Name: rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons
Uploaded: 2015-01-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons at JoVE.com

The authors thank researchers at the University of Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins and Beverly Davidson for instructions and helpful comments regarding striatal cultures, and Drs. Kara Gordon, Nicole Bode and Pedro Gonzalez-Alegre for genotyping assistance and discussions. We also thank Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) for helpful comments regarding tattooing, and Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) for helpful comments regarding the mouse culture. This work was supported by grants from the American Heart Association, the Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), the Dystonia Medical Research Foundation, the Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, the National Science Foundation, and the Whitehall Foundation (N.C.H.).

NOTA: Todos os procedimentos com animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso da Universidade de Iowa animal Institucional. 1. Identificação de longo prazo de ratos usando Tatuar as almofadas das patas <ol><li> Imobilizar a pata com (superfície plantar) a almofada da pata de frente para o experimentador. Segurar a pata com o polegar e o dedo indicador. Tenha cuidado para não apertar a pata. NOTA: a imobilização estável é importante para gara...

O protocolo aqui apresentado inclui os procedimentos para a tatuagem para marcar / identificar ratos, camundongos para a genotipagem de pontas da cauda, ​​e para a cultura de neurônios do cérebro do rato em baixa densidade. Em uma rodada de experimentos usando 6-8 filhotes, estes procedimentos normalmente requerem ~ 0,5 hr, ~ 4 horas e ~ 2 horas, respectivamente, em um total de 6-7 horas. Isto torna mais prático para um único experimentador para completar todos os procedimentos necessários a partir do momento d...

Modelos de roedores de doenças genéticas provaram útil para estabelecer as funções fisiológicas normais de proteínas e ácidos nucleicos, bem como as consequências de fisiopatológicos defeitos nestes. Exemplos incluem ratos deficientes para proteínas envolvidas em funções celulares essenciais, bem como modelos de rato de desordens tais como doença de Alzheimer. No entanto, certas manipulações genéticas podem levar a letalidade neonatal pouco ou alguns dias após o nascimento. Nestes casos, as culturas de células primárias são um instrumento importante porque as células vivas podem ser obtidos a partir dos filhotes embrionários ou neonatais antes da morte, que podem ser mantidos durante pelo menos algumas semanas in vitro, e durante este tempo o desenvolvimento neuronal precoce pode ser seguido pela experiências bioquímicas, funcionais e morfológicas. Para as culturas primárias, ela pode ser benéfica para os neurónios em placa de baixa densidade; isso faz com que seja possível visualizar a somata indivíduo, dendrites, eixos axonal e termi nervonais em alta resolução espacial. No entanto, a sobrevivência e diferenciação de neurónios a baixa densidade, tipicamente requer que eles são plaqueadas numa camada alimentadora de células gliais, a co-cultura com células gliais, na ausência de contacto físico com eles, ou cultivadas em meio condicionado por células gliais 1. O estabelecimento de culturas neuronais de baixa densidade em camadas alimentadoras gliais pode ser dependente de genotipagem rápida e fiável de antemão - dentro de algumas horas, em contraste com alguns dias. A velocidade é especialmente importante quando o genótipo neuronal precisa de ser compensada com o de uma camada alimentadora glial preparado de antemão. Como um exemplo mais prático, pode ser necessário decidir qual das crias que genótipo de usar na geração de culturas, para optimizar a eficiência de uma experiência. Aqui demonstramos o protocolo de trabalho que tenha sido utilizado para rápido, simplificado e fiável genotipagem rato em publicações anteriores 2-6. Rabos de rato eum kit disponível comercialmente são usados. Este protocolo inclui a extracção de passo único de ácidos nucleicos a partir do tecido, e não exige nem um passo de purificação de ácido nucleico que nem o uso de um tampão de terminação (&#39;solução parar&#39;). A fiabilidade deste método de genotipagem é ilustrada, apresentando os resultados de uma série de testes em que são introduzidas diferenças no que diz respeito à quantidade de partida das amostras, a idade dos animais e do comprimento dos produtos de amplificação de PCR. Este kit oferece as vantagens de extracção e fiabilidade automatizado. Por causa de ser abrangente, a utilização de tatuagem para identificação de longo prazo dos ratinhos cujo genótipo é também demonstrada. A tatuagem é conseguido pela aplicação de tinta para tatuagem a derme da pele (epiderme sob as) 7. Um procedimento é descrito para tatuar as almofadas das patas de ratos recém-nascidos ou 1 dias de idade, embora tatuagens pode ser aplicado a outras partes do corpo, tais como as caudas e os dedos do pé, e a Animals de todas as idades. Além disso, os procedimentos será demonstrada para o plaqueamento e a cultura de neurónios de rato, a uma densidade baixa, com base na preparação optimizado de diferentes tipos de camadas alimentadoras gliais 2,8. Nós usamos um modelo genético do rato da desordem neurológica DYT1 distonia herdada - uma desordem de movimento autossômica dominante, causada por uma mutação no gene TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. A proteína codificada, torsinA, pertence aos &quot;ATPases associadas a diversas atividades celulares&quot; (AAA +) família de proteínas, cujos membros geralmente desempenham funções semelhantes a chaperonas, auxiliando em: proteínas que se desdobram, desmontagem proteína do complexo, o tráfico de membrana e fusão das vesículas 10-13. Os resultados de mutação em uma deleção em enquadramento de um codão para ácido glutâmico, e pode conduzir a manifestação de &quot;início precoce generalizada isolado distonia &#39;14,15. No entanto, o caminhomecanismos ophysiological responsáveis ​​por esta desordem permanecem pouco compreendidos. Em um modelo de rato knock-in, o alelo mutante é Tor1a tm2Wtd, mencionados a seguir como Tor1a AE. Heterozygous AE-torsinA knock-nos ratos são pacientes humanos viáveis ​​e geneticamente mímica com DYT1 distonia, enquanto homozigoto knock-in ratos morrerem após o nascimento 16,17, com a latência para a morte pós-natal afetados por fundo genético 18. A morte prematura de homozigose camundongos knock-in exige que tanto a genotipagem dos animais eo estabelecimento de culturas neuronais são concluídas rapidamente. Como outro exemplo de genotipagem, Tfap2a (fator de transcrição AP-2α, ativando obrigatório 2α proteína potenciador) será usado. A proteína codificada por este gene é importante na regulação de vários processos celulares, tais como a proliferação, a diferenciação, a sobrevivência e a apoptose 19.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS - tattooing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machine Cleanser</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NMCR3</td>
			<td>This is used to clean the needles and the holder after tattooing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machine Drying Agent</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NDAR4</td>
			<td>This is used to dry the needles and holder after cleaning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonate Tattoo Black Pigment</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NBP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin Prep Applicator</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NSPA1</td>
			<td>Q-tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin Prep solution</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NSP01</td>
			<td>This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage &#8211; the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing &#8211; softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS - genotyping</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X PCR Ready Mix II</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td>A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lysis Solution A</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td>Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 &#181;l of Tissue Lysis Solution A and 180 &#181;l of Tissue Lysis Solution B per specimen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lysis Solution B</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td>Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 &#181;l of Tissue Lysis Solution A and 180 &#181;l of Tissue Lysis Solution B per specimen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH 3092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose optimized grade, molecular biology grade</td>
			<td>rpi</td>
			<td>A20090-500&#160;</td>
			<td>We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 &#181;g/ml gel volume).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 &#181;l</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>UG104-96RS&#160;</td>
			<td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 &#181;l</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>UG2020-RS</td>
			<td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 &#181;l</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>UG2812-RS</td>
			<td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>L1001</td>
			<td>We use either of these three molecular weight markers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>10488-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml&#160;</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes, Ultraflux Individual&#160;</td>
			<td>rpi</td>
			<td>145660</td>
			<td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>rpi</td>
			<td>T60040-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for amplifying Tor1a gene in &#916;E-torsinA knock-in mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3&#39; (forward) and 5&#39;-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3&#39; (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/&#181;l (~0.16 &#181;M) (reference 2).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3&#39; (forward), 5&#39;-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3&#39; (reverse) for the 498-bp amplicon, 5&#39;-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3&#39; (forward), 5&#39;-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3&#39; (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5&#39;-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3&#39; (forward), 5&#39;-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3&#39; (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS - cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>See comments section of uridine for more information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, polypropylene, 15 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess (cell number counter) chamber slides</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>C10312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6645-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dish, Petri glass 100 x 15 mm</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>15230-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527-200KU</td>
			<td>Stock solution is prepared at 1500 units/20 &#956;l = 75000 units/ml in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>10569-010, 500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 &#181;m Pore Size</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>568-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 &#181;m Pore Size</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09&#8211;0.12 mm, No. 0</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>633017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2387-10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, &#8805;99.5% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-100 ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500-250 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4&#8226;(7H2O), BioUltra, &#8805;99.5% (Fluka)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63138-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356237</td>
			<td>This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20&#176;C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4&#176;C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>51200-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MITO+ Serum Extender, 5 ml</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>355006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium (1X), liquid</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>bdh 3044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NS (Neuronal Supplement) 21&#160;</td>
			<td>prepared in the lab</td>
			<td></td>
			<td>Source: reference 69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets, 5 &#190;&#8221;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>Use this cotton-plugged 5 &#190;&#8221; Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets, 9&#8221;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, &#8805;99.0%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 2 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 5 ml&#160;</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 10 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 25 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 50 ml&#160;</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480878-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4&#8226;(7H2O)), &#8805;99.99%, Aldrich</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431478-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, SigmaUltra, &#8805;99.5% (GC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, sterile, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin, Holo, bovine plasma</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain, 0.4%</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, type XI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1005-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution, 0.25%&#160;</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine and 125-mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS - immunocytochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons

A análise de alta resolução da morfologia e função de neurónios de mamífero, muitas vezes requer a genotipagem de cada animal seguindo-se a análise de culturas primárias de neurónios. Nós descrevemos um conjunto de procedimentos para: rotulando camundongos recém-nascidos para ser genotipados, genotipagem rápida, e estabelecendo culturas de baixa densidade de neurônios do cérebro desses ratos. Ratinhos individuais são marcadas por tatuagem, o que permite a identificação de longo prazo duradoura na idade adulta. A genotipagem por o protocolo descrito é rápido e eficaz, e permite a extracção automática de ácido nucleico com uma boa fiabilidade. Isso é útil em circunstâncias em que o tempo suficiente para a genotipagem convencional não está disponível, por exemplo, em ratos que sofrem de letalidade neonatal. Culturas neuronais primárias são gerados em baixa densidade, que permite experimentos com imagens em alta resolução espacial. Este método de cultura requer a preparação de camadas alimentadoras gliais antes de plaqueamento neuronal. O protocolo é aplicado em sua totalidade para um modelo do rato da distonia distúrbio do movimento DYT1 (AE-torsinA knock-nos ratos), e as culturas neuronais são preparados a partir do hipocampo, córtex cerebral e estriado destes ratos. Este protocolo pode ser aplicado aos ratos com outras mutações genéticas, bem como de outras espécies animais. Além disso, os componentes individuais do protocolo pode ser utilizado para sub-projectos isolados. Assim, este protocolo terá amplas aplicações, não só no campo da neurociência, mas também em outros campos das ciências biológicas e médicas.

Como exemplo da aplicação deste protocolo, os resultados representativos são mostrados para a rotulagem de camundongos por tatuagem, genotipagem de confiança sob várias condições experimentais, e estabelecendo culturas neuronais primárias em camadas alimentadoras gliais. Tatuagem Crias recém-nascidas foram marcadas nas almofadas das patas utilizando um sistema de tatuagem (&#39;recém-nascido&#39; na Figura 1). Os rótul...

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Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

Rápido genotipagem dos animais Seguido por Estabelecer culturas primárias de neurônios do cérebro

Nós descrevemos os procedimentos de rotulagem e genotipagem de ratos recém-nascidos e gerando culturas neuronais primárias a partir deles. A genotipagem é rápido, eficiente e fiável e permite a extracção de ácido nucleico automatizado. Isto é especialmente útil para os ratos neonatally letais e suas culturas que exigem a conclusão prévia de genotipagem.

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Neurociência

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Multieletrodos Recordings Array of Avalanches Neuronal em culturas organotípicas

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Detecção de palmitoylation proteína em neurônios cultivados por imunoprecipitação e Acil-Biotina Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Fosfato de cálcio transfecção de primário neurônios do hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Viver a imagem, seguida por uma única célula de rastreamento para biologia celular de Monitor e a progressão da linhagem de várias populações neurais

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Cultura primária de neurônios isolados do cerebelo embrionário do rato

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Fotometria de múltiplas fibras para gravar atividade neural em animais em movimento livre

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...