Name: flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents
Uploaded: 2014-06-29T14:30:00
Duration: 14 min 2 s
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Les auteurs remercient le Professeur Eero Castrén pour ses précieux commentaires sur le manuscrit. Le travail est soutenu par des subventions de l&#39;Académie de Finlande, Centre pour la mobilité internationale de la Finlande, et finlandais Graduate School of Neuroscience (cerveau et Doctorat esprit).

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	<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists.">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329, 959-964 (2010).</li><li>Sitdikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+suppresses+early+cortical+activity.">Isoflurane suppresses early cortical activity.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2013).</li><li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. 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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Pour mieux comprendre la physiologie du cerveau et de la pathologie, la recherche doit être effectuée sur une variété de niveaux de complexité de préparation, en utilisant les techniques les plus appropriées pour chaque préparation. À l&#39;heure actuelle, un large éventail de méthodes de neurosciences (de tout le corps à la microscopie STED IRMf sous-organite) sont facilement appliqué aux animaux anesthésiés, tandis que des expériences sur des animaux éveillés et se comportent ont représenté un défi méthodologique important. Ici, une nouvelle approche est décrite où un animal de laboratoire, en dépit d&#39;être fermement la tête fixe, peut se déplacer autour d&#39;un homecage air mobile levé et explorer son environnement tangible dans des conditions sans stress. La préparation des animaux tête fixe comporter présentée ici fournit un certain nombre d&#39;avantages cruciaux. Premièrement, les données électrophysiologiques ou d&#39;imagerie obtenus avec cette méthode sont sans compromis ni par l&#39;anesthésie, ni par le stress induit par contrainte. Positionnement de la souris dans la maison mobilecage est rapide et ne nécessite pas d&#39;anesthésier l&#39;animal, même de manière transitoire. Deuxièmement, la homecage air levé assure la stabilité mécanique qui est nécessaire pour quantifier les changements dans la morphologie des neurones amende et d&#39;enregistrer une seule cellule activité électrophysiologique chez les animaux éveillés. Enfin, la conception de la homecage mobile est plus compact par rapport au tapis roulant sphérique, permettant ainsi le positionnement de la homecage portable sous un microscope droit norme pour l&#39;imagerie à deux photons ou d&#39;enregistrement patch-clamp dans le cerveau de souris éveillé. Cabinet fixation de la tête dans le homecage mobile requiert l&#39;implantation d&#39;un support métallique à quatre ailes spécialement conçu, avec une ouverture ronde dans le centre d&#39;accès optique ou électrique à la région du cerveau sous-jacent. Ces supports métalliques sont fixés sur le crâne à l&#39;aide d&#39;une combinaison de la colle, un ciment dentaire et un petit boulon vissé dans l&#39;os du crâne. Cette intervention chirurgicale a été développé sur la base d&#39;un grand nombre de précédemmentprocédures publiées, et on a trouvé au résultat de la préparation dans une fenêtre crânienne stable et reproductible. Pour vivo expériences électrophysiologiques, une fenêtre en forme de lune 34, une petite craniotomie de taille (moins de 0,5 mm) 32, et une préparation vitré foré 35 ont été utilisées. Ici, le &quot;inversé&quot; fenêtre crânienne a été implanté avec soit un grand (diamètre 3,5 mm) ou petites (diamètre inférieur à 0,5 mm) craniotomie. Minimisant ainsi les mouvements du cerveau est essentiel pour les enregistrements de cellules individuelles stables, c&#39;est pourquoi il est conseillé d&#39;effectuer de petits craniotomies de taille pour les expériences électrophysiologiques. Lors de l&#39;implantation de la fenêtre crânienne pour des expériences d&#39;imagerie optique, les animaux sont laissés récupérer pendant au moins 2 ou 3 semaines, période durant laquelle la première fenêtre de manière transitoire perd sa transparence et ensuite elle regagne (avec un rendement de 50-70%, en fonction de l&#39;arrière-plan génétique de la souche de souris). Transparence de la fenêtre crânienne et la stabilitétion du ciment &quot;bouchon&quot; dentaire attaché au crâne peut être vérifiée au moyen d&#39;un microscope binoculaire et l&#39;inspection régulières physique lors de la manipulation des animaux. A la fin de la période de récupération de 2-3 semaines, les animaux qui présentent des signes d&#39;inflammation post-opératoire résiduelle ou des défauts mécaniques dans le ciment dentaire devraient être exclus des expériences et fin. L&#39;âge optimal pour commencer la formation de la souris est de 2-4 mois (correspondant au poids corporel de 20-40 g). Chez les jeunes animaux, l&#39;ancrage du ciment &quot;bouchon&quot; dentaire au crâne peut ne pas être fiable, ce qui peut diminuer sa capacité de résistance au stress mécanique imposé par la locomotion de la souris sur la tête fixe dans le homecage mobile. Bien que les souris mâles et femelles apparaissent tout aussi prêt à naviguer dans homecage mobile, il ya une tendance à une meilleure pourcentage de fenêtres crâniens retrouver leur transparence chez les souris femelles (données non présentées). Ainsi, dans l&#39;ordre to assurer un équilibre entre les sexes dans la cohorte d&#39;animaux sélectionnés pour l&#39;imagerie, de l&#39;implantation des fenêtres crâniens dans environ 30% des souris plus mâle est recommandé. Les interactions sociales sont connues pour améliorer le bien-être des animaux et de réduire le stress, il est donc souhaitable que la même portée sont exploités et formés en parallèle et maintenus ensemble dans des cages de logement en groupe. A la différence des modes opératoires publiés pour la préparation de tapis roulant sphérique 13, le procédé utilisant le homecage mobile ne nécessite pas d&#39;anesthésier la souris au moment de la fixation de la tête. Cette différence est importante car elle permet d&#39;éliminer les effets résiduels que même un bref épisode d&#39;anesthésie et &quot;lumière&quot; est susceptible d&#39;avoir sur les mesures physiologiques obtenus peu de temps après. En effet, même si dans les études où la tête de fixation a été fait sous anesthésie et les expériences réelles ont commencé après une période d&#39;attente brève 13, on ne peut pasexclure les éventuels effets à long terme de la brève épisode de l&#39;anesthésie sur les données expérimentales. D&#39;autres études se sont appuyés sur la privation d&#39;eau pour l&#39;accoutumance systématique des animaux à la tête de fixation et utilisé récompense de l&#39;eau comme moyen de motiver l&#39;animal à rester immobile 36. Cependant, la méthode tête fixation récompense basée limite le choix des tests de comportement applicables et, surtout, occupe l&#39;une des associations stimulus-récompense bien établies. En revanche, la méthode de la souris de l&#39;accoutumance à la tête de fixation dans homecage mobile ne nécessite pas une privation d&#39;eau et de rendement subséquent. Complétant la homecage mobile avec un système de distribution d&#39;eau est recommandée pour des expériences de longue durée. Les séances de dressage d&#39;animaux et les expériences présentées ici ont été effectuées pendant la journée (8 heures-18 heures), ce qui correspond à la période physiologiquement passive pour les souris qui sont conservés selon le calendrier de la lumière de 12 heures standard (liSMTG sur à 6 heures et descendre à 18 heures). Depuis la prise d&#39;eau est directement liée à l&#39;activité de la souris, les souris pendant la période passives ne nécessitent pas de distribution de l&#39;eau si la durée d&#39;une session de formation / imagerie / d&#39;enregistrement ne dépasse pas 2 heures. En plus de la date et la durée des sessions de formation, il faut aborder la question du nombre optimal de séances nécessaires pour habituer les animaux à homecage mobile. A cette fin, deux critères ont été utilisés pour évaluer le stress induit par des modes opératoires de la tête de fixation: i) la perte de poids, et ii) le niveau de l&#39;activité locomotrice. Comme le montre la figure 6, la perte de poids atteint le niveau moyen de 6% sur deux jours de formation, et est complètement inversé par la formation de 4 jours (Figure 6A). En cohérence avec la dynamique de pesage, le niveau des animaux à tête fixe activité locomotrice est supprimée dans le premier jour de la formation, mais se stabilise par la formation le jour 4 (figure 6D). Sur la base de ces mesures, nous suggestionst que la durée minimale de la période de formation de la souris sur homecage mobile est de 4 jours, comme décrit dans le protocole par les présentes. L&#39;utilisation de l&#39;, homecage portable fond plat air-levée permet d&#39;ajouter des tâches complexes (sensori-motrices, perceptives, cognitives et) les paradigmes de formation pour les souris à tête fixe. Dans la présente étude, deux protocoles de tests comportementaux sont présentés. Les deux protocoles utilisent odeur indices et peuvent être combinés avec longitudinales imagerie / enregistrements dans le cortex de la souris. Bien que le homecage mobile est fabriqué à partir de matériaux non absorbants, il faut encore tenir compte des interférences possibles entre l&#39;odeur de l&#39;appareil et l&#39;odeur (s) d&#39;essai. Un autre facteur qui peut interférer avec des repères visuels / tactiles d&#39;une expérience comportementale est la jonction entre le mur et l&#39;insert, ce qui n&#39;est pas sans faille et peuvent, par conséquent, être perçu par l&#39;animal comme un point de repère. Il convient de noter ici que, afin de minimiser la détresse de l&#39;animal au cours de cette intégrationrventions que le placement d&#39;un coton odeur présentant à la paroi homecage mobile, l&#39;expérimentateur doit pratiquer pour effectuer ces interventions le plus rapidement possible et éviter toute manipulation prolongée de la cage de carbone. Stratégies alternatives pour roman présentation odeur / objet sont envisageables, par exemple, en plaçant solution hydrogel gouttes ou des objets (tels que les puces alimentaires) sur de petites étagères fixées à la surface interne de la paroi de la cage de carbone à la hauteur compatible avec la tête de positionnement de l&#39;animal. Homecage mobile permet aux animaux de la tête fixe pour effectuer un large éventail de mouvements à deux dimensions, y compris la locomotion horizontale, situp, toilettage, en fouettant, lécher, nez-piquer, les mouvements de la patte avant qualifiés, et le mur de toucher avec les pattes avant, comme illustré dans la présente étude . Utilisation homecage mobile et les protocoles présentés ici, les chercheurs peuvent étudier le système neuronal sensori-moteur avec un niveau élevé de contrôle sur à la fois la condition de stimulations et au dépouillement de comportement. En outre, des études de capacités cognitives chez des souris éveillées peuvent être effectuées pendant le conditionnement, la navigation spatiale et les tâches de prise de décision. Il existe plusieurs limitations pratiques de ce procédé. Tout d&#39;abord, une quantité importante d&#39;air sous pression est nécessaire pour obtenir la puissance de homecage-levage et de réaliser des expériences de longue durée. En second lieu, la homecage mobile dans sa mise en oeuvre est présente seulement 18 cm de diamètre, et par conséquent fournit un relativement petit et simple par rapport à l&#39;espace de réalité virtuelle, où un environnement expérimental complexe peut être conçu sans aucune restriction spatiales. Troisièmement, lors de la stimulation des moustaches et des expériences à base de récompense-présentés ici, un dispositif a été utilisé qui limite la possibilité de la paroi contact pour la souris. L&#39;addition d&#39;un canal de stimulation sensorielle visuelle ou externe (comme un projecteur de lumière dirigée œil), il faudrait concevoir un dispositif plus compact et ergonomique, par rapport àles solutions à écran multiple ou d&#39;un dôme de projection qui ont été utilisés dans les expériences de tapis roulant sphériques. En résumé, l&#39;utilisation de la souris à la tête fixe se déplaçant dans la homecage air mobile levée facilite grandement les études qui combinent les niveaux cellulaires, moléculaires et comportementaux d&#39;observation et de manipulation dans une expérience unique. Applications spécifiques illustrés ici comprennent deux photons imagerie microscopique, intrinsèque imagerie de signal optique et les enregistrements de patch-clamp chez les souris Behaving non anesthésiés. Il est prévu que cette approche va ouvrir de nouveaux horizons dans l&#39;expérimentation sur éveillé, la souris se comporter et de servir comme un outil utile à la fois pour le développement de médicaments et la recherche fondamentale de la fonction cérébrale.

Une tendance récente passionnante dans les neurosciences est de développer des approches expérimentales pour moléculaire et cellulaire de sondage des réseaux neuronaux dans le cerveau de dormir, de se comporter rongeurs. Ces approches prometteuses pour apporter un nouvel éclairage sur les processus neurophysiologiques qui sous-tendent la fonction motrice, l&#39;intégration sensori-motrice, la perception, l&#39;apprentissage, la mémoire, ainsi que la progression de la blessure, la neurodégénérescence et les maladies génétiques. En outre, l&#39;enregistrement à partir du cerveau de l&#39;animal éveillé prometteuse dans le développement de nouveaux agents thérapeutiques et les traitements. Il ya une prise de conscience croissante que l&#39;anesthésie, qui a été couramment utilisé dans les expériences neurophysiologiques, peut affecter les mécanismes de base du fonctionnement du cerveau, pouvant conduire à une interprétation erronée des résultats expérimentaux. Ainsi, la kétamine anesthésie largement utilisé augmente rapidement la formation de nouvelles épines dendritiques et améliore la fonction synaptique 1; un autre anesthésique couramment utiliséic isoflurane à des niveaux d&#39;anesthésie chirurgicale supprime complètement l&#39;activité corticale spontanée chez les rats nouveau-nés et des blocs oscillations fuseau éclater chez les animaux adultes 2. À l&#39;heure actuelle, seul un nombre limité d&#39;approches permettent des expériences chez la souris non anesthésiée à l&#39;aide de deux photons imagerie microscopique ou enregistrements de patch-clamp. Ces approches peuvent être divisés en préparations se déplacer librement et tête fixe. L&#39;attrait unique de préparation des animaux se déplaçant librement, c&#39;est qu&#39;il permet une évaluation du comportement naturel, y compris les mouvements du corps entier pendant la navigation. Une façon de l&#39;image à l&#39;intérieur du cerveau d&#39;un rongeur se déplacer librement est d&#39;attacher un microscope ou fibroscope 3-5 monté sur la tête miniaturisée. Cependant, les dispositifs miniaturisés ont tendance à avoir des performances optiques limitée en comparaison de microscopie à deux photons axé sur les objectifs, et ne peuvent être facilement combinés avec des enregistrements entiers cellule de patch-clamp 6. L&#39;exisolutions de piqûre pour la tête de fixation d&#39;un rongeur éveillé se sont appuyés principalement soit sur ​​la contention physique ou 7,8 sur la formation de l&#39;animal à présenter volontaire appuie-tête 9. Une autre approche populaire est de permettre aux membres de l&#39;animal de se déplacer en le plaçant sur, par exemple, un tapis roulant sphérique 10; cette approche est souvent combiné avec la réalité virtuelle générée par ordinateur. Des expériences électrophysiologiques sur des souris de tête-fixe ont principalement utilisé des enregistrements extracellulaires et ont été utilisés pour étudier la régulation centrale de la fonction cardio-vasculaire 11, les effets de l&#39;anesthésie sur l&#39;activité neuronale 12, la réponse auditive du tronc cérébral 13 et traitement de l&#39;information 14. Les enregistrements entiers de cellules pionnières intracellulaires / des animaux de Behaving éveillés ont été réalisées dans les années 2000 et ont porté sur l&#39;activité neuronale liée à la perception et le mouvement 15-20. Vers la même époque, les premières études d&#39;imagerie microscopique sur des souris ont été éveillés pubblis, où microscopie biphotonique a été utilisé dans le cortex sensoriel de rats retenus physiquement et 7 sur des souris en cours d&#39;exécution sur un tapis roulant sphérique 21. Études in vivo de microscopie et d&#39;électrophysiologie ultérieures ont démontré qu&#39;une préparation tête de fixation peut être combiné avec succès avec paradigmes comportementaux basés sur les mouvements des membres antérieurs, reconnaissance d&#39;odeurs, en fouettant, et lécher 8,22-25. Souris placés sur le tapis roulant sphérique peuvent être formés pour naviguer dans l&#39;environnement visuel virtuel généré par un ordinateur 10,26. Des enregistrements intracellulaires / extracellulaires ont démontré que, chez un animal à tête fixe navigation tel environnement virtuel, l&#39;activation des cellules de lieu de l&#39;hippocampe peut être détectée 27. Dans un environnement visuel virtuel, les souris démontrent rythme thêta relatif aux mouvements normaux du potentiel de champ local et en phase thêta précession pendant le mouvement actif 27. Récemment, l&#39;activit spatiale et temporelledes motifs y de populations neuronales ont été enregistrées optiquement dans des souris au cours du travail des tâches de décision de la mémoire dans un environnement virtuel 28. Malgré avoir permis recherche de pointe, la conception de tapis roulant sphérique a plusieurs limites inhérentes. Tout d&#39;abord, l&#39;animal est nécessaire pour déplacer sur une surface illimitée d&#39;un ballon à air levé rotation, ce qui ne pose pas d&#39;obstacles tangibles tels que des murs ou des barrières. Cette limitation est seulement en partie compensée par la «réalité virtuelle» généré par ordinateur, parce que l&#39;entrée visuelle est sans doute moins efficace sur les souris et les rats par rapport à l&#39;entrée sensorielle tactile (par exemple, favori-touch ou lécher), dont ces espèces dépendent naturellement sur. En second lieu, la courbure importante de la surface de la bille peut être inconfortable pour les souris de laboratoire utilisées pour la marche sur un plancher plat dans leurs cages. Enfin, le diamètre même de la balle (au moins 200 mm pour les souris et 300 mm pour les rats) rend la dimension verticale de la sphériqueDispositif de tapis roulant relativement importante. Il est donc difficile de combiner tapis roulant sphérique avec la majorité des configurations disponibles dans le commerce de microscopie, et nécessite souvent la construction d&#39;une nouvelle installation dans le tapis roulant au moyen de cadres de microscope sur mesure. Ici, une nouvelle méthode est décrite où une souris de tête fixe peut se déplacer autour d&#39;un homecage air mobile levé qui dispose d&#39;un plancher plat et les murs tangibles, et explorer l&#39;environnement physique dans des conditions sans stress. Cet article explique les procédures de formation de la souris et de la tête de fixation, et fournit des exemples représentatifs où la microscopie à deux photons, imagerie optique intrinsèque et de patch-clamp enregistrements sont effectués dans le cerveau de souris Behaving éveillé.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="733">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:141px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Tweezers&#160; Stainless Steel, 115mm</td>
			<td style="width:161px;">XYtronic</td>
			<td style="width:141px;">XY-2A-SA</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Animal trimmer, shaving machine</td>
			<td style="width:161px;">Aesculap</td>
			<td style="width:141px;">Isis GT420</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Binocular Microscope</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Stemi 2000</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad</td>
			<td style="width:161px;">Supertech</td>
			<td style="width:141px;">TMP-5b</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Blunt microsurgical blade</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:141px;">REF 374769</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Borosilicate tube with filament</td>
			<td style="width:161px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:141px;">BF120-69-10</td>
			<td style="width:173px;">For patch pipette production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Camera&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Foscam</td>
			<td style="width:141px;">FI8903W</td>
			<td style="width:173px;">Night visibility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Carprofen</td>
			<td style="width:161px;">Pfizer</td>
			<td style="width:141px;">Rimadyl vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dental cement</td>
			<td style="width:161px;">DrguDent, Dentsply</td>
			<td style="width:141px;">REF 640 200 271</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:161px;">FaunaPharma</td>
			<td style="width:141px;">Rapidexon vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Disposable drills</td>
			<td style="width:161px;">Meisinger</td>
			<td style="width:141px;">HP 310104001001008</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dulbeco&#8217;s PBS 10X</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:141px;">D1408</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dumont #5 forceps, 110 mm</td>
			<td style="width:161px;">FST</td>
			<td style="width:141px;">91150-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:259px;">Eyes-lubricant</td>
			<td style="width:161px;">Novartis</td>
			<td style="width:141px;">Viscotears</td>
			<td style="width:173px;">For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Foredom drill control</td>
			<td style="width:161px;">Foredom&#160;</td>
			<td style="width:141px;">FM3545</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Foredom micro motor handpiece</td>
			<td style="width:161px;">Foredom</td>
			<td style="width:141px;">MH-145</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Four-winged metal holder</td>
			<td style="width:161px;">Neurotar</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Head Holder for Mice</td>
			<td style="width:161px;">Narishige</td>
			<td style="width:141px;">SG-4N</td>
			<td style="width:173px;">Assembled on stereotaxic instrument</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Hemostasis Collagen Sponge</td>
			<td style="width:161px;">Avitene, Ultrafoam BARD</td>
			<td style="width:141px;">Ref 1050050</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Imaris</td>
			<td style="width:161px;">Bitplane</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Ketamine</td>
			<td style="width:161px;">Intervet</td>
			<td style="width:141px;">Ketaminol vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Kwik-Sil&#160;</td>
			<td style="width:161px;">WPI</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Mai Tai DeepSee laser</td>
			<td style="width:161px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Micro dressing forceps, 105 mm</td>
			<td style="width:161px;">Aesculap</td>
			<td style="width:141px;">BD302R</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Microelectrode puller</td>
			<td style="width:161px;">Narishige</td>
			<td style="width:141px;">PC-10H</td>
			<td style="width:173px;">Vertical puller for glass pipette production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:161px;">Sensapex</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Mini bolt</td>
			<td style="width:161px;">Centrostyle</td>
			<td style="width:141px;">Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Mobile Homecage</td>
			<td style="width:161px;">Neurotar</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:259px;">Multiphoton Laser Scanning Microscope</td>
			<td style="width:161px;">Olympus</td>
			<td style="width:141px;">FV1000MPE</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:259px;">Nonwoven swabs 5&#215;5</td>
			<td style="width:161px;">Molnlycke Health Care</td>
			<td style="width:141px;">Mesoft</td>
			<td style="width:173px;">Surgical tampons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Polyacrylic glue</td>
			<td style="width:161px;">Henkel</td>
			<td style="width:141px;">Loctite 401</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:259px;">Round glass coverslip&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:141px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1.5 thickness&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Small animal stereotaxic instrument</td>
			<td style="width:161px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:141px;">900</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Student iris scissors, straight 11.5 cm</td>
			<td style="width:161px;">FST</td>
			<td style="width:141px;">91460-11</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Xylazine</td>
			<td style="width:161px;">Bayer Health Care</td>
			<td style="width:141px;">Rompun vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents

Il est largement reconnu que l&#39;utilisation d&#39;anesthésiques généraux peut nuire à la pertinence des données électrophysiologiques ou microscopiques obtenues à partir du cerveau d&#39;un animal vivant. En outre, la longue récupération de l&#39;anesthésie limite la fréquence des épisodes répétés d&#39;enregistrement / d&#39;imagerie dans des études longitudinales. Par conséquent, de nouvelles méthodes qui permettraient enregistrements stables de souris Behaving non anesthésiés sont attendus pour faire avancer les domaines des neurosciences cellulaires et cognitives. Les solutions existantes vont de la simple contrainte physique à des approches plus sophistiquées, telles que les tapis roulants linéaires et sphériques utilisées en combinaison avec la réalité virtuelle générée par ordinateur. Ici, une nouvelle méthode est décrite où une souris de tête fixe peut se déplacer autour d&#39;un homecage air mobile levé et explorer son environnement dans des conditions sans stress. Cette méthode permet aux chercheurs d&#39;effectuer des tests de comportement (par exemple, l&#39;apprentissage, l&#39;accoutumance ou roman reconnaissance d&#39;objet) en même temps quedeux photons imagerie microscopique et / ou des enregistrements de patch-clamp, toutes réunies en une seule expérience. Cette vidéo-article décrit l&#39;utilisation de l&#39;appareil de tête d&#39;animal de fixation éveillé (de homecage mobile), démontre les procédures d&#39;accoutumance des animaux, et illustre un certain nombre d&#39;applications possibles de la méthode.

La méthode présentée ici est destiné à l&#39;imagerie microscopique ou unicellulaires enregistrements électrophysiologiques chez des souris éveillées, tête fixe mais sinon librement mobiles et se comportent. L&#39;animal peut se déplacer dans deux dimensions en un réel (par opposition au virtuel), l&#39;environnement matériel et familier, tandis que le crâne de l&#39;animal est solidement fixé au bras tête de fixation. Habituant la souris à la homecage air mobile levé compose de 4-6 jours de séances biquotidiennes formation de 2 h (Figure 1). Les animaux formés peuvent ensuite être utilisés immédiatement dans les expériences. Une étude typique comprend un certain nombre de séances d&#39;imagerie ou de sessions d&#39;enregistrement patch-clamp qui sont espacées à des intervalles allant de quelques heures à plusieurs jours ou semaines. Surtout, les deux enregistrements optiques et électrophysiologiques peuvent être effectuées simultanément avec des stimuli et des indicateurs comportementaux ou cognitifs, dans une expérience unique. Pour évaluer la stabilité mécanique detête de fixation de la souris dans la homecage mobile, les séquences d&#39;images de navires corticales marqués avec dextran fluorescent conjugué et de dendrites corticaux exprimant YFP ont été recueillies alors que les animaux de laboratoire naviguaient le homecage mobile (figure 2). Les déplacements maximaux du cerveau au cours de la locomotion de l&#39;animal ne dépassent pas généralement 1-1,5 micromètres. Ces déplacements se sont produites dans les directions horizontale et très rarement donné lieu à un changement détectable du plan d&#39;imagerie, ce qui rend inutile toute correction d&#39;artefacts de mouvement. Fixation stable de la tête dans homecage mobile permet la quantification des épines dendritiques individuelles chez les animaux éveillés avec la même fiabilité que dans des souris anesthésiées. Densité des épines dendritiques, la morphologie et le chiffre d&#39;affaires peuvent être surveillés au cours des études longitudinales avec des séances d&#39;imagerie multiples effectuées à des intervalles allant de quelques heures à plusieurs jours ou semaines. La facilité d&#39;utilisation de la mobile homecage pour l&#39;imagerie optique fonctionnelle a été testé dans le cortex somatosensoriel des souris éveillées en utilisant deux approches: i) la microscopie à deux photons sur les souris transgéniques Thy1-GCaMP3 et ii) intrinsèque imagerie de signal optique chez les souris de type sauvage. Ca 2 + imagerie a été effectuée dans la couche 2/3, qui contient des corps cellulaires des neurones marqués par fluorescence nombreux, ainsi que leurs dendrites et des axones (figure 3). Les parcelles de fluorescence sur la durée de certaines régions d&#39;intérêt (ROI) sont présentés dans la figure 3, montrant l&#39;activité neuronale spontanée (mesurée par des augmentations transitoires de fluorescence de GCaMP3) pendant la navigation active de la souris dans la homecage mobile. L&#39;imagerie optique basé sur des signaux intrinsèques permet de cartographier la distribution spatiale des domaines fonctionnels. Figure 4 illustre les changements de forme ondulée dans le niveau d&#39;oxygénation du sang (reflétant l&#39;activation neuronale régionale) qui propagent le long de cortex somatosensoriel en réponse à vibrissa stimulation à la fréquence de 0,05 Hz. Pour tester la faisabilité de patch-clamp enregistrements avec homecage mobile, nous avons utilisé des souris C57BL/6J 2-3 mois vieux. Couche 2/3 de neurones dans le cortex somatosensoriel ont été enregistrés à partir de la configuration de cellules entières en utilisant le mode de blocage de courant. Enregistrement patch-clamp dans le cerveau de souris éveillé tête fixée sur homecage mobile était essentiellement similaire à aveugler patch-clamp dans des tranches de cerveau. Environ 50% des tentatives pour résultat la formation de gigaseal réussi, dont plus de 70% a produit stable enregistrement de configuration à cellules entières. Aucun événement de perdre le contact gigaseal par déplacement mécanique de cellules ont été observées. Figure 5 illustre un fragment de 60 secondes d&#39;un représentant de 10 minutes de temps d&#39;enregistrement actuel pince corrélée avec des épisodes de actif (marche) de la souris et (au repos) Etats passifs. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in"src = &quot;/ files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figure 1. La méthode de fixation tête de souris éveillé dans la homecage mobile. A) Vue d&#39;ensemble de la conception de homecage air mobile levé et illustrations du concept général. B) Schéma d&#39;un calendrier expérimental typique. L&#39;étude commence à l&#39;implantation de la fenêtre crânienne deux semaines avant habituer la souris pour la manutention et de l&#39;emballage, qui est suivi par huit formations deux fois par jour. L&#39;étude typique comprend un certain nombre de séances d&#39;imagerie ou de sessions d&#39;enregistrement patch-clamp qui sont espacées à des intervalles allant de quelques heures à plusieurs jours ou semaines. Les deux mesures optiques et électrophysiologiques peuvent être faites en parallèle avec des stimuli et des indicateurs cognitifs ou comportementaux au sein d&#39;une seule expérience. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 2. Exemple de deux photons imagerie microscopique sur des souris éveillées en mouvement autour de la homecage mobile. A, B) du système vasculaire corticale, marqué avec le dextrane conjugué à du rouge Texas 70 kDa. Le diamètre des segments individuels de bateau est mesurée en traçant au fil du temps le profil des lignes à travers la lumière du vaisseau pendant les périodes de repos et de fonctionnement (A) de la souris. La vitesse d&#39;écoulement du sang dans les artères et les veines est mesurée par la ligne de balayage le long des lignes tracées parallèlement à la paroi de la cuve (B). C, D) détails fins de la morphologie neuronale visualisée dans le cerveau de souris transgéniques qui expriment la YFP en sous-population de neurones dans le cadre du promoteur Thy1. Reconstruction tridimensionnelle des neurones pyramidaux du cortex somatosensoriel de la souris (C). Les images d&#39;un b dendritiqueranch acquis, une souris se comporter éveillé sont suffisamment stables pour la quantification de personne épines dendritiques morphologie (D). E) Quantification du mouvement au cerveau causés par les mouvements de la souris. Des déplacements plus importants d&#39;amplitude en corrélation avec les périodes de fonctionnement de la souris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" width="600" /> Figure 3. Exemple d&#39;activité de la population neuronale dans éveillé Thy1-GCaMP3 souris se déplacer autour de la homecage mobile. A) l&#39;image à deux photons de la couche corticale II / III neurones. ROI, par exemple les corps cellulaires neuronaux, dendrites et des axones sont indiqués en jaune. B) AF / F traces de la fluorescence de GCaMP3 de ROI indiquées dans A (temps depêches enregistré à 1.5 sec / image). C) zoomée en région imagée à 65 ms / cadre. D) Fluorescence de ROI jaunes dans C tracée au fil du temps, montre les augmentations transitoires (rouge) de la fluorescence de GCaMP3 qui correspondent à l&#39;action Ca 2 + épisodes potentiels induits par d&#39;afflux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" width="600" /> Figure 4. L&#39;exemple de cartographie de la répartition spatiale des réponses fonctionnelles dans le cortex d&#39;une souris éveillés au moyen d&#39;une image des signaux optiques intrinsèques. A) de Bright champ des vaisseaux sanguins superficiels par la fenêtre crânienne. B) carte Magnitude de l&#39;activité de base dans ho mobilesmecage lors d&#39;un épisode de 6 minutes. C) carte Magnitude de l&#39;activité neuronale se propageant le long cortex somatosensoriel en réponse à la stimulation de vibrisses à une fréquence de 0,05 Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" width="600" /> Figure 5. Exemple de cellule entière d&#39;enregistrement patch-clamp dans le cortex de souris éveillé un déplacement autour de la homecage mobile. A) l&#39;enregistrement actuel-clamp d&#39;un neurone dans la couche corticale de la souris 2/3. A 0,5 sec, injection de courant de 100 pA (indiqué ci-dessous la trace) se traduit par une salve de potentiels d&#39;action. La cellule a montré la fréquence de pic adaptation caractéristique de neurones pyramidaux. B) continue l&#39;enregistrement courant pincede la même neurone en corrélation avec l&#39;activité souris »locomoteur (en rose ci-dessus la trace). Activité spontanée représentant de la couche 2/3 neurones pendant les périodes de la souris de repos (C) et le fonctionnement (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" width="600" /> Figure 6. Perte de poids des animaux et de l&#39;activité locomotrice des souris head-fixed/non-fixed au cours des sessions de formation dans le homecage mobile. A) poids de l&#39;animal (moyenne + SD,%) avant les sessions de formation. Notez que la perte de poids est intégralement reprise par la session de formation 7-8 ème. B) de la trajectoire horizontale de locomotion rapport de la souris pour le homecage mobile,qui a été extrapolée à partir de la circulation suivi de la homecage mobile pendant 8 ème session de formation. C) des mouvements chenilles d&#39;une souris non-tête fixe explorer la cage ronde pendant 8 ème session de formation. D) Durée de la tête fixe (cercle) et non-fixe (triangle) mouvement de la souris pendant 1-4 ème journée de formation (moyenne + SD,%). Notez que, le jour 4, les souris de tête-Correction de l&#39;affichage ni gel (comme le jour 1), ni l&#39;activité locomotrice excessive. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

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