Name: ordering single cells and single embryos in 3d confinement: a new device for high content screening
Uploaded: 2016-09-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening at JoVE.com

Nós reconhecemos L. Brino (facilidade de Triagem conteúdo IGBMC alta, Illkirch, França) para fornecer-nos com o anticorpo anti-Giantin, M. Labouesse Lab. para C. elegans (IGBMC) e B. Séraphin Lab. para quem gosta de levedura (IGBMC), E. Paluch e A. Hyman para as células HeLa fluorescentes (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Medical School) e JQ Wu (Ohio State University) para células de levedura de fissão; A. Hoel e F. Evenou para ajudar experimental, C. Rick (IBMC, Estrasburgo, França) para obter ajuda técnica e JC Jeannot (Femto-st, França) para ajudar na microfabricação. Este trabalho foi apoiado por fundos do CNRS, da Universidade de Estrasburgo, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale ea ci-FRC de Estrasburgo.

1. Microfabricação de &#39;Eggcups&#39; <ol><li> Fabricação do Mestre: microcavidades matriz <ol><li> Aqueça uma bolacha de 3 &#39;&#39; de silício de até 200 ° C para evaporar qualquer presença de umidade. </li><li> Spin-coat uma fina camada de SU-8 fotorresiste. Ajustar o volume da resina e velocidade de centrifugação em função do tipo e espessura do material fotosensitivo desejado. Esta espessura vai ditar a profundidade das &#39;Eggcups »(CE). Para uma camada de espessura de 30 um e SU-8 2025, spin-c...

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	<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. 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moldagem réplica foi utilizado a fim de fabricar os Eggcups &#39;&#39;. O processo de fabricação não precisa de uma sala limpa; é fácil e simples, embora alguns prática pode não ser necessária. Em particular, libertando o selo PDMS é a etapa mais importante, a fim de produzir uma grande área de &#39;&#39; Eggcups alta qualidade. Por esta razão, um cuidado especial tem de ser tomada neste passo. Se essa etapa for repetidamente falhando, considere para otimizar os parâmetros do plasma mais limpos antes da sil...

Actual em ensaios baseados em células in vitro são bidimensional (2D). Esta configuração não é natural para células de mamíferos e, por conseguinte, não é fisiologicamente relevante 1; células mostram uma diversidade de formas, tamanhos e fenótipos heterogêneos. Eles apresentam sérias limitações adicionais quando aplicado para aplicações de rastreio, tais como uma distribuição desordenada dentro do plano e fenótipos extremos de organelos celulares (fibras de stress, em particular). Isto é particularmente importante em ensaios clínicos para o teste de drogas, onde os altos orçamentos são gastos a cada ano. A maioria destas drogas que falham quando aplicados a modelos animais por causa da condição de cultura 2D artificial nas fases iniciais de rastreio de drogas. Além disso, ao utilizar esta abordagem, organelos celulares específicos podem não ser correctamente visualizado, tal como o anel de actomiosina cytokinetic durante a mitose celular, e, geralmente, estruturas que estão a evoluir no plano perpendicular ao plano de observação. Algunsnovos ensaios 2D têm sido propostos a fim de ultrapassar os inconvenientes acima mencionados e conhecimentos importantes sobre a organização do citoesqueleto foram observados 2,3. No entanto, estes ensaios ainda apresentam uma séria limitação: células apresentam um fenótipo muito propagação em contraste com o que se observa in vivo, em que as células apresentam uma arquitectura 3D. Estes artefactos associados com o método de cultura pode desencadear características não-fisiológicos, tais como fibras de stress 1,4,5 melhoradas. Tridimensionais ensaios de cultura celular fornecer várias vantagens quando comparados com os ambientes 2D 6,7. Eles são fisiologicamente mais relevante, e os resultados são, portanto, significativa. Como um exemplo, as células embebidas em hidrogéis mostram estruturas 3D-like, mas as suas morfologias diferem de uma célula para outra 8,9. No entanto, as suas morfologias diferem de uma célula para outra, o que complica as aplicações de rastreio. Uma estratégia alternativa é incorporar únicacélulas em cavidades microfabricados 10,11. posição da célula, forma, polaridade e organização célula interna pode, então, tornar-se normalizada. Além de fornecer a arquitetura 3D-like para as células, microcavidades também permite estudos de triagem de alto conteúdo 10,12-14; As células individuais podem ser ordenadas em microarrays e organelos celulares e suas evoluções pode ser observada em paralelo. Essa regularidade fornece boas estatísticas com baixo número de células e melhores resoluções temporais / espaciais. Os compostos úteis são mais fáceis de identificar com segurança. Neste estudo, nós mostramos a fabricação e aplicação de um novo sistema de células única cultura 3D-like de alto conteúdo de triagem aplicações 10,12,13. O dispositivo consiste de uma matriz de microcavidades elastoméricos (10 5 cavidades / cm 2), cunhada &#39;eggcups »(CE). Dimensões e volume total de CE neste trabalho são otimizados para o volume típico de células NIH3T3 e HeLa individuaisdurante a divisão celular. Morfologia das cavidades cilíndricas - - é seleccionado a forma da célula orientar correctamente para a visualização de processos activos. Moldagem réplica é usado para padrão de um conjunto de CE para um (PDMS) camada fina polidimetilsiloxano aderiu em um vidro lamela 15,16. As células são introduzidas na CE por centrifugação. Relatamos aqui a observação e normalização das organelas celulares (fibras de stress de actina, aparelho de Golgi e núcleo) em 3D (CE), em comparação com as mesmas células em 2D (plana) superfícies. Nós também relatam a observação de processos dinâmicos ativos, tais como o fechamento do anel actomiosina cytokinetic durante a mitose de células 17. Por fim, mostramos resultados desta metodologia em outros sistemas com paredes rígidas, como a levedura de brotamento, levedura e C. embriões elegans, o que confirma a aplicabilidade da nossa metodologia para uma ampla gama de sistemas modelo. A seguir, apresentamos um p detalhada e exaustivarotocolo, a fim de fabricar e aplicar as &#39;eggcups&#39; para microfabricação 3D. Nossa abordagem é simples e não precisa de um quarto limpo. Nós antecipamos que essa nova metodologia será particularmente interessante para testes de rastreio de drogas e medicina personalizada, em substituição de placas de Petri. Finalmente, o nosso dispositivo irá ser útil para estudar a distribuição de respostas de células a estímulos externos, por exemplo no cancro ou 18 em pesquisa básica 19.

ordering single cells and single embryos in 3d confinement: a new device for high content screening

As células biológicas são geralmente observados em superfícies planas (2D). Esta condição não é fisiológica, e fenótipos e formas são altamente variáveis. A triagem com base em células em tais ambientes têm limitações, portanto, graves: organelas celulares mostram fenótipos extremos, morfologias celulares e tamanhos são organelos celulares heterogêneos e / ou específicos não pode ser correctamente visualizado. Além disso, as células in vivo situam-se num ambiente 3D; Nesta situação, as células mostram diferentes fenótipos principalmente por causa da sua interacção com a matriz extracelular em torno do tecido. A fim de padronizar e gerar fim de células individuais em um ambiente 3D fisiologicamente relevantes para ensaios baseados em células, relatamos aqui a microfabricação e aplicações de um dispositivo para o cultivo in vitro de células 3D. Este dispositivo é composto por uma matriz 2D de microcavidades (tipicamente 10 cavidades 5 / cm2), cada um cheio com células individuais ou embriões. posi celularção, a forma, a polaridade e organização celular interna tornar-se então normalizados mostrando uma arquitetura 3D. Usamos moldagem réplica de padrão de uma matriz de microporos, (PDMS) camada &#39;eggcups&#39;, em um polidimetilsiloxano fina aderiu em uma lamela. Cavidades foram cobertas com fibronectina para facilitar a aderência. As células foram inseridos por centrifugação. A porcentagem de preenchimento foi otimizado para cada sistema que permite até 80%. As células e os embriões viabilidade foi confirmada. Esta metodologia foi utilizada para a visualização dos organelos celulares, tais como aparelhos de Golgi e núcleo, e para estudar processos activos, tais como o encerramento do anel cytokinetic durante a mitose celular. Este dispositivo permitiu a identificação de novas funcionalidades, tais como acumulações periódicas e heterogeneidades de miosina e actina durante o encerramento do anel cytokinetic e fenótipos compactadas para Golgi e alinhamento núcleo. Caracterizamos o método de células de mamíferos, levedura de fissão, brotação de levedura, C. elegans wom adaptação específica em cada caso. Finalmente, as características deste dispositivo torná-lo particularmente interessante para ensaios de rastreio de drogas e medicina personalizada.

Dos eggcups »(CE) são uma metodologia de alto teor-triagem romance que permite a visualização de células orientadas e embriões em um ambiente 3D. Além disso, alguns processos celulares, que são difíceis de observar em culturas 2D padrão (planas), pode ser observada por este novo método. A Figura 1a mostra um resumo do processo de microfabricação CE (ver também a secção 1 em o protocolo acima descrito ). O método é simples, rápido, eficiente e sem qualquer exigência de equipamentos es...

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Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Nós relatamos um dispositivo e um novo método para estudar células e embriões. células individuais são precisamente ordenados em matrizes microcavidade. Seu confinamento 3D é um passo para ambientes 3D encontrados em condições fisiológicas e permite a orientação organela. Ao controlar a forma da célula, esta configuração minimiza variabilidade relatados em ensaios convencionais.

Ordenando células individuais e único embriões em 3D Confinamento: Um novo dispositivo de alta Screening conteúdo

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Bioengenharia

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas por pinça óptica

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

O cultivo de células de mamíferos utilizando um uso único sistema pneumático Bioreactor

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Microtissues 3D para terapia regenerativa injetável e triagem de drogas de alto rendimento

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Um protocolo para rastreamento em tempo real 3D única partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

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Captação de novas nanopartículas revestidos de lipídeos contendo Falcarindiol por células-tronco mesenquimais humanas

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Fabricação de guias de ondas de modo zero para microscopia de molécula única de alta concentração

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...