Name: flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents
Uploaded: 2014-06-29T14:30:00
Duration: 14 min 2 s
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Los autores agradecen al profesor Eero Castren por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito. El trabajo es apoyado por becas de la Academia de Finlandia, Centro para la Movilidad Internacional de Finlandia, y el finlandés Graduate School of Neuroscience (Programa de Doctorado Mente Cerebro y).

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Los autores no tienen nada que revelar.

Para entender mejor la fisiología del cerebro y de la patología, la investigación se debe realizar en una variedad de niveles de complejidad de preparación, la utilización de las técnicas más apropiadas para cada preparación. En la actualidad, una amplia gama de metodologías de neurociencia (de todo el cuerpo fMRI para microscopía STED sub-orgánulo) se aplican fácilmente a los animales anestesiados, mientras que los experimentos en animales despiertos y comportándose han representado un desafío metodológico significativo. Aquí, un nuevo enfoque se describe en el animal de laboratorio, a pesar de estar firmemente fijado cabeza-, se puede mover alrededor de un homecage móviles de aire levantado y explorar su entorno tangible en condiciones sin estrés. La preparación de animales cabeza-fijo comportarse presentado aquí proporciona una serie de ventajas cruciales. En primer lugar, los datos electrofisiológicos o imágenes obtenidas con este método son sin compromisos ni por la anestesia, ni por el estrés inducido por la constricción. Posicionamiento del ratón en la casa móviljaula es rápida y no requiere anestesiar al animal, incluso de forma transitoria. En segundo lugar, la homecage aire levantado asegura la estabilidad mecánica que es necesaria para cuantificar los cambios en la morfología neuronal y fina para grabar una sola célula de la actividad electrofisiológica en animales despiertos. Por último, el diseño de la homecage móvil es más compacto en comparación con la cinta de correr esférica, permitiendo así el posicionamiento de la homecage móvil bajo un microscopio vertical estándar para dos fotones de imágenes o la grabación de patch-clamp en el cerebro de ratón despierto. Fijación de la cabeza firme en el homecage móvil requiere la implantación de un soporte de metal de cuatro alas de diseño especial, con una abertura redonda en el centro de acceso óptico o eléctrico a la región cerebral subyacente. Estos soportes metálicos están unidos al cráneo por medio de una combinación de pegamento, cemento dental y un pequeño perno atornillado en el hueso del cráneo. Este procedimiento quirúrgico se desarrolló sobre la base de un gran número de anterioridadprocedimientos publicados, y se encontró que resultar en una preparación de ventana craneal estable y reproducible. Para experimentos in vivo electrofisiológicos, una ventana en forma de luna 34, un pequeño tamaño de la craneotomía (menos de 0,5 mm) 32, y una preparación de cubiertas de vidrio perforado 35 se han utilizado. Aquí, la ventana craneal &quot;invertida&quot; se implantó con cualquiera de un gran (3,5 mm de diámetro) o pequeña (menos de 0,5 mm de diámetro) craneotomía. Minimizar el movimiento del cerebro es fundamental para las grabaciones de células individuales estables, por lo que es aconsejable realizar la craneotomía de pequeño tamaño para experimentos electrofisiológicos. Tras la implantación de la ventana craneal para los experimentos de imagen óptica, los animales se dejaron recuperar durante al menos 2 o 3 semanas, período durante el cual la ventana pierde el primero transitoriamente su transparencia y a continuación, recupera (con un rendimiento de 50-70%, dependiendo el fondo genético de la cepa de ratón). La transparencia de la ventana craneal y estabilidaddad del cemento &quot;tope&quot; dental ajustado al cráneo puede ser verificada por medio de un microscopio binocular regular y la inspección física durante el manejo animal. Al final del período de recuperación de 2-3 semanas, los animales que exhiben ningún signo de inflamación post-operativa residual o defectos mecánicos en el cemento dental deben ser excluidos de los experimentos y se termina. La edad óptima para el inicio de la formación de los ratones es de 2-4 meses (correspondientes al peso corporal de 20-40 g). En animales jóvenes, el anclaje del cemento &quot;tope&quot; dental en el cráneo puede ser poco fiable, lo que puede disminuir su capacidad de resistencia a la tensión mecánica que se impone por la locomoción del ratón de cabeza fija en el homecage móvil. Aunque los ratones masculinos y femeninos aparecen igualmente dispuestos para navegar en homecage móvil, hay una tendencia para lograr un mejor porcentaje de ventanas craneales recuperar su transparencia en ratones hembra (datos no mostrados). Por lo tanto, con el fin de to asegurar una mezcla equilibrada de los géneros en la cohorte de animales seleccionados para la imagen, la implantación de las ventanas craneales en aproximadamente el 30% de los ratones más masculina se recomienda. Las interacciones sociales son conocidos por mejorar el bienestar de los animales y reducir el estrés, por lo tanto, es aconsejable que las camadas son operadas y entrenados en paralelo y se mantienen juntos en jaulas de alojamiento en grupo. En contraste con los procedimientos publicados para la preparación cinta de correr esférica 13, el método que utiliza la homecage móvil no requiere anestesiar el ratón en el momento de la fijación de la cabeza. Esta diferencia es importante porque permite descartar la existencia de efectos residuales que incluso una breve y &quot;luz&quot; episodio anestesia es probable que tenga sobre las medidas fisiológicas obtenidas poco después. De hecho, a pesar de que en los estudios en los que la fijación de la cabeza se realiza con anestesia y los experimentos reales se iniciaron después de un breve tiempo de espera 13, no se puedeexcluir posibles efectos a largo plazo del breve episodio de anestesia en los datos experimentales. Otros estudios se han basado en la privación de agua durante la habituación sistemática de los animales a la cabeza de la fijación y utilizado recompensa agua como medio de motivar al animal a permanecer inmóvil 36. Sin embargo, el método de fijación de la cabeza basado en recompensas limita la elección de pruebas de comportamiento aplicables y, sobre todo, ocupa una de las asociaciones de estímulo-recompensa bien establecidos. En contraste, el método de la habituación ratón para cabeza de fijación en homecage móvil no requiere privación de agua y la posterior recompensa. Que complementa la homecage móvil con un sistema de distribución de agua se recomienda para los experimentos de larga duración. Las sesiones de entrenamiento de los animales y los experimentos que aquí se presentan se realizaron durante el día (08 a.m.-6 p.m.), que corresponde al período fisiológicamente pasivo para aquellos ratones que se mantienen en el marco del programa de luz de 12 horas estándar (lilos dere a las 6 de la mañana y sale a las 6 horas). Desde la toma de agua está directamente relacionada con la actividad del ratón, durante los pasivos ratones período no requieren el suministro de agua si la duración de una sesión de entrenamiento / imagen / grabación no exceda de 2 horas. Además de la fecha y la duración de las sesiones de entrenamiento, hay que abordar el tema del número óptimo de sesiones necesarias para habituar a los animales a homecage móvil. Para este fin, se usaron dos criterios para evaluar inducida por procedimientos cabeza de fijación estrés: i) la pérdida de peso, y ii) el nivel de actividad locomotora. Como se muestra en la Figura 6, la pérdida de peso alcanza el nivel promedio de 6% en el día de entrenamiento 2, y está completamente revertida por día de entrenamiento de 4 (Figura 6A). En consonancia con la dinámica de pesaje, el nivel de actividad locomotora de los animales en la cabeza-fijo se suprime el primer día de entrenamiento, pero se estabiliza por día de entrenamiento de 4 (Figura 6D). Sobre la base de estas mediciones, que sugerenciast que la duración mínima del período de formación del ratón en homecage móvil es de 4 días, como se describe en el protocolo de la presente. El uso de la, homecage móvil plana con piso aire levantado permite agregar tareas complejas (sensoriomotoras, perceptivas y cognitivas) a los paradigmas de formación para la cabeza de ratones fijo. En el presente estudio se presentan dos protocolos de pruebas de comportamiento. Ambos protocolos utilizan señales del olor y pueden combinarse con longitudinales de formación de imágenes / grabaciones en la corteza del ratón. Aunque el homecage móvil está fabricado a partir de materiales no absorbentes, todavía se tiene que tomar en cuenta las posibles interferencias entre el olor del dispositivo y olor (s) de prueba. Otro factor que puede interferir con las señales visuales / táctiles de un experimento conductual es la unión entre la pared y el inserto, lo que no es perfecto y puede, por tanto, ser percibidos por el animal como un hito. Vale la pena señalar aquí que, a fin de reducir al mínimo la angustia del animal durante tales interventions como la colocación de un algodón olor presentadoras a la pared homecage móvil, el experimentador deben practicar para realizar este tipo de intervenciones tan rápidamente como sea posible y evitar la manipulación prolongada de la jaula de carbono. Estrategias alternativas para novela presentación olor / objeto son concebibles, por ejemplo, la colocación de solución a base de hidrogel gotas o objetos (tales como virutas de alimento) en pequeños estantes unidos a la superficie interior de la pared de la jaula de carbono en la altura compatible con el posicionamiento de la cabeza del animal. Homecage Mobile permite a los animales en la cabeza-fija para llevar a cabo una amplia gama de movimientos de dos dimensiones incluyendo la locomoción horizontal, situp, el aseo, batiendo, lamiendo, nariz-poking, los movimientos de la pata delantera cualificados, y tocar la pared con las extremidades anteriores, como se ilustra en el presente estudio . Usando homecage móvil y los protocolos que aquí se presentan, los investigadores pueden estudiar el sistema neuronal sensoriomotor con un alto nivel de control sobre tanto la condición de estimulacións y los conductuales read-outs. Por otra parte, los estudios de las capacidades cognitivas en ratones despiertos se pueden realizar durante el acondicionamiento, la navegación espacial y tareas de toma de decisiones. Existen varias limitaciones prácticas de este método. En primer lugar, se necesita una cantidad significativa de aire a presión para alcanzar la potencia homecage-elevación y para llevar a cabo experimentos de larga duración. En segundo lugar, la homecage móvil en su presente aplicación es sólo 18 cm de diámetro, y por lo tanto proporciona un espacio relativamente pequeño y sencillo en comparación con la realidad virtual, donde un entorno experimental complejo puede ser diseñado sin ningún tipo de restricciones espaciales. En tercer lugar, durante la estimulación bigote y experimentos basados ​​en recompensa presentados aquí, se utilizó un dispositivo que limita la posibilidad de que la pared de contacto para el ratón. La adición de un canal de estimulación visual o sensorial externo (como un proyector de luz del ojo dirigida) requeriría el diseño de un dispositivo más ergonómico y compacto en comparación conlas soluciones de pantalla múltiple o de cúpula de proyección que se han utilizado en los experimentos de cinta rodante esféricas. En resumen, el uso de los ratones de cabeza-fijo se mueven en la homecage móviles de aire levantado facilita en gran medida los estudios que combinan niveles celulares, moleculares y de comportamiento de observación y manipulación dentro de un solo experimento. Aplicaciones específicas ilustradas aquí son imágenes microscópicas de dos fotones, las imágenes de la señal óptica intrínseca y patch-clamp grabaciones en ratones comportando no anestesiados. Se espera que este enfoque abrirá nuevos horizontes en la experimentación sobre despierto, ratón comportarse y de servir como una herramienta útil tanto para el desarrollo de fármacos e investigación básica de la función cerebral.

Un emocionante tendencia reciente en las Neurociencias es desarrollar enfoques experimentales para la molecular y celular de sondeo de las redes neuronales en el cerebro de despierto, comportándose roedores. Estos enfoques son prometedores para arrojar nueva luz sobre los procesos neurofisiológicos que subyacen a la función motora, la integración sensoriomotora, la percepción, el aprendizaje, la memoria, así como la progresión de la lesión, la neurodegeneración y enfermedades genéticas. Además, la grabación desde el cerebro de los animales despiertos es prometedora en el desarrollo de los agentes y de los tratamientos terapéuticos. Hay una conciencia creciente de que la anestesia, que se ha utilizado comúnmente en experimentos neurofisiológicos, puede afectar a los mecanismos básicos de la función del cerebro, que puede conducir a una interpretación errónea de los resultados experimentales. Por lo tanto, la ketamina anestésica ampliamente utilizada aumenta rápidamente la formación de nuevas espinas dendríticas y mejora la función sináptica 1; otra anesthet comúnmente utilizadoic isoflurano en los niveles de anestesia quirúrgica suprime completamente la actividad cortical espontánea en ratas recién nacidas y bloquea las oscilaciones husillos estallar en animales adultos 2. En la actualidad, sólo un número limitado de enfoques permiten experimentos en ratones no anestesiados por medio de dos fotones de imágenes microscópicas o patch-clamp grabaciones. Estos enfoques se pueden dividir en las preparaciones que se mueve libremente y de la cabeza-fijo. El atractivo única de una preparación de animales que se mueve libremente es que permite la evaluación de comportamiento natural, incluyendo movimientos de todo el cuerpo durante la navegación. Una forma de imagen dentro del cerebro de un roedor libremente en movimiento es para fijar un microscopio montado en la cabeza en miniatura o fibroscopio 3-5. Sin embargo, los dispositivos miniaturizados tienden a tener un rendimiento óptico limitado en comparación con la microscopía de dos fotones basado en objetivos, y no se puede combinar fácilmente con grabaciones de células enteras patch-clamp 6. La exisoluciones de picadura para la cabeza de fijación de un roedor despierto se han basado principalmente ya sea por la restricción física o 7,8 en el entrenamiento del animal para exhibir reposacabezas voluntaria 9. Otro enfoque popular es para permitir que las extremidades del animal se mueva colocándolo en, por ejemplo, una cinta de correr esférica 10; este enfoque se combina a menudo con la realidad virtual generada por ordenador. Los experimentos electrofisiológicos sobre la cabeza de ratones fijo han utilizado sobre todo las grabaciones extracelulares y se utiliza para estudiar la regulación central de la función cardiovascular 11, los efectos de la anestesia en la actividad neuronal 12, la respuesta auditiva en el tronco cerebral y el procesamiento de la información 13 14. Las grabaciones / intracelulares pioneros de células enteras en animales despiertos se realizaron en la década de 2000 y se han centrado en la actividad neural relacionada con la percepción y el movimiento 15-20. Por la misma época, se publicaron los primeros estudios de imágenes microscópicas en ratones despiertoscido, donde se utilizó microscopía de dos fotones en la corteza sensorial de ratas refrenados físicamente 7 y en los ratones que se ejecutan en una cinta de correr esférica 21. Vivo de microscopía y de electrofisiología Estudios posteriores demostraron que en una preparación de fijación de la cabeza se puede combinar con éxito con los paradigmas de comportamiento basados ​​en los movimientos de las extremidades anteriores, el reconocimiento de olores, batiendo, y lamiendo 8,22-25. Los ratones colocados en la cinta esférica pueden ser entrenados para navegar por el entorno visual virtual generado por una computadora 10,26. Grabaciones intracelulares / extracelulares demostraron que, en un animal de cabeza-fijo navegación tales entorno virtual, la activación de células de lugar del hipocampo se puede detectar 27. En un entorno virtual visual, los ratones demuestran normal de ritmo theta relacionada con el movimiento en el potencial de campo local y la precesión theta-fase durante el movimiento activo 27. Recientemente, el activit espacial y temporalpatrones xey de poblaciones neuronales se registraron ópticamente en ratones durante el trabajo tareas de decisión de la memoria en un entorno virtual 28. A pesar de haber permitido la investigación de vanguardia, el diseño de la rueda de ardilla esférica tiene varias limitaciones inherentes. En primer lugar, se requiere que el animal se mueva en una superficie ilimitada de una pelota de aire elevada rotación, lo que plantea obstáculos tangibles, tales como paredes o barreras. Esta limitación es sólo en parte compensada por la &quot;realidad virtual&quot; generada por ordenador, porque la información visual es posiblemente menos eficaz en ratones y ratas, en comparación con la entrada sensorial táctil (por ejemplo, la barba-toque o lamer), que estas especies dependen naturalmente en. En segundo lugar, la considerable curvatura de la superficie de la bola puede ser incómodo para los ratones de laboratorio que se utilizan para caminar sobre un piso plano en sus jaulas. Por último, el gran diámetro de la bola (por lo menos 200 mm para los ratones y de 300 mm para ratas) hace que el tamaño vertical de la esféricadispositivo de cinta relativamente grande. Esto hace que sea difícil de combinar cinta de correr esférica con la mayoría de las configuraciones de microscopía disponibles comercialmente, y a menudo requiere la construcción de una nueva configuración alrededor de la cinta de correr por medio de marcos de microscopio a medida. Aquí, un nuevo método se describe que un ratón de frente fijo puede moverse alrededor de un homecage móviles de aire levantado que cuenta con un suelo plano y paredes tangibles, y explorar el entorno físico en condiciones sin estrés. Este artículo demuestra los procedimientos de formación del ratón y fijación de la cabeza, y proporciona ejemplos representativos donde microscopía de dos fotones, imagenología óptica intrínseca y patch-clamp grabaciones se realizan en el cerebro de los ratones comportando despierto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="733">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:141px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Tweezers&#160; Stainless Steel, 115mm</td>
			<td style="width:161px;">XYtronic</td>
			<td style="width:141px;">XY-2A-SA</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Animal trimmer, shaving machine</td>
			<td style="width:161px;">Aesculap</td>
			<td style="width:141px;">Isis GT420</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Binocular Microscope</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Stemi 2000</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad</td>
			<td style="width:161px;">Supertech</td>
			<td style="width:141px;">TMP-5b</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Blunt microsurgical blade</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:141px;">REF 374769</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Borosilicate tube with filament</td>
			<td style="width:161px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:141px;">BF120-69-10</td>
			<td style="width:173px;">For patch pipette production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Camera&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Foscam</td>
			<td style="width:141px;">FI8903W</td>
			<td style="width:173px;">Night visibility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Carprofen</td>
			<td style="width:161px;">Pfizer</td>
			<td style="width:141px;">Rimadyl vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dental cement</td>
			<td style="width:161px;">DrguDent, Dentsply</td>
			<td style="width:141px;">REF 640 200 271</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:161px;">FaunaPharma</td>
			<td style="width:141px;">Rapidexon vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Disposable drills</td>
			<td style="width:161px;">Meisinger</td>
			<td style="width:141px;">HP 310104001001008</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dulbeco&#8217;s PBS 10X</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:141px;">D1408</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dumont #5 forceps, 110 mm</td>
			<td style="width:161px;">FST</td>
			<td style="width:141px;">91150-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:259px;">Eyes-lubricant</td>
			<td style="width:161px;">Novartis</td>
			<td style="width:141px;">Viscotears</td>
			<td style="width:173px;">For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Foredom drill control</td>
			<td style="width:161px;">Foredom&#160;</td>
			<td style="width:141px;">FM3545</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Foredom micro motor handpiece</td>
			<td style="width:161px;">Foredom</td>
			<td style="width:141px;">MH-145</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Four-winged metal holder</td>
			<td style="width:161px;">Neurotar</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Head Holder for Mice</td>
			<td style="width:161px;">Narishige</td>
			<td style="width:141px;">SG-4N</td>
			<td style="width:173px;">Assembled on stereotaxic instrument</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Hemostasis Collagen Sponge</td>
			<td style="width:161px;">Avitene, Ultrafoam BARD</td>
			<td style="width:141px;">Ref 1050050</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Imaris</td>
			<td style="width:161px;">Bitplane</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Ketamine</td>
			<td style="width:161px;">Intervet</td>
			<td style="width:141px;">Ketaminol vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Kwik-Sil&#160;</td>
			<td style="width:161px;">WPI</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Mai Tai DeepSee laser</td>
			<td style="width:161px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Micro dressing forceps, 105 mm</td>
			<td style="width:161px;">Aesculap</td>
			<td style="width:141px;">BD302R</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Microelectrode puller</td>
			<td style="width:161px;">Narishige</td>
			<td style="width:141px;">PC-10H</td>
			<td style="width:173px;">Vertical puller for glass pipette production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:161px;">Sensapex</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Mini bolt</td>
			<td style="width:161px;">Centrostyle</td>
			<td style="width:141px;">Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Mobile Homecage</td>
			<td style="width:161px;">Neurotar</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:259px;">Multiphoton Laser Scanning Microscope</td>
			<td style="width:161px;">Olympus</td>
			<td style="width:141px;">FV1000MPE</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:259px;">Nonwoven swabs 5&#215;5</td>
			<td style="width:161px;">Molnlycke Health Care</td>
			<td style="width:141px;">Mesoft</td>
			<td style="width:173px;">Surgical tampons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Polyacrylic glue</td>
			<td style="width:161px;">Henkel</td>
			<td style="width:141px;">Loctite 401</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:259px;">Round glass coverslip&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:141px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1.5 thickness&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Small animal stereotaxic instrument</td>
			<td style="width:161px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:141px;">900</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Student iris scissors, straight 11.5 cm</td>
			<td style="width:161px;">FST</td>
			<td style="width:141px;">91460-11</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Xylazine</td>
			<td style="width:161px;">Bayer Health Care</td>
			<td style="width:141px;">Rompun vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents

Es ampliamente reconocido que el uso de la anestesia general puede socavar la relevancia de los datos electrofisiológicos o microscópicas obtenidas del cerebro de un animal vivo. Por otra parte, la larga recuperación de la anestesia limita la frecuencia de los episodios de grabación / de formación de imágenes repetidas en estudios longitudinales. Por lo tanto, se espera que los nuevos métodos que permitan grabaciones estables de ratones comportando no anestesiados para avanzar en el campo de la neurociencia celular y cognitivas. Las soluciones existentes van desde la mera restricción física a los enfoques más sofisticados, tales como cintas de correr lineales y esféricos utilizados en combinación con la realidad virtual generada por ordenador. Aquí, un nuevo método se describe que un ratón de frente fijo puede moverse alrededor de un homecage móviles de aire levantada y explorar su medio ambiente en condiciones sin estrés. Este método permite a los investigadores para llevar a cabo las pruebas de comportamiento (por ejemplo, de aprendizaje, de habituación o una novela de reconocimiento de objetos) al mismo tiempo quede dos fotones de imágenes microscópicas y / o grabaciones de patch-clamp, todo combinado en un solo experimento. Esta-artículo de vídeo describe el uso del dispositivo de fijación cabeza de animal despierto (homecage móvil), demuestra los procedimientos de habituación de los animales, y ejemplifica un número de posibles aplicaciones del método.

El método que aquí se presenta está diseñado para imágenes microscópicas unicelulares o registros electrofisiológicos en, cabeza de ratones fijo pero por lo demás se mueven libremente y comportarse despierto. El animal puede moverse en dos dimensiones en un real (en oposición a virtual), el medio ambiente tangible y familiar, mientras que el cráneo de los animales se fija firmemente al brazo de fijación cabeza. Habituar a los ratones a la homecage móviles de aire levantada consta de 4-6 días de las sesiones de entrenamiento de 2 horas dos veces al día (Figura 1). Los animales entrenados a continuación, pueden ser utilizados en los experimentos de inmediato. Un estudio típico incluye una serie de sesiones de formación de imágenes o grabaciones de patch-clamp que están espaciados a intervalos que van desde unas horas hasta varios días o semanas. Es importante destacar que, ambas grabaciones ópticas y electrofisiológicas se pueden realizar simultáneamente con estímulos y lecturas cognitivos o de comportamiento, dentro de un solo experimento. Para evaluar la estabilidad mecánica defijación de la cabeza del ratón en la homecage móvil, se recogieron las secuencias de imágenes de los vasos corticales marcados con dextrano fluorescente conjugado y de dendritas corticales que expresan YFP mientras que los animales de experimentación navegaban el homecage móvil (Figura 2). Los desplazamientos máximos del cerebro durante la locomoción de los animales no suelen superar los 1-1,5 micras. Estos desplazamientos se produjeron en las direcciones horizontal y muy rara vez dieron como resultado un cambio detectable de la plano de la imagen, lo que hace innecesaria cualquier corrección de artefactos de movimiento. Fijación de la cabeza estable en homecage móvil permite la cuantificación de las espinas dendríticas individuales en animales despiertos con la misma fiabilidad que en ratones anestesiados. Densidad de la espina dendrítica, la morfología y la rotación pueden ser monitoreados durante los estudios longitudinales con múltiples sesiones de imagen realizadas a intervalos que van desde unas pocas horas hasta varios días o semanas. La facilidad de uso de la mobile homecage de imagen óptica funcional fue probada en la corteza somatosensorial de los ratones despiertos utilizando dos enfoques: i) microscopía de dos fotones en los ratones transgénicos Thy1-GCaMP3 y ii) de imagen de la señal óptica intrínseca en ratones de tipo salvaje. Ca 2 + de imágenes se realizó en la capa 2/3, que contiene los cuerpos celulares de muchas neuronas marcadas con fluorescencia, así como sus dendritas y axones (Figura 3). Las parcelas de tiempo-fluorescencia a lo largo de las regiones seleccionadas de interés (ROI) se muestran en la Figura 3, lo que demuestra la actividad neuronal espontánea (medida como aumento transitorio en la fluorescencia GCaMP3) durante la navegación activa del ratón en la homecage móvil. De formación de imágenes óptico basado en señales intrínsecas permite el mapeo de la distribución espacial de los dominios funcionales. Figura 4 ilustra cambios en la onda como en el nivel de oxigenación de la sangre (que reflejan la activación neuronal regional) que propagan a lo largo de la corteza somatosensorial en respuesta a Vibrissa estimulación a la frecuencia de 0,05 Hz. Para poner a prueba la viabilidad de patch-clamp grabaciones con homecage móvil, hemos utilizado ratones C57Bl/6J 2-3 meses de edad. Layer 2/3 neuronas en la corteza somatosensorial se registraron a partir de la configuración de célula completa utilizando el modo de pinza de corriente. Grabación de Patch-clamp en el cerebro de los ratones despiertos cabeza fija en homecage móvil era esencialmente similar a cegar patch-sujeción en rodajas de cerebro. Aproximadamente el 50% de los intentos resultó en la formación de gigaseal éxito, de los cuales más de 70% produjo la grabación de la configuración de células enteras estable. No se observaron eventos de perder el contacto gigaseal debido al desplazamiento mecánico de las células. Figura 5 muestra un fragmento de 60 segundos de un tiempo de grabación actual-clamp 10-min representante correspondieron a episodios de del ratón activa (en ejecución) y pasivas (descanso) estados. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in"src = &quot;/ files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figura 1. El método de fijación de la cabeza de los ratones despiertos en el homecage móvil. A) Descripción general del diseño homecage móviles de aire levantado y las ilustraciones del concepto general. B) Diagrama de una línea de tiempo típica experimental. El estudio se inicia con la implantación de la ventana craneal dos semanas antes de habituar el ratón a la manipulación y embalaje, que es seguido por ocho sesiones de entrenamiento dos veces al día. El estudio típico incluye una serie de sesiones de formación de imágenes o grabaciones de patch clamp que están espaciados a intervalos que van desde unas horas hasta varios días o semanas. Ambas mediciones ópticas y electrofisiológicas se puede hacer en paralelo con los estímulos y lecturas cognitivas o de comportamiento dentro de un solo experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 2. Ejemplo de dos fotones de imágenes microscópicas en ratones despiertos moviéndose alrededor del homecage móvil. A, B) vasculatura cortical, etiquetado con el dextrano conjugado con Rojo de Texas 70 kDa. El diámetro de los segmentos de buques individuales se mide mediante el trazado con el tiempo el perfil de las líneas dibujadas a través de la luz del vaso durante períodos de reposo y en funcionamiento de ratón (A). La velocidad del flujo sanguíneo en las arterias y venas se mide por la línea de exploración a lo largo de las líneas dibujadas en paralelo a la pared del vaso (B). C, d) Los detalles finos de la morfología neuronal visualizado en el cerebro de ratones transgénicos que expresan YFP en subpoblación de neuronas bajo el promotor Thy1. Reconstrucción tridimensional de las neuronas piramidales de la corteza somatosensorial del ratón (C). Las imágenes de un b dendríticasrancho adquirida en una, ratón comportarse despierto son suficientemente estables para la cuantificación de la morfología de la espina dendrítica individuo (D). E) Cuantificación de movimiento cerebral causado por los movimientos del ratón. Grandes desplazamientos de amplitud se correlacionan con períodos de funcionamiento del ratón. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Ejemplo de actividad de la población neuronal en despiertos ratón Thy1-GCaMP3 moverse por la homecage móvil. A) Imagen de dos fotones de la capa cortical neuronas II / III. ROI, por ejemplo se muestran los cuerpos celulares neuronales, dendritas y axones en amarillo. B) Df / F rastros de la fluorescencia GCaMP3 de ROIs mostradas en A (tiempo de serie grabado en 1.5 segundos / cuadros). C) zoom en la zona visualizada a 65 ms / frame. D) Fluorescencia de ROIs amarillas en C trazada a través del tiempo, se muestran los aumentos transitorios (rojos) en la fluorescencia GCaMP3 que corresponden a la acción Ca 2 + inducida por episodios potenciales de afluencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Ejemplo de mapeo de la distribución espacial de las respuestas funcionales en la corteza de un ratón despierto por medio de imágenes de las señales ópticas intrínsecas. A) vista de campo brillante de los vasos sanguíneos superficiales a través de la ventana craneal. B) Mapa de la magnitud de la actividad de línea de base en Ho móvilmecage durante un episodio de 6 min. C) Mapa de la magnitud de la actividad neuronal se propaga a lo largo de la corteza somatosensorial en respuesta a la estimulación vibrisas a una frecuencia de 0,05 Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" width="600" /> Figura 5. Ejemplo de grabación de patch-clamp de células enteras en la corteza de un ratón despierto en movimiento alrededor de la homecage móvil. A) la grabación actual-clamp de una neurona en la capa cortical del ratón 2/3. A 0,5 segundos, 100 pA inyección de corriente (se indica a continuación la traza) da lugar a una explosión de los potenciales de acción. La célula mostró característico adaptación de frecuencia pico para las neuronas piramidales. B) de grabación actual-clamp Continuode la misma neurona correlacionado con la actividad del ratón &#39;locomotor (en rosado encima de la traza). Actividad espontánea Representante de la capa 2/3 de las neuronas en los períodos de la del ratón en reposo (C) y en funcionamiento (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="La figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" width="600" /> Figura 6. Pérdida de peso de los animales y la actividad locomotora de los ratones head-fixed/non-fixed durante las sesiones de entrenamiento en el homecage móvil. A) El peso del animal (media + SD,%), antes de las sesiones de entrenamiento. Tenga en cuenta que la pérdida de peso está totalmente revertido por la 7-8 ª sesión de entrenamiento. B) Trayectoria del ratón locomoción horizontal con respecto al homecage móvil,que fue extrapolada a partir del movimiento de seguimiento del homecage móvil durante la 8 ª sesión de entrenamiento. c) los movimientos de oruga de un ratón fijo-no la cabeza explorar la jaula redonda durante la 8 ª sesión de entrenamiento. D) Duración de la cabeza fija (círculo) y no fijos (triángulo) movimiento ratones durante 1-4 días del entrenamiento (media + SD,%). Tenga en cuenta que, en el día 4, la cabeza de ratones fija muestran ni de congelación (como en el día 1), ni la actividad locomotora excesivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Este método crea un entorno tangible, familiar para el ratón para navegar y explorar durante microscópicas de imágenes o una sola célula de registros electrofisiológicos, los cuales requieren una fijación firme de la cabeza del animal.

Plataforma levantado-Air-plana con piso: un nuevo método para combinar Comportamiento con Microscopía o Electrofisiología en Awake moviéndose libremente Roedores

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

Research

JoVE Journal

Behavior

A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

Un método para Remotamente silenciamiento actividad neural en roedores Durante fases discretas de aprendizaje

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and ...

Investigación

Comportamiento

A Method for Evaluating the Reinforcing Properties of Ethanol in Rats without Water Deprivation, Saccharin Fading or Extended Access Training

Un método para evaluar las propiedades reforzantes de etanol en ratas sin privación de agua, la sacarina o el desvanecimiento de Formación Extended Access

Operant oral self-administration methods are commonly used to study the reinforcing properties of ethanol in animals. However, the standard methods ...

Feeding Experimentation Device (FED): Construction and Validation of an Open-source Device for Measuring Food Intake in Rodents

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La alimentación de dispositivos Experimentación (FED): construcción y validación de un dispositivo de fuente abierta para la medición de la ingesta de alimentos en roedores

Food intake measurements are essential for many research studies. Here, we provide a detailed description of a novel solution for measuring food intake in ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Ca Cortical Multi-capa<sup&gt; 2+</sup&gt; Imágenes en ratones con movimientos libres con sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada

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A New Method for Inducing a Depression-Like Behavior in Rats

Un nuevo método para la inducción de un depresión-como comportamiento en ratas

Contagious depression is a phenomenon that is yet to be fully recognized and this stems from insufficient material on the subject. At the moment, there is ...

Noninvasive, High-throughput Determination of Sleep Duration in Rodents

Determinación no invasiva, de alto rendimiento de la duración del sueño en roedores

Traditionally, sleep is monitored by an electroencephalogram (EEG). EEG studies in rodents require surgical implantation of the electrodes followed by a ...

An Automated T-maze Based Apparatus and Protocol for Analyzing Delay- and Effort-based Decision Making in  Free Moving Rodents

Un T-laberinto automatizado basado en aparato y protocolo para el análisis de decisiones basado en el retraso y el esfuerzo en roedores en movimiento gratis

Many neurological and psychiatric patients demonstrate difficulties and/or deficits in decision making. Rodent models are helpful to produce a deeper ...

The Unpredictable Chronic Mild Stress Protocol for Inducing Anhedonia in Mice

El protocolo de estrés leve crónico impredecible para inducir la Anhedonia en ratones

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Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials and Electrocorticograms in Response to Nociceptive Laser Stimuli from Freely Moving Rats

Grabaciones simultáneas de los potenciales de campo Local Cortical y Electrocorticograms en respuesta a estímulos nociceptivos Laser se mueva libremente las ratas

Electrocortical responses, elicited by laser heat pulses that selectively activate nociceptive free nerve endings, are widely used in many animal and ...

Brain Infarct Segmentation and Registration on MRI or CT for Lesion-symptom Mapping

Segmentación y registro de infarto cerebralentes en RMN o TC para mapeo de síntomas de lesiones

In lesion-symptom mapping (LSM), brain function is inferred by relating the location of acquired brain lesions to behavioral or cognitive symptoms in a ...