 580 (18), 4353-4356 (2006).</li><li>Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+imaginal+disc+development.">Live imaging of Drosophila imaginal disc development.</a> PNAS. 107 (32), 14217-14222 (2010).</li><li>Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+stable+cell+lines+of+Drosophila+germ-line+stem+cells.">Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells.</a> PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).</li><li>Church, K., Lin, H. P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubules+and+chromosome+movement+during+prometaphase+in+Drosophila+melanogaster+spermatocytes+studied+in+life+and+with+the+electron+microscope.">Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope.</a> Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes.">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Live+Imaging+of+Stem+Cells+in+Drosophila+Testis.">Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).</li></ol>

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser.

Den præsenterede protokol beskriver to forskellige applikationer baseret både på evnen til at dissekere Drosophila testikler og enkelt kim-line cyster på et givet udviklingstrin og i ex vivo-udviklingen af disse celler og væv i en dyrkningsskål. En ansøgning er den farmakologiske manipulation af vitale processer i løbet af sæd udvikling. Vigtigere er det, dette giver adgang til post-meiotisk spermatogenese, der ikke nemt opnået ved hjælp af funktionelle analyser baseret på flyve genetik. Den anden anvendelse er mikroskopisk observation af levende og udvikle kønsceller og testikler. Især denne ansøgning fordele fra evnen af Drosophila-celler og organer i kultur til at overleve og udvikle sig ved stuetemperatur og under normale atmosfære. Derfor et inverteret billeddannelse mikroskop udstyret med et opvarmet fase (opvarmning til standard avl temperatur på 25 ° C) er tilstrækkelig til at opnå meningsfulde resultater i levende billeddannelse eksperimenter. Yderligeremere, mange transgene flyve stammer, der udtrykker fluorescerende protein-mærkede proteiner til direkte billedvisning eksisterer eller kan let etableres. For at opnå puppe testikler eller kim-line cyster af en bestemt udviklingsstadiet, er det afgørende, at man er fortrolig med timingen af Drosophila udvikling. Den præcise timing for hver fase kan variere blandt laboratorier, dyrkningsbetingelser og flyve stammer og skal etableres empirisk. Som beskrevet ovenfor, er det især vigtigt for farmakologiske assays, for eksempel rettet mod HP switch. For sådanne eksperimenter, er det tilrådeligt at altid tjekke for spermatider med en ProtamineB-eGFP signal, før den egentlige inhibitor test, fordi timingen kan variere lidt selv inden for et befolkning. Efter protokollen ovenfor, bør gøre det muligt forsøgslederen at dissekere testikler fra tidlige puppe stadier som intakte organer fri for vedlagte fedt kropsvæv. Disse testikler og, i endnu højere grad, isoleret geRM-line cyster er meget skrøbelige. Derfor er det afgørende at udvikle håndelag og erfaring er nødvendig for at håndtere og overføre testikler og cyster ved hjælp af pincet, kanyler og pipetter. Især undersøgelser rettet meiotisk og tidlig udvikling post-meiotisk kim-celle ville drage fordel af dette. Selv om det er forholdsvis let at dissekere cyster sene spermatider med lang flageller fra voksne testikler, er det vanskeligt at opnå tidligere stadier. Dissekere disse cyster fra tidlige puppe testikler efter denne protokol er meget mere effektiv. Husk på, at i en sædvanlig flue stamme, vil kun ca 50% af pupper være mand. Derfor klar til at dissekere mindst dobbelt så mange pupper som antallet af testikler påkrævet. Alternativt er det muligt at identificere mandlige L3 larver hjælp af et stereo-mikroskop, da testiklerne kan identificeres som gennemskinnelige runde organer indlejret i de laterale fedt kropsvæv i den intakte larve 23,34, og at samle dem i friske kultur hætteglas, kanbruges til at vælge præ-pupper for iscenesættelse og dissektioner. Det er også muligt at identificere mandlige pre-pupper 35. Vi bemærkede, at både de isolerede kim-line cyster og de ​​intakte puppe testikler i kultur er følsomme over for lys, som er også blevet rapporteret tidligere 18. Denne lysfølsomhed kan også holde til nogle kemiske forbindelser, der anvendes i farmakologiske assays. Derfor er det bedst at holde dyrkningsskålene af et assay i mørke under inkubation. Ligeledes, når planlægningen af time-lapse imaging eksperimenter med udviklingslande testikler og især isolerede cyster, huske på, at alt for lange eksponeringstider og / eller for høj målehastigheder kan hæmme ex vivo udvikling. Den passende samplingfrekvens skal bestemmes ved forsøg. Bakteriel og / eller svampeinfektion og over-vækst i dyrkningsskålene udgør et alvorligt problem. Inficerede kultur retter med alt for mange bakterier understøtter ikke ex vivo develing af testiklerne og cyster. Derfor beskrevne dyrkningsmedium indeholder penicillin og streptomycin (se trin 1.1), men under langvarig inkubation kan disse antibiotika blive nedbrudt og deres aktivitet måske aftage. Dette kunne være en af ​​årsagerne til den begrænsede tid for overlevelse (max. 72 timer) af dyrkede cyster observeret ved brug af protokollen ovenfor. Alligevel denne tidsramme ikke kunne udvides ved løbende udskiftning af dyrkningsmediet i skålene. Vi konkluderer, at andre faktorer kan påvirke overlevelsen i kultur, såsom en manglende vækst signaler fra andre væv i kønsorganerne. På den anden side, post-meiotisk udvikling er hurtigere i Drosophila end i pattedyr. I Drosophila, spermiogenesis tager cirka 90 timer, og HP-kontakten finder sted mellem 50 og 60 timer efter meiose 9,12. Således sædvanlige overlevelsestid på omkring 48 timer opnået med denne protokol er velegnet til at følge centrale udviklingsprocesser in spermatogenesis, såsom meiotiske divisioner eller HP switch. Selv om bakteriel eller svampekontaminering kan undgås ved hjælp af rene værktøjer og medier, har fremlagt protokol ikke gøre brug af strengt sterile arbejdsforhold, fordi fluer og flyve testikler allerede indeholder bakterier, når rejst under standardbetingelser. Alligevel kan nogle anvendelser af denne kultur teknik gavn af fluer dissekeret eller endda rejst under aseptiske betingelser (protokoller, se 17,36,37). Farmakologiske analyser afhænger af anvendelsen af ​​kemiske forbindelser, der virker som inhibitorer eller aktivatorer af forskellige enzymer. Forbindelserne, der almindeligvis anvendes i sådanne forsøg afviger ofte meget i deres mål specificitet. Som en fordel, det giver mulighed for at målrette hele enzymklasser, for eksempel med anacardic syre hæmmende P300 / CBP PCAF og MYST familiemedlemmer HATS 38. Ulempen ved dette kunne være potentiel off-mål eller cytotoksiske virkninger INDUCed af sådanne forbindelser. Derfor bør hver anvendt i et assay med puppe testikler eller cyster forbindelse testes for dets cytotoksicitet og specifik virkning ved forskellige koncentrationer. Desuden kan små variationer i de dyrkningsbetingelser, Forbindelse Koncentration eller aktivitet, og variationer i cellepermeabilitet føre til variation af de inducerede virkninger. Derfor er det nødvendigt at overvåge behandlingens succes i hvert forsøg. For eksempel, når vi anvendte anacardic syre ved 150 uM, observerede vi lille variation i styrken af ​​chromatinkondensering fænotype mellem og undertiden i nogle testikler, mens acetylering af histon H4 konsekvent faldt. Farmakologiske assays med Drosophila testikler i kultur er blevet anvendt til at analysere før og efter meiotiske mekanismer spermatogenesen 4,12,14,21. Da det er vanskeligt at få adgang post-meiotisk spermatogenese med genetiske værktøjer til at målrette spillere med essential præ-meiotiske og meiotiske funktioner, udgør et alternativ denne ex vivo fremgangsmåde. Desuden principielt metoden kan tilpasses til puls-chase-eksperimenter for at følge udviklingen af ​​behandlede kønsceller over tid. Vi har imidlertid endnu ikke undersøgt denne mulighed. Gør brug af tidlig puppe testiklerne er en fordel i farmakologiske assays. For det første kan den tynde ydre kappe af de unge puppe testikler (ca. 24 timer APF) muliggøre forbedret permeabilitet af kemiske forbindelser. For det andet, når man studerer den post-meiotisk HP switch, de puppe testikler dissekeret på 24 timers APF fra Protamine-GFP-udtrykkende fluelinen muliggøre en direkte udlæsning af, hvorvidt HP kontakten blev påvirket eller ej. Til dato har flere protokoller for ex vivo dyrkning af Drosophila organer og væv, herunder testikler og kim-line cyster blevet udviklet (se fx 4,14,17,20,39,40). Dyrkningsmediet, og de generelle betingelser, der anvendesi protokollen præsenteres her blev etableret i 1979 17. Kulturen system blev senere tilpasset til in vivo billeddannelse af individualisering mekanisme sene post-meiotiske cyster isoleret fra voksne testikler 4. Tidligere har vi rapporteret, at disse betingelser understøtter også overlevelse og differentiering af meiotisk og tidlige post-meiotiske kønsceller i deres cyster for omkring 48 timer 12. I modsætning til andre dyrkningssystemer 19 den observerede udviklingsmæssige timing i disse kulturer var omtrent overens med timingen bestemmes ud fra faste prøver (for detaljer, se 12). H2AvD-RFP og Protamin-GFP-fluorescens-signaler kan anvendes til at visualisere den nukleare morfologi og kromatin sammensætning af kimceller i kultur. Vi fandt, at for en klar identifikation af udviklingsstadier i kultur, det er fordelagtigt i forhold til andre kriterier, såsom coiling af cyster. Vigtigere, har fremlagt protokol ikke indebærer tilsætning af flyve extRACT eller andre grunde end kalvefosterserum vækstfaktorer. Desuden viser vi her, at de betingelser er forenelige med fluorescens mikroskopi billeddannelse af meiotiske divisioner ex vivo i kultur. Billeder kan opnås med en rimelig opløsning i en nem-at-bruge medium, der understøtter en langsigtet udvikling. Dette er i modsætning til protokoller gør det muligt på kort sigt (ca. 3 timer) observationer i Voltalef olie 41,42. De ovenfor beskrevne til dyrkning og farmakologisk behandling af puppe testikler og enkelt mandlige kim-line cyster procedurer er let at tilpasse til de mange genetiske, epigenetiske, cellebiologiske, eller udviklingsmæssige spørgsmål, som kan forsket i Drosophila spermatogenesen. Dette omfatter især forskning med fokus på kim-line stamceller. Det er blevet påvist, at stamceller udvikling kan følges i levende billeddannelse af dyrkede voksne testikler 20,43. Men den peristaltiske bevægelse af det modne testis sheath forstyrrer billedet købet. Derfor er enten billedbehandling gjort ved hjælp af fragmenterede testikler 43 eller antallet af imaging eksperimenter udført skal øges for at tage højde for mistede datasæt 20. Tidlige puppe testikler (24 timers APF) er endnu ikke lukket med muskelceller. Selv lidt ældre testikler (36-45 timers APF) synes at vise nogle peristaltiske bevægelser (sammenlign figur 3 og supplerende video 1). Derfor dyrkning af unge puppe testikler som intakte organer kunne tjene som et alternativ. Endvidere, når beherskes, evnen til at dissekere puppe testiklerne og i sidste ende isoleret cyster kimcelleudviklingen vil tillade yderligere ansøgninger bruger enkelte cyster som en kilde til en homogen, omend små, cellepopulationen. For eksempel er det således muligt at udføre RT-qPCR at analysere den transkriptionelle regulering af bestemte gener under definerede stadier af spermatogenese, som det allerede er blevet påvist <sup&gt; 15.

Udviklingen af ​​mandlige kimceller mange arter er en sekventiel proces. Det er kendetegnet ved en række afgørende begivenheder, der kulminerer i dannelsen af ​​morfologisk og epigenetisk højt specialiserede spermatozoer. I Drosophila melanogaster, kim-line stamceller på spidsen af testiklerne kløft asymmetrisk at give anledning til en ny stamcelle og spermatogonium, dvs datter celle, der er forpligtet til at differentiering (se figur 1 for en oversigt) 1,2 . Den spermatogonium gennemgår fire runder af mitotiske divisioner, og med debut af meiose, en fase med en imponerende vækst og transskriptionsaktivitet kaldes spermatocyte scenen. Cellerne stammer fra en spermatogonium forblive forbundet til hinanden og udvikle sig som en synkroniseret bundt indpakket to somatiske celler-en struktur, der er nævnt som en cyste. Efter afslutning af meiose, morfologi af de mandlige kimceller er heltomstruktureret (vist skematisk i figur 1). Indledningsvis runde spermatider langstrakte for at danne den hydrodynamiske hovedkonstruktion og flagel udvikler sig. Til sidst er de sædceller adskilt fra hinanden af et komplekst, apoptose-relaterede mekanisme kaldet individualisering 3 - 5. I mange arter, herunder Drosophila melanogaster og pattedyrarter, de morfologiske ændringer af kønsceller er ledsaget af en bemærkelsesværdig epigenetisk omlægning af det haploide mandlige kim-line kromatin, kaldet histon-til-protamin afbryder (HP switch) 6. - 9.. Eventuelt næsten alle kanoniske histon og mange histon-variantmolekyler strippet fra DNA og erstattes af små grundlæggende proteiner, protaminerne, hvilket resulterer i meget kompakt nucleoprotamine struktur specifikke kromatin modne sædceller. Generelle egenskaber af HP-kontakten er than udskiftning af kanoniske histoner først ved histon varianter, derefter ved overgangs- proteiner, og endelig af protaminer. Alt dette er ledsaget af flere ændringer i epigenetiske mærker, såsom en stigning i acetyleringsniveauer af histon H4 lige før histon fjernelse 7,10 - 12. De fleste, hvis ikke alle, af de ovenfor nævnte processer er afgørende for udviklingen af ​​modne, fuldt fertile sperm. Dette gælder ikke kun i Drosophila, men også i mennesker, som pattedyr spermatogenese deler en betydelig mængde af lighed med det hvirvelløse systemet 1,8,9. Studere mandlig udvikling kim-celle lettes i høj grad i Drosophila modelsystem. Fluer er genetisk meget tilgængelig. Frembringelsen af ​​mutanter samt etablering af flyve-stammer, der udtrykker fusion gener eller RNA-interferens konstruktioner tager lidt indsats. Men i studiet af post-meiotisk spermatogenese anvendelse af mutanter end simple genetiske værktøjer kan nå en grænse. I Drosophila spermatogenesen, transskription ophører næsten helt med indrejse i meiotiske divisioner. Således er post-meiotisk spermatogenese hovedsagelig baseret på translatorisk undertrykt og gemt mRNA syntetiseret i en udvidet meiotiske profase 13-16. Derfor værktøjer som RNA-interferens eller brug af ikke-betingede mutanter er ikke egnet til at studere specielt post-meiotiske roller genprodukter, der også opfylder væsentlige funktioner i præ-meiotiske eller meiotisk udvikling kim celle. En fordel ved Drosophila, der kan udnyttes i sådanne tilfælde er muligheden for dissekerede intakte testikler og endda cyster i kimceller at udvikle ex vivo i dyrkningsmedium 4,12,17 - 20. Dissektion og dyrkning af testikler eller kim-line cyster ikke kun tillader mikroskopisk observation af kim-celle udvikling i levende celler, men enLSO brugen af farmakologiske assays med f.eks hæmmere af enzym-komplekser, såsom histon acetyltransferaser (HATS), HDACi (HDAC), topoisomeraser eller proteasomet. Således er det muligt at manipulere enzymatiske funktioner under post-meiotisk spermatogenese og overvåge de udviklingsmæssige udfald uanset embryonale, præ-meiotiske eller meiotiske funktioner 4,12. I farmakologiske assays vi tidligere analyserede acetyleringen-afhængige lokalisering af en bromodomain proteinet under meiotisk profase samt relevansen af histonacetylering niveauer for epigenetiske HP-kontakten i post-meiotisk spermatogenese ved hjælp af specifikke inhibitorer rettet Hatte og HDAC&#39;er 12,21. Målretning af HP-kontakten i disse analyser blev muliggjort ved hjælp af en flue stamme, der udtrykker fusion generne histone2AvD-RFP og protamineB-eGFP 12,22 i de endogene mønstre, og den iagttagelse, atde første spermatider i puppe testikler passere gennem HP skifte mellem 24 og 48 timer APF 12. Protokollen præsenteres beskriver dissektion af testikler og cyster fra Drosophila pupper, dyrkningsbetingelserne, og en farmakologisk assay med intakte puppe testikler. Til dette formål er puppe testikler ved omkring 24 timer efter puparium dannelse (APF) dissekeret (se figur 1 og 2). På dette tidspunkt har testiklerne ikke foretaget tilslutninger til andre væv og er omgivet af en tynd ydre kappe, som giver bedre indtrængning af inhibitorforbindelser 23,24. Testiklerne er bean- eller pæreformet organer, der let kan tages i kulturen. Disse testiklerne dissekeres, dyrket og behandlet med specifikke inhibitorer. Efterfølgende virkningerne af inhibitorer overvåges ved hjælp af immunofluorescens-analyser og fluorescensmikroskopi fusionsprotein udtryk, og ved sammenligning af den nukleare morpholnologi af de behandlede kimceller med ubehandlet kønsceller. De betingelser, der præsenteres i denne protokol tillader også levende billeddannelse udvikle testikler og kim-line cyster i kultur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Anacardic acid</td>
			<td style="width:105px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:99px;">172050</td>
			<td style="width:247px;">brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-acetyl-Histone H4</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-598</td>
			<td>brand: Upstate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioCam MRm&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioObserver.Z1 inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont 5-Inox forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fiber optical&#160; illuminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inoculation loop or pin holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5018</td>
			<td rowspan="2" style="width:247px;">In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5014</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plates, 24-wells</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>351147</td>
			<td>brand: Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen Strep</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>15070</td>
			<td>brand: Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shields and Sang M3 Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stemi SV6 binocular</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

Under spermatogenese hos pattedyr og i Drosophila melanogaster udvikle mandlige kimceller i en række væsentlige udviklingsmæssige processer. Dette omfatter differentiering fra en stamcelle befolkning, mitotisk forstærkning, og meiose. Desuden, efter meiotiske kimceller undergår en dramatisk morfologisk omformning proces samt en global epigenetisk omkonfigurering af kønsceller kromatin-histon-til-protamin afbryder. Studere den rolle, et protein i post-meiotisk spermatogenese hjælp mutagenese eller andre genetiske værktøjer er ofte hæmmet af væsentlig embryonale, præ-meiotisk eller meiotiske funktioner i proteinet under undersøgelsen. Den post-meiotisk fænotype af en mutant af et sådant protein kan skjules ved hjælp af en tidligere udviklingsmæssige blok eller fortolkningen af ​​fænotypen kan være kompliceret. Modellen organisme Drosophila melanogaster tilbyder en omfartsvej til dette problem: intakte testikler ogendda cyster af kønsceller dissekeret fra tidlig pupper er i stand til at udvikle ex vivo i dyrkningsmedium. Udnyttelse af sådanne kulturer tillader mikroskopisk billeddannelse af levende kønsceller i testiklerne og kim-line cyster. Vigtigere er det, de dyrkede testiklerne og kimceller også bliver tilgængelige for farmakologiske hæmmere, hvilket tillader manipulation af enzymatiske funktioner under spermatogenesen, herunder post-meiotiske stadier. Protokollen forelægges beskriver, hvordan man dissekere og dyrke puppe testikler og kim-line cyster. Oplysninger om udvikling af puppe testikler og dyrkningsbetingelser leveres sammen med mikroskop billeddata af levende testikler og kim-line cyster i kultur. Vi beskriver også en farmakologisk assay at undersøge post-meiotisk spermatogenese, eksemplificeret ved et assay målrettet histon-til-protamin afbryder hjælp af histonacetyltransferase inhibitoren anacardic syre. I princippet kunne denne dyrkningsmetode tilpasses for at imødekomme mange other forskningsspørgsmål i præ-og post-meiotisk spermatogenesen.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment at JoVE.com

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Ex vivo kultur Drosophila puppe Testikel og Single Mand Kim-line cyster: Dissektion, Imaging, og farmakologisk behandling

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Imaging Gennem puppe Case of<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonale Hud og live-billeddannelse af Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In vivo Mikroinjektion og Elektroporation af Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development