Name: flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents
Uploaded: 2014-06-29T14:30:00
Duration: 14 min 2 s
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Gli autori ringraziano il Prof. Eero Castren per i suoi preziosi commenti sul manoscritto. Il lavoro è sostenuto da finanziamenti L&#39;Accademia di Finlandia, il Centro per la Mobilità Internazionale della Finlandia, e il finlandese Graduate School of Neuroscience (cervello e della mente Dottorato).

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per meglio comprendere la fisiologia del cervello e patologia, la ricerca deve essere eseguita su una varietà di livelli di complessità di preparazione, utilizzando le tecniche più appropriate per ciascun preparato. Allo stato attuale, una vasta gamma di metodologie neuroscienze (da full-body fMRI alla microscopia STED sub-organello) sono facilmente applicati agli animali anestetizzati, mentre esperimenti su animali svegli e comportarsi hanno rappresentato una sfida metodologica significativo. Qui, un nuovo approccio è descritto in cui un animale da laboratorio, pur essendo fermamente testa fissa, in grado di muoversi un homecage mobile-aria alzato ed esplorare il suo ambiente concreto in condizioni senza stress. La preparazione animale testa fissa comportarsi qui presentato offre una serie di vantaggi importanti. In primo luogo, i dati elettrofisiologici o di imaging ottenuti con questo metodo sono compromessi né dalla anestesia né da stress vincolare indotta. Posizionamento del mouse in casa mobilegabbia è veloce e non richiede l&#39;anestesia l&#39;animale, anche transitoriamente. In secondo luogo, la homecage aria sollevata assicura la stabilità meccanica necessaria per quantificare i cambiamenti in fine morfologia neuronale e registrare cella singola attività elettrofisiologica in animali svegli. Infine, il design del homecage mobile è più compatta rispetto al tapis roulant sferica, consentendo il posizionamento della homecage mobile sotto un microscopio verticale standard per due fotoni imaging o registrazione patch-clamp in cervello sveglio del mouse. Fissazione testa ferma nel homecage mobile richiede l&#39;impianto di un supporto metallico a quattro ali appositamente progettato, con una apertura circolare al centro per l&#39;accesso ottica o elettrica alla regione cerebrale sottostante. Questi supporti metallici sono attaccati al cranio mediante una combinazione di colla, cemento dentale e di una vite avvitata nell&#39;osso cranio. Questa procedura chirurgica è stata sviluppata sulla base di un gran numero di precedentementeprocedure pubblicate, ed è stato trovato per causare un preparato finestra cranica stabile e riproducibile. Per gli esperimenti in vivo elettrofisiologiche, una finestra a forma di mezzaluna 34, una piccola craniotomia dimensioni (inferiore a 0,5 mm) 32, e una preparazione copertura in vetro forato 35 sono state utilizzate. Qui, il &quot;invertito&quot; finestra del cranio è stato impiantato sia con un grande (diametro 3,5 mm) o piccole (diametro inferiore a 0,5 mm) craniotomia. Riducendo al minimo movimento del cervello è fondamentale per le registrazioni singola cellula stabili, è per questo che è consigliabile eseguire craniotomie di piccole dimensioni per esperimenti di elettrofisiologia. Dopo l&#39;impianto della finestra cranica per esperimenti di imaging ottico, gli animali possono recuperare per almeno 2 o 3 settimane, durante il quale la finestra perde prima transitoriamente la sua trasparenza e poi riacquisisce essa (con una resa del 50-70%, a seconda background genetico del ceppo mouse). La trasparenza della finestra cranica e la stabilitàlità del cemento &quot;tappo&quot; dentale attaccato al cranio può essere verificata mediante un microscopio binoculare regolare e ispezione fisica durante la movimentazione degli animali. Al termine del periodo di recupero di 2-3 settimane, gli animali che presentano segni di infiammazione residua post-operativa o difetti meccanici in cemento dentale dovrebbero essere escluse dagli esperimenti e terminati. L&#39;età ottimale per iniziare la formazione del topo è di 2-4 mesi (corrispondente al peso di 20-40 g). Negli animali giovani, ancoraggio del cemento &quot;tappo&quot; dentale al cranio può essere inaffidabile, che può diminuire la sua resistenza alle sollecitazioni meccaniche che viene imposto dal locomozione del mouse testa fissa nel homecage mobile. Sebbene topi maschi e femmine appaiono ugualmente disposti a spostarsi in homecage mobile, c&#39;è una tendenza per ottenere una migliore percentuale di intervalli cranici recuperare la loro trasparenza nei topi femmina (dati non mostrati). Quindi, per to garantire un equilibrato mix di generi nella coorte di animali selezionati per l&#39;imaging, l&#39;impianto finestre craniche in circa il 30% più topi maschi è raccomandato. Interazioni sociali sono noti per migliorare il benessere degli animali e ridurre lo stress, quindi è consigliabile che fratellini siano gestiti e addestrati in parallelo e tenuti insieme in gabbie di stabulazione in gruppo. In contrasto con le procedure pubblicate per la preparazione treadmill sferica 13, il metodo che utilizza la homecage mobile non richiede anestetizzare il mouse al momento del fissaggio testa. Questa differenza è importante perché consente di escludere eventuali effetti residui che anche una breve e &quot;leggera&quot; episodio anestesia rischia di avere sulle misurazioni fisiologiche ottenute poco dopo. Infatti, anche se negli studi in cui la fissazione di testa è stato fatto sotto anestesia e gli esperimenti reali sono state avviate dopo un breve periodo di attesa 13, non si puòescludere eventuali effetti a lungo termine del breve episodio anestesia sui dati sperimentali. Altri studi si sono basati sulla privazione di acqua per assuefazione sistematica degli animali a testa di fissaggio e usato ricompensa acqua come mezzo di motivare l&#39;animale a rimanere immobile 36. Tuttavia, il metodo di fissazione testa ricompensa a base limita la scelta dei test comportamentali applicabili e, soprattutto, occupa una delle associazioni stimolo-ricompensa ben consolidati. Al contrario, il metodo di topo assuefazione alla testa di fissaggio in homecage mobile non richiede privazione di acqua e successiva premio. Completando la homecage mobile con un sistema di erogazione di acqua è consigliato per gli esperimenti di lunga durata. Le sessioni di addestramento di animali ed esperimenti qui presentate sono state fatte durante il giorno (8:00-06:00), che corrisponde al periodo fisiologicamente passivo per quei topi che vengono tenuti sotto il piano della luce di 12 ore standard (lillum na su alle 6 del mattino e si spegne alle 06:00). Poiché l&#39;assunzione di acqua è direttamente associato con l&#39;attività del topo, durante i topi periodo passivi non richiedono erogazione acqua se la durata di una sessione di allenamento / immagini / registrazione non superi 2 ore. Oltre alla tempistica e la durata delle sessioni di formazione, si ha la necessità di affrontare la questione del numero ottimale di sedute necessarie per abituare gli animali homecage mobile. A tal fine, due criteri sono stati utilizzati per valutare lo stress indotto dalla testa le procedure di fissaggio: i) la perdita di peso, e ii) il livello di attività locomotoria. Come mostrato in Figura 6, la perdita di peso raggiunge il livello medio del 6% sulla formazione giorno 2, ed è completamente invertito giornata di formazione 4 (Figura 6A). Coerentemente con le dinamiche di pesatura, il livello di attività locomotoria degli animali testa-fisso viene soppresso il primo giorno di formazione, ma stabilizza dopo giorno formazione 4 (Figura 6D). In base a queste misurazioni, si sugt che la durata minima del periodo di formazione mouse su homecage cellulare è di 4 giorni, come descritto nel presente protocollo. L&#39;uso del-aria sollevata, homecage mobili TV a pavimento permette di aggiungere compiti complessi (sensomotorie, percettive e cognitive) ai paradigmi di formazione per topi testa-fisso. Nel presente studio vengono presentati due protocolli di test comportamentali. Entrambi i protocolli utilizzano tracce olfattive e possono essere combinati con longitudinali immagini / registrazioni nella corteccia mouse. Anche se il homecage cellulare viene prodotta con materiali non assorbenti, bisogna comunque tenere conto di possibili interferenze tra l&#39;odore del dispositivo e prova di odore (s). Un altro fattore che può interferire con visuali / segnali tattili di un esperimento comportamentale è la giunzione tra la parete e l&#39;inserto, che non è perfetta e può, quindi, essere percepito dal l&#39;animale come un punto di riferimento. Vale la pena notare qui che, al fine di minimizzare lo stress dell&#39;animale durante tale integrazionerventions il posizionamento di un cotone odore presentando alla parete homecage mobile, sperimentatore dovrebbero praticare effettuare tali interventi il ​​più rapidamente possibile, evitando manipolazione prolungata della gabbia carbonio. Strategie per romanzo presentazione odore / oggetto alternative sono concepibili, ad esempio, ponendo soluzione a base di idrogel gocce o oggetti (quali chip alimentari) su piccole mensole fissate alla superficie interna della parete della gabbia carbonio all&#39;altezza compatibile con posizionamento testa dell&#39;animale. Homecage Mobile consente di animali testa-fisso per eseguire una vasta gamma di movimenti bidimensionali tra cui locomozione orizzontale, situp, governare, sbattere, leccare, naso frugando, i movimenti delle zampe anteriori qualificati, e toccante parete con arti anteriori, come illustrato nel presente studio . Utilizzando homecage mobile e protocolli qui presentati, i ricercatori possono studiare il sistema neuronale sensomotoria con un alto livello di controllo sia la condizione di stimolaziones e alle letture comportamentali. Inoltre, studi di capacità cognitive nei topi svegli possono essere eseguite durante il condizionamento, la navigazione spaziale e compiti decisionali. Ci sono diverse limitazioni pratiche di questo metodo. In primo luogo, è necessaria una notevole quantità di aria in pressione per raggiungere la potenza-homecage sollevamento ed effettuare esperimenti di lunga durata. In secondo luogo, la homecage cellulare nella sua attuale implementazione è solo 18 cm di diametro, e quindi fornisce una relativamente piccola e semplice spazio rispetto alla realtà virtuale, dove un ambiente sperimentale complesso può essere progettato senza limitazioni spaziali. In terzo luogo, durante il baffo stimolazione ed esperimenti a base di ricompensa-qui presentati, un dispositivo è stato utilizzato che limita la possibilità al muro contatto per il mouse. Aggiunta di un canale visivo o sensoriale esterno stimolazione (ad esempio un proiettore di luce-eye diretto) richiederebbe la progettazione di un dispositivo più ergonomico e compatto rispetto aii multipli a schermo o dome-proiezione soluzioni che sono stati utilizzati negli esperimenti tapis roulant sferiche. In sintesi, l&#39;uso dei topi testa fissa spostano nella homecage mobile-aria sollevata facilita notevolmente gli studi che combinano livelli cellulari, molecolari e comportamentali di osservazione e manipolazione in un singolo esperimento. Le applicazioni specifiche qui illustrati sono due fotoni di imaging microscopico, intrinseco di imaging segnale ottico e registrazioni di patch-clamp in topi Comportarsi non anestetizzati. Si prevede che questo approccio aprirà nuovi orizzonti nella sperimentazione su svegli, comportandosi mouse e servire come un utile strumento sia per lo sviluppo di farmaci e la ricerca di base delle funzioni cerebrali.

Una tendenza emozionante recente nelle Neuroscienze è sviluppare approcci sperimentali per cellulare e molecolare sondaggio delle reti neuronali nel cervello di veglia, comportandosi roditori. Tali approcci tenere la promessa di gettare nuova luce sui processi neurofisiologici che sono alla base della funzione motoria, integrazione sensomotoria, la percezione, l&#39;apprendimento, la memoria, così come la progressione del pregiudizio, neurodegenerazione e le malattie genetiche. Inoltre, la registrazione dal cervello di animali svegli promettente nello sviluppo di nuovi agenti terapeutici e trattamenti. Vi è una crescente consapevolezza che l&#39;anestesia, che è stato comunemente usato in esperimenti neurofisiologici, può influenzare i meccanismi di base della funzione cerebrale, che potrebbe condurre alla erronea interpretazione dei risultati sperimentali. Così, la ketamina anestetico ampiamente usato aumenta rapidamente la formazione di nuove spine dendritiche e migliora la funzione sinaptica 1; un altro anestetici comunemente usatiic isoflurano a livelli di anestesia chirurgica sopprime completamente l&#39;attività corticale spontanea nei ratti appena nati e blocca oscillazioni mandrino-burst in animali adulti 2. Attualmente, solo un numero limitato di approcci abilitare esperimenti in topi non anestetizzati mediante due fotoni di imaging microscopico o patch-clamp. Questi approcci possono essere suddivisi in preparazioni liberi di muoversi e di testa-fisso. L&#39;attrattiva unica di un preparato animale muoversi liberamente è che permette la valutazione del comportamento naturale, compresi i movimenti di tutto il corpo durante la navigazione. Un modo per l&#39;immagine all&#39;interno del cervello di un roditore muoversi liberamente è quello di collegare un microscopio da testa miniaturizzata o fibroscopio 3-5. Tuttavia, i dispositivi miniaturizzati tendono ad avere prestazioni ottiche limitato rispetto alla microscopia a due fotoni obiettivo a base, e non possono essere facilmente combinato con intere registrazioni cella patch-clamp 6. Il exiSoluzioni sting per la testa di fissazione di un roditore svegli si sono affidati principalmente sia sulla contenzione fisica 7,8 o sulla formazione l&#39;animale a esporre poggiatesta volontaria 9. Un altro approccio popolare è consentire arti dell&#39;animale per spostare appoggiandolo su, ad esempio, un tapis roulant sferico 10; questo approccio è spesso combinato con la realtà virtuale generata dal computer. Esperimenti di elettrofisiologia sui topi testa fissa sono in gran parte utilizzato le registrazioni extracellulari e sono stati utilizzati per studiare regolazione centrale della funzione cardiovascolare 11, effetti dell&#39;anestesia sull&#39;attività neuronale 12, la risposta uditiva del tronco encefalico 13 e di elaborazione delle informazioni 14. Le pionieristiche registrazioni intracellulari / cellule intere negli animali Comportarsi sveglio sono stati eseguiti negli anni 2000 e si sono concentrati su attività neurale legati alla percezione e movimento 15-20. Intorno allo stesso tempo, sono stati pubbli i primi studi di imaging microscopici sui topi svegliaccertata, dove microscopia a due fotoni è stato utilizzato nella corteccia sensoriale di ratti fisicamente trattenuto 7 e su topi in esecuzione su un tapis roulant sferico 21. Vivo studi di microscopia e di elettrofisiologia successive hanno dimostrato che un preparato fissazione testa può essere combinato con successo con paradigmi comportamentali basati sui movimenti degli arti anteriori, il riconoscimento degli odori, sbattere, e leccare 8,22-25. Topi immessi sul tapis roulant sferico possono essere addestrati per navigare l&#39;ambiente visivo virtuale generato da un computer 10,26. Registrazioni intracellulari / extracellulari dimostrato che, in un animale testa fissa navigazione tale ambiente virtuale, attivazione delle cellule di posizione ippocampali può essere rilevata 27. In un ambiente visivo virtuale, i topi mostrano normale movimento legate theta ritmo nel potenziale campo locale e theta fase di precessione durante il movimento attivo 27. Recentemente, il activit spaziale e temporaley modelli di popolazioni neuronali sono stati registrati otticamente in topi durante la lavorazione compiti di decisione memoria in un ambiente virtuale 28. Pur avendo abilitato ricerca d&#39;avanguardia, il design tapis roulant sferico ha diverse limitazioni intrinseche. In primo luogo, l&#39;animale deve spostare su una superficie illimitato di una palla di aria alzato rotante, che pone ostacoli materiali come muri o barriere. Questa limitazione è solo in parte compensato dalla &quot;realtà virtuale&quot; generati dal computer, perché input visivo è probabilmente meno efficace su topi e ratti rispetto all&#39;ingresso sensoriale tattile (ad esempio, baffo tasto o leccare), che queste specie naturalmente affidano on. In secondo luogo, la notevole curvatura della superficie della sfera può essere scomodo per i topi di laboratorio utilizzati per camminare su un pavimento piatto nelle loro gabbie. Infine, il diametro pura della palla (almeno 200 mm nei topi e 300 mm per ratti) rende la dimensione verticale della sfericaDispositivo tapis roulant relativamente grande. Questo rende difficile conciliare treadmill sferica con la maggioranza di configurazioni microscopia disponibili in commercio, e spesso richiede la costruzione di una nuova configurazione intorno al treadmill mediante telai microscopio su misura. Qui, un nuovo metodo è descritto in cui un topo testa fissa può muoversi un homecage mobile-aria alzato che dispone di un pavimento piatto e pareti tangibili, ed esplorare l&#39;ambiente fisico in condizioni di senza stress. Questo articolo illustra le procedure di formazione del mouse e la fissazione di testa, e fornisce esempi rappresentativi dove microscopia a due fotoni, imaging ottico intrinseca e patch-clamp registrazioni vengono eseguite nel cervello di topi Comportarsi sveglio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="733">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:141px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Tweezers&#160; Stainless Steel, 115mm</td>
			<td style="width:161px;">XYtronic</td>
			<td style="width:141px;">XY-2A-SA</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Animal trimmer, shaving machine</td>
			<td style="width:161px;">Aesculap</td>
			<td style="width:141px;">Isis GT420</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Binocular Microscope</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Stemi 2000</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad</td>
			<td style="width:161px;">Supertech</td>
			<td style="width:141px;">TMP-5b</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Blunt microsurgical blade</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:141px;">REF 374769</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Borosilicate tube with filament</td>
			<td style="width:161px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:141px;">BF120-69-10</td>
			<td style="width:173px;">For patch pipette production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Camera&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Foscam</td>
			<td style="width:141px;">FI8903W</td>
			<td style="width:173px;">Night visibility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Carprofen</td>
			<td style="width:161px;">Pfizer</td>
			<td style="width:141px;">Rimadyl vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dental cement</td>
			<td style="width:161px;">DrguDent, Dentsply</td>
			<td style="width:141px;">REF 640 200 271</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:161px;">FaunaPharma</td>
			<td style="width:141px;">Rapidexon vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Disposable drills</td>
			<td style="width:161px;">Meisinger</td>
			<td style="width:141px;">HP 310104001001008</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dulbeco&#8217;s PBS 10X</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:141px;">D1408</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dumont #5 forceps, 110 mm</td>
			<td style="width:161px;">FST</td>
			<td style="width:141px;">91150-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:259px;">Eyes-lubricant</td>
			<td style="width:161px;">Novartis</td>
			<td style="width:141px;">Viscotears</td>
			<td style="width:173px;">For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Foredom drill control</td>
			<td style="width:161px;">Foredom&#160;</td>
			<td style="width:141px;">FM3545</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Foredom micro motor handpiece</td>
			<td style="width:161px;">Foredom</td>
			<td style="width:141px;">MH-145</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Four-winged metal holder</td>
			<td style="width:161px;">Neurotar</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Head Holder for Mice</td>
			<td style="width:161px;">Narishige</td>
			<td style="width:141px;">SG-4N</td>
			<td style="width:173px;">Assembled on stereotaxic instrument</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Hemostasis Collagen Sponge</td>
			<td style="width:161px;">Avitene, Ultrafoam BARD</td>
			<td style="width:141px;">Ref 1050050</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Imaris</td>
			<td style="width:161px;">Bitplane</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Ketamine</td>
			<td style="width:161px;">Intervet</td>
			<td style="width:141px;">Ketaminol vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Kwik-Sil&#160;</td>
			<td style="width:161px;">WPI</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Mai Tai DeepSee laser</td>
			<td style="width:161px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Micro dressing forceps, 105 mm</td>
			<td style="width:161px;">Aesculap</td>
			<td style="width:141px;">BD302R</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Microelectrode puller</td>
			<td style="width:161px;">Narishige</td>
			<td style="width:141px;">PC-10H</td>
			<td style="width:173px;">Vertical puller for glass pipette production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:161px;">Sensapex</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Mini bolt</td>
			<td style="width:161px;">Centrostyle</td>
			<td style="width:141px;">Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Mobile Homecage</td>
			<td style="width:161px;">Neurotar</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:259px;">Multiphoton Laser Scanning Microscope</td>
			<td style="width:161px;">Olympus</td>
			<td style="width:141px;">FV1000MPE</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:259px;">Nonwoven swabs 5&#215;5</td>
			<td style="width:161px;">Molnlycke Health Care</td>
			<td style="width:141px;">Mesoft</td>
			<td style="width:173px;">Surgical tampons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Polyacrylic glue</td>
			<td style="width:161px;">Henkel</td>
			<td style="width:141px;">Loctite 401</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:259px;">Round glass coverslip&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:141px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1.5 thickness&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Small animal stereotaxic instrument</td>
			<td style="width:161px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:141px;">900</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Student iris scissors, straight 11.5 cm</td>
			<td style="width:161px;">FST</td>
			<td style="width:141px;">91460-11</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Xylazine</td>
			<td style="width:161px;">Bayer Health Care</td>
			<td style="width:141px;">Rompun vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents

E &#39;ampiamente riconosciuto che l&#39;uso di anestetici generali può minare la pertinenza dei dati elettrofisiologici o microscopiche ottenute dal cervello di un animale vivo. Inoltre, il lungo recupero dall&#39;anestesia limita la frequenza degli episodi ripetuti di registrazione / di imaging in studi longitudinali. Quindi, nuovi metodi che permettano registrazioni stabili da topi Comportarsi non anestetizzati sono tenuti a far avanzare i campi delle neuroscienze cellulari e cognitive. Soluzioni esistenti spaziano dalla mera contenzione fisica ad approcci più sofisticati, come il tapis roulant lineari e sferici usati in combinazione con la realtà virtuale generata dal computer. Qui, un nuovo metodo è descritto in cui un topo testa fissa può muoversi un homecage mobile-aria alzato ed esplorare il suo ambiente in condizioni di senza stress. Questo metodo permette ai ricercatori di effettuare test comportamentali (ad esempio, l&#39;apprendimento, assuefazione o di riconoscimento romanzo oggetto) in contemporanea condue fotoni di imaging microscopico e / o patch-clamp, tutti combinati in un singolo esperimento. Questo video-articolo descrive l&#39;uso del dispositivo di fissaggio testa animale sveglio (homecage mobile), dimostra le procedure di assuefazione animale, ed esemplifica una serie di possibili applicazioni del metodo.

Il metodo presentato qui è inteso per l&#39;imaging microscopico o monocellulari registrazioni elettrofisiologiche in Svegliatevi, topi testa fissa ma altrimenti liberamente in movimento e si comportano. L&#39;animale può muoversi in due dimensioni in un vero e proprio (al contrario di virtuale), l&#39;ambiente tangibile e familiare, mentre il cranio degli animali è fissato saldamente al braccio di fissaggio testa. Abituare i topi al homecage mobile-aria sollevata consiste di 4-6 giorni di sessioni di formazione di 2 ore due volte al giorno (Figura 1). Gli animali addestrati possono essere usati negli esperimenti immediatamente. Uno studio tipico comprende un certo numero di sessioni di imaging o sessioni di registrazione patch-clamp che sono distanziati a intervalli che vanno da poche ore a diversi giorni o settimane. È importante sottolineare che entrambe le registrazioni ottiche ed elettrofisiologiche possono essere eseguite contemporaneamente stimoli cognitivi o comportamentali e letture, in un singolo esperimento. Per valutare la stabilità meccanicatesta di fissaggio del mouse nella homecage mobile, le sequenze di immagini di navi corticali etichettati con destrano fluorescente coniugato e dei dendriti corticali esprimenti YFP sono stati raccolti mentre gli animali sperimentali sono state navigando il homecage mobile (Figura 2). Gli spostamenti massimi del cervello durante la locomozione dell&#39;animale non hanno in genere superano 1-1,5 micrometri. Tali spostamenti sono verificati nelle direzioni orizzontale e molto raramente provocato uno spostamento rilevabile del piano dell&#39;immagine, rendendo superflua qualsiasi correzione di artefatti di movimento. Stabile fissazione testa homecage mobile consente la quantificazione delle singole spine dendritiche in animali svegli con la stessa affidabilità in topi anestetizzati. Densità delle spine dendritiche, la morfologia e il fatturato possono essere monitorati durante gli studi longitudinali con più sessioni di imaging eseguiti ad intervalli che vanno da poche ore a diversi giorni o settimane. L&#39;usabilità del mobile homecage per l&#39;imaging ottico funzionale è stato testato in corteccia somatosensoriale di topi svegli utilizzando due approcci: i) microscopia a due fotoni sui topi transgenici Thy1-GCaMP3 e ii) intrinseca di imaging segnale ottico in topi wild-type. Ca 2 + immagini sono state eseguite a livello 2/3, che contiene corpi cellulari di molti neuroni fluorescente, così come i loro dendriti e assoni (Figura 3). Le trame di fluorescenza-over-time provenienti da regioni selezionate di interesse (ROI) sono mostrati in figura 3, dimostrando l&#39;attività neuronale spontanea (misurata come aumenti transitori GCaMP3 fluorescenza) durante la navigazione attiva del mouse nella homecage mobile. Imaging ottico basato su segnali intrinseci permette la mappatura della distribuzione spaziale dei domini funzionali. Figura 4 illustra i cambiamenti ondulatori nel livello di ossigenazione del sangue (che riflettono attivazione neuronale regionale) che propagano lungo corteccia somatosensoriale in risposta a vibrissa stimolazione alla frequenza di 0,05 Hz. Per testare la fattibilità di registrazioni di patch-clamp con homecage mobile, abbiamo usato 2-3 mesi di età topi C57BL/6J. Layer 2/3 neuroni nella corteccia somatosensoriale sono stati registrati in configurazione da cellula intera utilizzando la modalità morsetto corrente. Registrazione patch-clamp nel cervello di topi sveglio testa fissa sulle homecage mobile era essenzialmente simile ai non vedenti di patch-clamp in fettine cerebrali. Circa il 50% dei tentativi provocato formazione gigaseal successo, di cui più del 70% ha prodotto la registrazione cellula intera configurazione stabile. Non sono stati osservati eventi di perdere il contatto gigaseal dovuti allo spostamento meccanico delle cellule. Figura 5 illustra un frammento di 60 secondi di un rappresentante di 10 minuti lungo di registrazione corrente-clamp correlata con episodi di attivo (in esecuzione) di topo e (a riposo) stati passivi. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in"src = &quot;/ files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figura 1. Metodo della testa di fissaggio di topi sveglio nel homecage mobile. A) Presentazione del progetto homecage mobile-aria sollevata e illustrazioni del concetto generale. B) Schema di un tipico temporale sperimentale. Lo studio inizia con l&#39;impianto della finestra cranica due settimane prima abituare il mouse per movimentazione e confezionamento, che è seguita da otto allenamenti due volte al giorno. Lo studio tipico include un numero di sessioni di imaging o sessioni di registrazione patch clamp che sono distanziati a intervalli che vanno da poche ore a diversi giorni o settimane. Entrambe le misure ottiche ed elettrofisiologiche può essere fatto in parallelo con stimoli e letture cognitive o comportamentali all&#39;interno di un singolo esperimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 2. Esempio di due fotoni di imaging microscopico su topi svegli movimento intorno al homecage mobile. A, B) vascolare corticale, etichettato con il destrano Red coniugato 70 kDa Texas. Il diametro dei singoli segmenti di flotta è misurata tracciando nel tempo il profilo delle linee tracciate tra il lume del vaso durante i periodi di riposo di topo e in esecuzione (A). Il tasso di flusso di sangue nelle arterie e vene viene misurata mediante scansione lineare lungo le linee tracciate parallelamente alla parete del serbatoio (B). C, D) Belle dettagli di morfologia neuronale visualizzato nel cervello di topi transgenici che esprimono YFP in sottopopolazione di neuroni sotto il promotore Thy1. Ricostruzione tridimensionale dei neuroni piramidali corteccia somatosensoriale del mouse (C). Le immagini di un dendritica branch acquisito in una veglia, comportandosi del mouse sono sufficientemente stabili per la quantificazione dei singoli spine morfologia dendritica (D). E) Quantificazione del movimento cerebrale causato da movimenti del mouse. Più grandi spostamenti di ampiezza correlano con i periodi di funzionamento del mouse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Esempio di attività della popolazione neuronale in veglia Thy1-GCaMP3 del mouse si muove intorno al homecage mobile. A) l&#39;immagine a due fotoni di strato corticale II / III neuroni. ROI, per esempio neuronali corpi cellulari, dendriti e assoni sono mostrati in giallo. B) Af / F tracce della fluorescenza GCaMP3 dal ROI mostrati in A (tempo di serie registrata a 1.5 sec / frame). C) ingrandita in regione ripreso a 65 msec / telaio. D) Fluorescenza dal ROI gialli in C tracciato nel corso del tempo, mostra i transitori aumenti (rosso) in fluorescenza GCaMP3 che corrispondono all&#39;azione potenziali indotti Ca 2 + episodi afflusso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Esempio di mappatura della distribuzione spaziale delle risposte funzionali nella corteccia di un mouse sveglio mediante l&#39;imaging segnali ottici intrinseci. A) Visione luminosa campo dei vasi sanguigni superficiali attraverso la finestra cranica. B) Entità mappa della attività di base in mobile homecage durante un episodio di 6 minuti. C) mappa Entità dell&#39;attività neuronale si propaga lungo corteccia somatosensoriale in risposta alla stimolazione vibrissa ad una frequenza di 0,05 Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" width="600" /> Figura 5. Esempio di whole-cell patch-clamp registrazione nella corteccia di un mouse sveglio spostamento in homecage mobile. A) di registrazione corrente-clamp da un neurone nello strato corticale del mouse 2/3. 0,5 sec, iniezione di corrente da 100 pA (di seguito indicato la traccia), si traduce in uno scoppio di potenziali d&#39;azione. La cella ha mostrato adattamento frequenza caratteristica spike per i neuroni piramidali. B) Continuo registrazione corrente-clampdal medesimo neurone correlata con l&#39;attività del mouse &#39;locomotoria (mostrato in rosa sopra la traccia). Attività spontanea Rappresentante dello strato di 2/3 dei neuroni durante i periodi di mouse del riposo (C) e in esecuzione (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" width="600" /> Figura 6. Perdita di peso degli animali e dell&#39;attività locomotoria nei topi head-fixed/non-fixed durante le sessioni di formazione in homecage mobile. A) il peso degli animali (media + SD,%) prima di allenamenti. Si noti che la perdita di peso è completamente annullata dalla 7-8 ° allenamento. B) traiettoria del mouse locomozione orizzontale rispetto al homecage mobile,che è stato estrapolato dal movimento tracciato della homecage mobile durante 8 ª sessione di formazione. C) i movimenti cingolati di un mouse non-head-fisso esplorare la gabbia rotonda durante l&#39;8 ª sessione di formazione. D) Durata della testa fissa (cerchio) e non fisso (triangolo) il movimento topi durante 1-4 ° giorno di allenamento (media + SD,%). Si noti che, il giorno 4, i topi testa-fisso non presentano né congelamento (come il giorno 1), né un eccesso di attività locomotoria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

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