Name: rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons
Uploaded: 2015-01-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons at JoVE.com

The authors thank researchers at the University of Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins and Beverly Davidson for instructions and helpful comments regarding striatal cultures, and Drs. Kara Gordon, Nicole Bode and Pedro Gonzalez-Alegre for genotyping assistance and discussions. We also thank Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) for helpful comments regarding tattooing, and Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) for helpful comments regarding the mouse culture. This work was supported by grants from the American Heart Association, the Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), the Dystonia Medical Research Foundation, the Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, the National Science Foundation, and the Whitehall Foundation (N.C.H.).

MERK: Alle dyr prosedyrer utført i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Iowa. 1. Langsiktig Identifikasjon av Mus Bruke Tatovering poten Pads <ol><li> Immobilisere en pote med labben pad (plantar overflate) vendt eksperimentator. Hold poten med tommelen og pekefingeren. Vær forsiktig så du ikke klemme labben. MERK: Stabil immobilisering er viktig for å sikre at tatoveringen pigment er plassert inn i dermis av poten pad, og der...

Protokollen som presenteres her inkluderer prosedyrer for tatovering å merke / identifisere mus, for genotyping mus fra halen tips, og for dyrking mus hjernens nerveceller ved lav tetthet. I en runde av forsøk under anvendelse av 6-8 unger disse fremgangsmåter krever typisk ~ 0,5 timer, 4 timer og ~ ~ 2 timer, henholdsvis, ved en total på 6-7 timer. Dette gjør det praktisk for en enkelt experimenter å fullføre alle de prosedyrer som er nødvendige fra tidspunktet for valpene &#39;fødsel til plating av nevronale ...

Gnagermodeller av genetiske sykdommer har vist seg nyttig i å etablere de fysiologiske funksjonene til normale proteiner og nukleinsyrer, så vel som de patofysiologiske konsekvenser av defekter i disse. Eksempler inkluderer mus som mangler for proteiner som er involvert i viktige cellefunksjoner i tillegg til musemodeller av lidelser så som Alzheimers sykdom. Imidlertid kan visse genetiske manipulasjoner føre til neonatal dødelighet kort tid eller et par dager etter fødselen. I disse tilfellene, primære cellekulturer er et viktig verktøy fordi levende celler kan fås fra de embryonale eller neonatale unger før døden, de kan opprettholdes i minst et par uker in vitro, og i løpet av denne tiden tidlig neuronal utvikling kan følges av biokjemiske, funksjonelle og morfologiske eksperimenter. For de primære kulturer, kan det være gunstig å plate nervecellene ved lav tetthet; Dette gjør det mulig å visualisere den enkelte somata, dendritter, aksonal aksler og nerveklemlene på høy romlig oppløsning. Imidlertid overlevelse og differensiering av nerveceller med lav tetthet krever typisk at de er belagt på en glial mateslag, ko-dyrket med gliaceller i fravær av fysisk kontakt med dem, og dyrket i medium kondisjonert ved en gliaceller. Etableringen av lav tetthet nevronale kulturer på glial næringslag kan være avhengig av en rask og pålitelig genotyping forhånd - i løpet av få timer, i motsetning til noen få dager. Hastighet er spesielt viktig når det nevronale genotype må matches til det av en glial mater lag forberedt på forhånd. Som en mer praktisk eksempel, kan det være nødvendig å bestemme hvilke unger som genotype til bruk ved generering av kulturer, for å optimalisere effektiviteten av et eksperiment. Her demonstrerer vi arbeidsprotokollen som har vært brukt for rask, forenklet og pålitelig mus genotyping i tidligere publikasjoner 2-6. Musehaler oget kommersielt tilgjengelig kit benyttes. Denne protokollen innbefatter ett-trinns ekstrahering av nukleinsyrer fra vevet, og krever heller ikke en nukleinsyre-syre rensetrinn eller anvendelse av en termineringsbuffer (&quot;stopp-løsning&quot;). Påliteligheten av denne genotyping fremgangsmåte er illustrert ved å presentere resultatene av en serie tester ved forskjeller blir innført med hensyn til utgangsmengden av prøvene, i en alder av dyrene og lengden av PCR-amplikoner. Dette settet tilbyr fordelene ved automatisert utvinning og pålitelighet. For å få til å være omfattende, er bruken av tatovering for langsiktig identifikasjon av genotypede mus også demonstrert. Tatovering oppnås ved å påføre tatovering blekk til dermis av huden (under epidermis) 7. En fremgangsmåte er beskrevet for tatovering poten pads av nyfødte eller en dag gamle mus, selv om tatovering kan anvendes på andre deler av kroppen, slik som haler og tær, og å Animals i alle aldre. I tillegg vil fremgangsmåten bli demonstrert for plating og dyrking mus neuroner ved en lav densitet, basert på optimal fremstilling av forskjellige typer av glial næringslag 2,8. Vi bruker en genetisk musemodell for den arvet nevrologisk lidelse DYT1 dystoni - en autosomal-dominant bevegelse lidelse forårsaket av en mutasjon i genet TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. Den kodede protein, Torsina, tilhører de &quot;ATPaser forbundet med ulike cellulære aktiviteter&quot; (AAA +) familie av proteiner, hvis medlemmer generelt utføre anstand-lignende funksjoner, bistå i: protein utfolder seg, protein-kompleks demontering, membran menneskehandel, og vesikkelfusjon 10-13. Mutasjonen resulterer i en i-ramme sletting av et kodon for glutaminsyre, og kan føre til manifestasjon av &quot;early-onset generalisert isolert dystoni &#39;14,15. Imidlertid banenophysiological mekanismene som er ansvarlig for denne lidelsen er fortsatt dårlig forstått. I en knock-in mus modell, er mutant allel Tor1a tm2Wtd, nevnt heretter som Tor1a AE. Heterozygot AE-Torsina knock-in mus er levedyktige og genetisk ligne menneskelige pasienter med DYT1 dystoni, mens homozygot knock-in mus dør etter fødselen 16,17, med ventetid til postnatal død påvirket av genetisk bakgrunn 18. Tidlige død homozygot knock-in mus krever at både genotyping av dyr og etablering av nevrale kulturer er gjennomført raskt. Som et annet eksempel på genotyping, Tfap2a (transkripsjonsfaktor AP-2α, aktive enhancer bindende protein 2α) vil bli brukt. Proteinet kodet for av dette genet er viktige i regulering av flere cellulære prosesser, for eksempel proliferasjon, differensiering, overlevelse og apoptose 19.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS - tattooing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machine Cleanser</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NMCR3</td>
			<td>This is used to clean the needles and the holder after tattooing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machine Drying Agent</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NDAR4</td>
			<td>This is used to dry the needles and holder after cleaning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonate Tattoo Black Pigment</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NBP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin Prep Applicator</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NSPA1</td>
			<td>Q-tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin Prep solution</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NSP01</td>
			<td>This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage &#8211; the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing &#8211; softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS - genotyping</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X PCR Ready Mix II</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td>A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lysis Solution A</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td>Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 &#181;l of Tissue Lysis Solution A and 180 &#181;l of Tissue Lysis Solution B per specimen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lysis Solution B</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td>Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 &#181;l of Tissue Lysis Solution A and 180 &#181;l of Tissue Lysis Solution B per specimen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH 3092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose optimized grade, molecular biology grade</td>
			<td>rpi</td>
			<td>A20090-500&#160;</td>
			<td>We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 &#181;g/ml gel volume).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 &#181;l</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>UG104-96RS&#160;</td>
			<td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 &#181;l</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>UG2020-RS</td>
			<td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 &#181;l</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>UG2812-RS</td>
			<td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>L1001</td>
			<td>We use either of these three molecular weight markers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>10488-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml&#160;</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes, Ultraflux Individual&#160;</td>
			<td>rpi</td>
			<td>145660</td>
			<td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>rpi</td>
			<td>T60040-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for amplifying Tor1a gene in &#916;E-torsinA knock-in mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3&#39; (forward) and 5&#39;-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3&#39; (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/&#181;l (~0.16 &#181;M) (reference 2).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3&#39; (forward), 5&#39;-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3&#39; (reverse) for the 498-bp amplicon, 5&#39;-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3&#39; (forward), 5&#39;-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3&#39; (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5&#39;-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3&#39; (forward), 5&#39;-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3&#39; (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS - cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>See comments section of uridine for more information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, polypropylene, 15 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess (cell number counter) chamber slides</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>C10312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6645-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dish, Petri glass 100 x 15 mm</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>15230-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527-200KU</td>
			<td>Stock solution is prepared at 1500 units/20 &#956;l = 75000 units/ml in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>10569-010, 500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 &#181;m Pore Size</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>568-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 &#181;m Pore Size</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09&#8211;0.12 mm, No. 0</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>633017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2387-10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, &#8805;99.5% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-100 ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500-250 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4&#8226;(7H2O), BioUltra, &#8805;99.5% (Fluka)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63138-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356237</td>
			<td>This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20&#176;C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4&#176;C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>51200-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MITO+ Serum Extender, 5 ml</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>355006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium (1X), liquid</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>bdh 3044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NS (Neuronal Supplement) 21&#160;</td>
			<td>prepared in the lab</td>
			<td></td>
			<td>Source: reference 69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets, 5 &#190;&#8221;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>Use this cotton-plugged 5 &#190;&#8221; Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets, 9&#8221;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, &#8805;99.0%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 2 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 5 ml&#160;</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 10 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 25 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 50 ml&#160;</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480878-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4&#8226;(7H2O)), &#8805;99.99%, Aldrich</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431478-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, SigmaUltra, &#8805;99.5% (GC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, sterile, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin, Holo, bovine plasma</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain, 0.4%</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, type XI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1005-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution, 0.25%&#160;</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine and 125-mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS - immunocytochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons

Høy oppløsning analyse av morfologi og funksjon av nerveceller fra pattedyr krever ofte genotyping av individuelle dyr, fulgt av analyse av primære kulturer av neuroner. Vi beskriver et sett av prosedyrer for: merking nyfødte mus for å bli genotypet, rask genotyping, og etablering av lav tetthet kulturer av hjernens nerveceller fra disse musene. Individuelle mus er merket med tatovering, som gir mulighet for langsiktig identifikasjon varig inn i voksenlivet. Genotyping av den beskrevne protokoll er rask og effektiv og gir mulighet for automatisert uttrekking av nukleinsyre med god pålitelighet. Dette er nyttig under omstendigheter der tilstrekkelig tid for konvensjonell genotyping ikke er tilgjengelig, for eksempel, i mus som lider av neonatal dødelighet. Primære nevronale kulturer blir generert ved lav tetthet, noe som gjør det mulig for bildebehandling eksperimenter med høy romlig oppløsning. Denne kulturen metoden krever utarbeidelse av gliaceller næringslag før nevronale plating. Protocol tilføres i sin helhet til en musemodell av bevegelsesforstyrrelse DYT1 dystoni (AE-Torsina knock-in-mus), og nevronale kulturer fremstilt fra hippocampus, cerebral cortex og striatum fra disse musene. Denne protokollen kan anvendes på mus med andre genetiske mutasjoner, så vel som til dyr av andre arter. Videre kan de enkelte komponenter av den protokoll benyttes for isolerte underprosjekter. Derfor er denne protokollen vil ha brede programmer, ikke bare i nevrovitenskap, men også i andre felt av biologiske og medisinske fag.

Som et eksempel på anvendelse av denne protokollen, er representative resultatene vist for merking mus ved tatovering, pålitelig genotyping under ulike eksperimentelle forhold, og etablere primære nevrale kulturer på gliale næringslag. Tatovering Nyfødte valper ble merket på tredeputene med en tatovering system (&#39;Newborn &quot;i figur 1). Etikettene forble klart synlig 3 uker (&#39;3-ukers-gamle &quot;) og 32 ukers ald...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons at JoVE.com

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

Rapid Genotyping av Dyr Fulgt av Etablering Primære Kulturer av hjernens nerveceller

Vi beskriver prosedyrer for merking og genotyping nyfødte mus og generere primære nevronkulturer fra dem. Den genotyping er rask, effektiv og pålitelig, og gir mulighet for automatisert nukleinsyre-syre utvinning. Dette er spesielt nyttig for neonatally dødelige mus og deres kulturer som krever forutgående gjennomføring av genotyping.

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Påvisning av Protein palmitoylation i Cultured hippocampus neurons ved Immunoutfellingsanalyse og Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Kalsium Fosfat Transfection of Primary hippocampus nevroner

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primær Culture of Mouse dopaminerge nevroner

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolasjon, Kultur og langsiktig vedlikehold av Primary mesencefalisk dopaminerge nevroner Fra Embryonic Gnagere Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Live bildebehandling etterfulgt av én celle til skjermen Cell Biology og avstamning progresjon av flere nevrale bestander

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Rask og spesifikk Immunomagnetic isolasjon av musen primære Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Primær kultur neurons isolert fra embryonale mus lillehjernen

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Multi-fiber fotometri å Record neural aktivitet i fritt bevegelige dyr

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...