Name: ordering single cells and single embryos in 3d confinement: a new device for high content screening
Uploaded: 2016-09-18T13:00:00
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Reconocemos L. Brino (planta de filtrado de contenido de alta IGBMC, Illkirch, Francia) para que nos proporciona el anticuerpo anti-Giantin, M. Labouesse laboratorio. para C. elegans (IGBMC) y B. Séraphin laboratorio. de levadura en ciernes (IGBMC), E. y A. Hyman Paluch para las células HeLa fluorescentes (MPI-CBG, Dresde), J. Moseley (Dartmouth Medical School) y JQ Wu (Universidad del Estado de Ohio) para células de levadura de fisión; A. Hoël y F. Evenou ayuda experimental, C. Rick (IBMC, Estrasburgo, Francia) para la ayuda técnica, y JC Jeannot (Femto-st, Francia) para ayudar en la microfabricación. Este trabajo fue apoyado por fondos del CNRS, la Universidad de Estrasburgo, conectus, La Fundación para la Investigación Médica y el ci-FRC de Estrasburgo.

1. La microfabricación de Eggcups &#39;&#39; <ol><li> La fabricación del Maestro: microcavidades matriz <ol><li> Calentar una oblea de 3 &#39;&#39; de silicio de hasta 200 ° C para evaporar cualquier presencia de humedad. </li><li> Spin-abrigo de una fina capa de SU-8 fotoprotector. Ajustar el volumen de resina y de hilado de velocidad en función del espesor y fotoprotector tipo deseado. Este espesor dictará la profundidad de las hueveras &#39;&#39; (EC). Para una capa de espesor de 30 micras y SU-8 2025, spin-ca...

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moldeo de réplica se utilizó con el fin de fabricar las &#39;hueveras. El proceso de fabricación no necesita una habitación limpia; es fácil y simple, aunque puede ser necesario un poco de práctica. En particular, la liberación de la marca de PDMS es el paso más crítico con el fin de producir una gran área de &#39;&#39; hueveras de alta calidad. Por esta razón, especial cuidado tiene que ser tomado en este paso. Si este paso se abstiene repetidamente, tenga en cuenta para optimizar los parámetros del plasma ...

Actual en ensayos basados ​​en células in vitro son de dos dimensiones (2D). Esta configuración no es natural para las células de mamíferos y, por tanto, no es fisiológicamente relevante 1; las células muestran una diversidad de formas, tamaños y fenotipos heterogéneos. Presentan serias limitaciones adicionales cuando se aplica a las aplicaciones de cribado, tales como una distribución desordenada dentro del plano y fenotipos extremos de los orgánulos celulares (fibras de estrés, en particular). Esto es particularmente importante en los ensayos clínicos de las pruebas de drogas, donde los presupuestos altos se gastan cada año. La mayoría de estos fármacos fracasan, aunque cuando se aplica a los modelos animales debido a la condición de cultivo 2D artificial en las primeras etapas de la detección de drogas. Además, mediante el uso de este enfoque, los orgánulos celulares específicos no pueden ser correctamente visualizados, tal como el anillo de actomiosina cytokinetic durante la mitosis celular, y en general estructuras que se están desarrollando en el plano perpendicular al plano de observación. Algunosnuevos ensayos 2D se han propuesto con el fin de superar los inconvenientes antes mencionados y importantes conocimientos sobre la organización del citoesqueleto se han observado 2,3. Sin embargo, estos ensayos todavía presentes una seria limitación: células muestran un fenotipo muy propagación en contraste con lo que se observa in vivo, donde las células presentan una arquitectura 3D. Estos artefactos asociados con el método de cultivo pueden desencadenar características no fisiológicas tales como las fibras de estrés mejoradas 1,4,5. Ensayos de cultivos celulares tridimensionales proporcionan múltiples ventajas en comparación con los entornos 2D 6,7. Ellos son fisiológicamente más relevantes, y los resultados son por lo tanto significativa. Como un ejemplo, las células embebidas en hidrogeles muestran estructuras 3D-como pero sus morfologías difieren de una célula a otra 8,9. Sin embargo, sus morfologías difieren de una célula a otra, lo que complica las aplicaciones de cribado. Una estrategia alternativa es la de insertar solacélulas en cavidades microfabricados 10,11. posición de la célula, la forma, la polaridad y la organización interna de la pila pueden entonces convertirse normalizado. Además de proporcionar una arquitectura 3D-como a las células, microcavidades cuenta también los estudios de cribado de alto contenido 10,12-14; células individuales pueden ser ordenados en microarrays y orgánulos celulares y sus evoluciones se pueden observar en paralelo. Esta regularidad ofrece buenas estadísticas con bajo número de células y mejores resoluciones temporales / espaciales. Los compuestos útiles son más fáciles de identificar de forma fiable. En este estudio, mostramos la fabricación y aplicación de un nuevo sistema de células sola cultura 3D-como para aplicaciones de alto contenido de cribado 10,12,13. El dispositivo consiste en una serie de microcavidades elastoméricos (10 5 cavidades / cm2), acuñadas &#39;&#39; hueveras (EC). Las dimensiones y el volumen total de la CE en este trabajo se han optimizado para el volumen típico de las células HeLa y NIH3T3 individualesdurante la división celular. La morfología de las cavidades cilíndricas - - se selecciona de forma de la célula orientar correctamente para la visualización de procesos activos. Moldeo de réplica se utiliza para una variedad de patrones CE sobre una delgada polidimetilsiloxano (PDMS) capa adherida sobre un vidrio cubreobjetos 15,16. Las células se introducen en la CE por centrifugación. Presentamos aquí la observación y la normalización de los orgánulos celulares (fibras de estrés de actina, aparato de Golgi y el núcleo) en 3D (CE) en comparación con las mismas células en 2D (plano) superficies. Nos informan también de la observación de los procesos dinámicos activos, tales como el cierre del anillo de actomiosina cytokinetic durante la mitosis celular 17. Finalmente, se muestran los resultados de esta metodología en otros sistemas con paredes rígidas, como la levadura en ciernes, levadura de fisión y C. embriones elegans que confirma la aplicabilidad de nuestra metodología para una amplia gama de sistemas modelo. A continuación presentamos una p detallado y exhaustivorotocolo con el fin de fabricar y aplicar las hueveras &#39;&#39; para la microfabricación 3D. Nuestro enfoque es simple y no necesita una habitación limpia. Anticipamos que esta nueva metodología será particularmente interesante para los ensayos de cribado de fármacos y la medicina personalizada, en sustitución de las placas de Petri. Finalmente, nuestro dispositivo será útil para estudiar la distribución de respuestas de las células a los estímulos externos, por ejemplo en el cáncer de 18 o en la investigación básica 19.

ordering single cells and single embryos in 3d confinement: a new device for high content screening

Las células biológicas se observan generalmente en las superficies planas (2D). Esta condición no es fisiológico y fenotipos y formas son muy variables. Selección basada en células en estos entornos tienen limitaciones, por lo tanto graves: orgánulos celulares muestran fenotipos extremos, morfologías celulares y tamaños son orgánulos celulares heterogéneas y / o específicos no se pueden visualizar correctamente. Además, las células in vivo se encuentran en un entorno 3D; en esta situación, las células muestran diferentes fenotipos principalmente debido a su interacción con la matriz extracelular que rodea el tejido. Con el fin de estandarizar y generar orden de las celdas individuales en un entorno 3D fisiológicamente relevante para los ensayos basados ​​en células, se presenta aquí la microfabricación y las aplicaciones de un dispositivo para el cultivo in vitro de células en 3D. Este dispositivo consiste en una matriz 2D de microcavidades (típicamente 10 5 cavidades / cm 2), cada uno lleno con células individuales o embriones. posición de la célulación, la forma, la polaridad y la organización interna de la celda se convierten entonces normalizado que muestra una arquitectura 3D. Utilizamos moldeo réplica al patrón de una serie de microcavidades, hueveras &#39;&#39;, sobre una delgada polidimetilsiloxano (PDMS) capa adherida sobre un cubreobjetos. Las cavidades se cubrieron con fibronectina para facilitar la adhesión. Las células se insertan por centrifugación. porcentaje de llenado se ha optimizado para cada sistema que permite hasta 80%. Las células y los embriones se confirmó la viabilidad. Se aplicó esta metodología para la visualización de orgánulos celulares, tales como aparato de Golgi y el núcleo, y para estudiar los procesos activos, tales como el cierre del anillo cytokinetic durante la mitosis celular. Este dispositivo permitió la identificación de nuevas características, tales como la acumulación y la falta de homogeneidad de la miosina y actina periódicas durante el cierre del anillo cytokinetic y fenotipos compactados de Golgi y la alineación núcleo. Nos caracteriza el método de células de mamífero, levadura de fisión, la levadura en ciernes, C. elegans wITH adaptación específica en cada caso. Por último, las características de este dispositivo lo hacen particularmente interesante para los ensayos de cribado de fármacos y la medicina personalizada.

Las hueveras &#39;&#39; (EC) son una metodología novedosa de alto contenido de cribado que permite la visualización de las células y embriones orientadas en un entorno 3D. Además, algunos procesos celulares, que son difíciles de observar en cultivos estándar 2D (planos), pueden ser observados por este nuevo método. La figura 1a muestra un resumen del procedimiento de la microfabricación CE (ver también la Sección 1 en el protocolo anteriormente descrito ). El método es simple, rápido, eficie...

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Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Se presenta un dispositivo y un nuevo método para estudiar las células y embriones. Las células individuales se ordenan precisamente en matrices microcavidad. Su confinamiento en 3D es un paso hacia entornos 3D se encuentran en condiciones fisiológicas y permite la orientación orgánulo. Mediante el control de la forma celular, esta configuración reduce al mínimo la variabilidad reportado en ensayos estándar.

Ordenando las células individuales y solo los embriones en 3D Confinamiento: un nuevo dispositivo para la selección de alto contenido

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Investigación

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Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

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