Name: workflow for high-content, individual cell quantification of fluorescent markers from universal microscope data, supported by open source software
Uploaded: 2014-12-16T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse CRUK 15.043 und 14.251 CRUK unterstützt. Wir danken Daniel Wetterskog und Ka Kei Ho für die technische Unterstützung und die kritische Durchsicht des Manuskripts.

1. Experimentelle Störungs und Zellmarkierung für Response-Marker (Rückwärts Transfektion siRNA-Bildschirm) <ol><li> In einer sterilen Gewebekultur Haube Pipette 70 ul von 200 nM siRNA in 1x siRNA Puffer in Vertiefungen einer sterilen, plain Platte mit 96 Vertiefungen. Verdünne Transfektion Lipids in 40 Volumina serumfreies DMEM-Medium und abzug 105 ul in jede Vertiefung, die siRNA. HINWEIS: Die Verdünnung 262,5 ul Lipids in 10,5 ml serumfreies DMEM ergibt einen Mastermix für eine ganze Platte mit 96 Vertiefungen von siRNA und liefert 2,6 &amp; mgr; l Lipid pro Vertiefung. Die Verwendung von 200 nM siRNA Ausgangskonzentration in diesem Schritt eine Arbeitskonzentration von 20 nM in Schritt 1.3 zu liefern, aber Verfahren für Arbeitskonzentrationen bis 5 nM, mit der Ausgangskonzentration entsprechend angepasst (dh 50 nM) zu arbeiten. Niedrigere Arbeitskonzentration kann Off-Target falsch positive Werte zu reduzieren, obwohl sie die Größe des auf dem Zielantwort zu reduzieren, was zu der auf dem targe erhöhent der falsch negativen Ergebnisse. </li><li> Mischen Sie die Platte durch sanfte Vibrationen für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Eine Unterteilung der erhaltenen 175 &amp; mgr; l in drei 50 ul Wiederholungen pro Target auf einem undurchsichtigen, Gewebekultur-behandelten 96-Well-Platte mit durchsichtigem Boden. </li><li> Reverse transfizieren durch Dispensieren 8000 Zellen pro Vertiefung in 150 ul DMEM 10% Serum enthält, direkt auf die 50 &amp; mgr; l Lipid-siRNA-Komplexe. Verwenden HCT116 Dickdarmkrebs-Zellen, die ein GFP-markierten Marker Berichterstattung CDK2 Aktivität 5,8. Kein weiteres Mischen erforderlich. Verschließen Sie die Platte mit einer sterilen, Kleber, atmungsaktive Membran, um Feuchtigkeit zu kontrollieren und Teller &quot;Kanteneffekte&quot; zu vermeiden und legen Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 für 48 Stunden. </li><li> Saugen Sie die Medien, so dass eine geringe Restmenge an Medien in den Vertiefungen bleibt. Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 100 ul 4% gepuffertem Formaldehyd in jede Vertiefung und inkubieren in einer Abzugshaube für 10 Minuten bei Raum temperatur. </li><li> Entfernen Sie die Befestigungslösung durch Absaugen der Platte. An diesem Punkt beendet wird der Versuch durch Waschen der Platte dreimal mit 100 &amp; mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und dann abgedichtet zu speichern, unter 100 &amp; mgr; l PBS in der Dunkelheit bei 4 ° C für bis zu einer Woche, oder gehen mit dem Permeabilisierung der Zellen. HINWEIS: Wir empfehlen die Verarbeitung Platten so schnell wie möglich nach der Fixierung und in der Regel bevorzugen die Lagerung von vollständig bearbeiteten Platten. Biozide Konservierungsmittel, wie Thimerosal, Natriumazid, oder kommerzielle Alternativen können hinzugefügt werden, um micoroganismal Wachstum zu verhindern. Zugabe von Phosphataseinhibitoren hilft, Phospho-Epitope zu erhalten, und andere Mittel, um die Proteinmodifikationszustände zu bewahren kann nützlich in relevanten Assay Kontexten </li><li> Entfernen PBS von der Platte und Permeabilisierung der Zellen durch Zugabe von 100 ul Permeabilisierung Lösung. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Saugen Sie das Permeabilisierung Lösung unter Verwendung einer MultiCHannel Pipette. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. </li><li> Blockieren die Zellen durch Zugabe von 100 ul Blocklösung pro Well für 30 min bei Raumtemperatur. Nehmen Sie den Block-Lösung durch Absaugen der Platte, dann mit 50 ul anti P-S780 RB1 Antikörper verdünnt 500fach im Block-Lösung für 2 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur zu untersuchen. </li><li> Dreimal waschen Sie die Platte mit 100 ul Waschlösung Platte, so dass die Lösung auf der Platte für jeweils 5 min. Sonde die Platte über Nacht im Dunkeln bei 4 ° C mit 50 ul fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper verdünnt 1000fach in Blocklösung mit 2 uM des Chromatins spezifischen DNA-Farbstoff Bisbenzimid ergänzt. Dreimal Vertiefungen wie zuvor und abgedichteten Speicher unter 100 ul PBS in der Dunkelheit bei 4 ° C. Bild die Platte innerhalb von zwei Wochen. </li></ol> 2. Bildgebung und Bildsegmentierung <ol><li> Verwenden Sie eine konfokale oder Spinnplattenfluoreszenzmikroskop mit einem 20x-Objektiv getrennte nehmen 16-Bit, Graustufen- TIFF-Bildern in drei Kanäle, die der DNA-Farbstoff, GFP und Immunofärbung Fluorophore. Erfassen viele nicht-überlappende Bildsätze, die hier als Rahmen, um Bild etwa 1.000-2.000 Zellen pro Vertiefung. </li><li> Nennen Sie die Bilddateien systematisch, so dass jeder Dateiname ist eine einzigartige Kombination von &quot;Experiment Name&quot;, &quot;gut-Adresse&quot;, &quot;Bildnummer&quot; und &quot;Kanalkennung&quot;, in dieser Reihenfolge (Abbildung 3). Das Beispiel-Datensatz verwendet &quot;Blue&quot; (Chromatin-DNA-Färbung) oder &quot;Green&quot; (GFP) oder &quot;Red&quot; (die immungefärbten Fluorophor) als Kanalkennungen. Die gut Adresse, Rahmennummer und Kanalkennung sind weiter als die Bild-Metadaten bezeichnet. Verwenden Sie den Unterstrich zu verwirrend gut und Rahmen Metadaten zu vermeiden. </li><li> Benennen Sie die Dateien mit den Metadaten-Elemente in der angegebenen Reihenfolge. Dies ist notwendig, um sicherzustellen, dass die nachfolgende Softwareschritte Correctly Gruppe Gruppen von Bildern für die Analyse. </li><li> Downloaden und installieren Sie die Freeware-Zell Profiler, Aktive Perl Community Edition, R statistischen Programmierumgebung und RStudio. Akzeptieren Sie alle Standardoptionen bei der Installation; PC-Nutzer Installation von Active Perl sollte alle Möglichkeiten zu PATH, Dateierweiterung Verein und Skriptzuordnung in dem dazu aufgefordert werden können. Aktive Perl ist optional für Mac-Benutzer, aber sie werden sonst müssen Sie die Perl-Skript in Schritt 3.2 vom Terminal-Befehlszeile anstatt Symbol Klick ausführen. </li><li> Öffnen Sie die Zelle Profiler-Software, klicken Sie auf &quot;Datei&quot;, &quot;Import-Pipeline&quot; und dann &quot;Aus Datei&quot; und wählen Sie die Datei 3_channels_pipeline.cppipe (Abbildungen S1A und S1B). Die Datei enthält Anweisungen für die Software-Image-Datei-Metadaten aus dem beschriebenen Dateinamenskonvention interpretieren notwendig. Zell Profiler bezieht nun die Bilder, extrahiert Kern-DNA und Antikörper Intensitäten von thESE und verwendet den GFP-Kanal, um das Verhältnis von Kerngegen Cytoplasma Intensität für jede Zelle zu berechnen erfasst (Abbildungen 4 und 5). </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Ansicht Ausgabeeinstellungen&quot; in der linken unteren Ecke des Zell Profiler-Fenster. An der Spitze der neuen Bildschirm sind Textfelder &quot;Standardeingabeordner&quot; und &quot;Standard-Ausgabeordner &#39;beschriftet. Einer nach dem anderen finden Sie in den Ordner-Symbole auf der rechten Seite dieser Boxen und wählen Sie den Speicherort der Bilddateien für die Analyse und das Ziel für die extrahierten Daten, bzw. (Abbildung S1C). </li><li> Beginnen Sie mit der Bildanalyse, indem Sie die Schaltfläche &quot;Analysieren Images&quot; in der linken unteren Ecke des Zell Profiler. Am unteren Rand des Bildschirms beachten Sie die verbleibende Zeit für die Datenextraktion, der &#39;Stop Analysis &quot;und&quot; Pause &quot;Buttons. Bei Bedarf unterbrechen die Analyse, indem Sie die &quot;Pause&quot; -Taste jederzeit, was nützlich ist,wenn gerade die Bilder analysiert (in Schritt 2.8 beschrieben). </li><li> Optional können die Fenster für eine der Bildanalyseschritte, indem Sie auf die Augensymbole in der Platte auf der äußersten linken Rand des Programmfensters (Abbildung S1D). Das Fenster &quot;IdentifyPrimaryObjects&quot; und solche für &quot;Secondary&quot; und &quot;Tertiäre Objects beachten, um zu prüfen, dass die aktuellen Einstellungen in Cell Profiler ausführen Bildsegmentierung eignen (siehe Abbildung 1 und Diskussion für die Beratung über eine Veränderung dieser Einstellungen). </li><li> Klicken Sie auf &quot;OK&quot; im Meldungsfeld, wenn die Analyse abgeschlossen ist erscheint. Gehen Sie zu der Position &#39;Default Output Folder &quot;, in der alle Dateien mit den Ergebnissen werden als durch Kommata getrennte-Wert (CSV) Dateien (Abbildung S2A) gespeichert. </li></ol> 3. Datenextraktion <ol><li> Finden Sie die neue Datei &quot;Nuclei.csv&quot;, die nur einige der Highlights istAusgabe von Zell Profiler. Diese Datei enthält einzelne Zelldaten für fluoreszierende Antikörper Kernstärke, Kern-DNA Intensität und GFP-Reporter CDK2 Verhältniswerte (6A &amp; S2A). HINWEIS: Verschiedene Laboratorien werden, diese Art von Daten zu verarbeiten, um die Art der eigenen Assays angepasst werden soll. Für die aktuelle Daten empfohlenes ist die Verknüpfung der Zellen aus jeder Behandlungszustand nach den Antikörperdaten und die GFP-Reporter CDK2 Werte mit dem mitgelieferten Perl-Skript &quot;2_gate_classifier.pl &#39;. </li><li> Kopieren Sie die bereitgestellten Perl-Script-Datei &quot;2_gate_classifier.pl&quot; in denselben Ordner wie die &quot;Nuclei.csv &#39;Datendatei (Abbildung S2A). Doppelklicken Sie auf das Symbol für das Perl-Skript und, wenn Sie gefragt werden, geben Sie den vollständigen Namen der Datendatei gefolgt von einem &#39;.csv&#39; Dateiname Namen für die Datei, in der die Zellen ausgeblendet werden und schließlich die Gate Werte für die Antikörper sindFluoreszenz und GFP-CDK2 Reporter Daten. HINWEIS: Wie Sie in erster Linie festzustellen, Gate-Einstellungen und wenden diese zur Analyse der Daten sind unten in der Vertreter Abschnitt Daten und 6 diskutiert (um die Daten zur Verfügung gestellt Verwendung &quot;0.004&quot; und &quot;1,5&quot; bzw. zu analysieren). Mac-Anwender sollten das Perl-Skript aus der Terminal-Befehlszeile durch Eingabe ausführen: &quot;perl 2_gate_classifier.pl &#39;. </li><li> Achten Sie auf die neu erstellte Datei, die die rohen Einzelzellentestwerte von den ursprünglichen Zell Profiler Daten mit Subpopulation Etiketten, die, wie jede Zelle aus jeder Vertiefung führt gegen beide Tore (6C) zeigen, kombiniert. </li><li> Zeichnen Sie die Daten für jede Versuchsbedingung mit den einzelnen Zell-Subpopulation Etiketten durch Öffnen des RStudio Software. Klicken Sie auf &quot;Datei&quot; und &quot;Datei öffnen&quot;, wählen Sie die Datei &#39;versehen analysis.r&#39;. Beachten Sie die Befehle an den 6B plotten, <strong&gt; 7 und 8 in der oberen linken Fenster RStudio (Abbildung S2B). In der oberen linken Fenster, zwischen den Anführungszeichen Symbole in den Zeilen 5 und 6, geben Sie den Computeradresse des Ordners mit den gated Daten. Fügen Sie den Laufwerksbuchstaben und den Namen der Datei selbst, bzw. (zB &quot;C: / Ordner Analyse / Analyse-Ausgang&quot; und &quot;nuclei_gated.csv&quot;). HINWEIS: Wenn RStudio wird zum ersten Mal auf einem Computer verwendet wird, wird die R-Grafikpaket &quot;ggplot2&quot; müssen zuerst installiert werden. Dies ist ein nur einmal Schritt für eine neue Installation von RStudio, nach dem dieser Schritt überflüssig. Um &#39;ggplot2&#39; zu installieren, klicken Sie auf die Registerkarte namens &quot;Packages&quot; über dem Fenster in der unteren rechten Ecke des RStudio, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Install Packages&quot;, die sich unter diesem geöffnet. Ein neues Fenster wird angezeigt. Type &#39;ggplot2 &quot;(Verzicht auf Zitate) in die&#39; Packages &#39;sTempo in diesem neuen Fenster ein und klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Installieren&quot;, um das Fenster zu schließen, installieren Sie die erforderlichen ggplot2 Funktionen und zum Haupt RStudio Fenster von Schritt 3.6 fort. </li><li> Markieren Sie die Zeilen 1 bis 17 in der oberen linken Fenster des RStudio, dann auf die Schaltfläche &quot;Ausführen&quot;. Dadurch werden die experimentellen Daten, Grenzwerte und auch Ortsangaben in R (Abbildung S2C) eingeben. R wird nun vorübergehend die relevanten Daten für das Plotten zu halten. </li><li> Markieren Sie einzelne Blöcke des verbleibenden kode Zeile 17, und erstellen Sie die entsprechenden Grundstücke, indem Sie auf &quot;Ausführen&quot; Taste wie zuvor. Beachten Sie die Grundstücke in das Fenster in der unteren rechten Ecke des RStudio und speichern Reihe von Formaten, indem Sie auf die Schaltfläche &#39;Export&#39; (Abbildung S2D). </li><li> Beim Schließen RStudio, klicken Sie auf &quot;Nicht speichern&quot;, wenn Sie dazu aufgefordert. Dies verhindert Verwechslungen bei der nächsten Verwendung RStudio, die sonst Daten enthalten wirdder vorherigen Sitzung. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren

Die beschriebene Arbeitsablauf stellt ein Verfahren für die Multiwell perturbance von Zellen mit siRNA, nachfolgenden Marker Erkennung und schließlich nutzen eine Reihe von softwaregestützten Schritte zur Gewinnung von quantitativen Daten aus den resultierenden Fluoreszenzmikroskopiebilder zu erleichtern. Der Ansatz beruht auf der Lieferung von nuklearen und zytoplasmatischen Intensitätswerte für einzelne Zellen, die breite praktische Anwendung in vielen zellbasierten Anwendungen hat konzentriert. Die Beispieldaten verwendet, hier in einer siRNA Bildschirmeinstellung, in der zwei fluoreszierende Assays für G1-Phase des Zellzyklus Transit getestet und zurück zu einer direkteren biophysikalischen Messung der Zellkern-DNA-Gehalt korreliert erzeugt. Die Verwendung eines fluoreszierenden DNA-Farbstoff, um Bild nukleäre DNA ist ein unverzichtbarer Schritt in der Bildsegmentierungsprozess, da es erlaubt die Identifizierung von individuellen Zellen, und die resultierende &quot;Nuclei Maske &#39;dient als Ausgangspunkt für die entsprechende cytoplasmi identifizierenc Regionen. Die GFP-markierten Reporter CDK2, die stabil in den Zellen exprimiert wird, gibt eine variable noch durchweg höher als Hintergrundsignals in das Zytoplasma durch die diese Kammer kann abgegrenzt werden. Die gleiche Analyse Leitung sollte für die Analyse von Protein Translokationsereignisse Verwendung anderer geeigneter Fluoreszenz-Reportern verbunden und ihre Reaktion auf perturbance sein. Auch Austausch des GFP-Reporter mit CDK2 Cytoplasma-spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen erlauben würde die alternative Verwendung dieses Algorithmus, um die Abmessungen des Cytoplasmas und der relativen Größe der Zellen in den Bildern zu messen. Eine weitere Designüberlegung bei der hier beschriebenen Bildsegmentierungsstrategie ist die Verwendung von Zell Profiler integrierte Intensitätswerte für die Quantifizierung der DNA zu liefern. Integration der Intensitätswerte für die Kern-DNA-Färbung Daten ermöglichen mögliche Variationen in Kerngröße und stellt eine gute Übereinstimmung für die Quantifizierung Profile gesehenfür Propidiumiodid gefärbten FACS-Daten. Jedoch können integrierte Intensität nicht liefern ein geeignetes Mittel, um die Proteinfunktion zu kontrollieren, wo mittlere Konzentration von Durchschnittsintensität von Antigen Fluoreszenz exemplifiziert ist biologisch relevant als die integrierte Gesamtmenge an Protein (und assoziierten Fluoreszenz) in einem Zellkompartiment. Daher mittlere Intensität Werte wurden für die P-S780 RB1 und GFP-Daten verwendet. Die Option, zwischen den beiden Modi (Mittelwert oder integrierten) der Datenauswertung auf dem Panel des Zell Profiler Software &#39;ExportToSpreadsheet&#39; gefunden zu ändern. Die Analyse Einstellungen im 3_channels_pipeline.cppipe Datei für die Bilder in dem Beispiel Datensatz optimiert. Die Analyse der neuen Bilder-Sets mit diesem Protokoll wird verlangen, dass die Dateinamen übernehmen die oben beschriebene Namenskonvention (Abbildung 3). Auch Werte Empfindlichkeit um die Helligkeit des Zellkern-DNA-Färbung und Schwellenwerte für den Hintergrund anzupassenIntensitäten in den neuen Bildsätze können müssen innerhalb der Zelle Profiler-Einstellungen angepasst werden. Angesichts der Schlüsselrolle der DNA-Färbung hält für den Bau der verschiedenen Bildsegmentierung Masken, ist die Anwendung der richtigen Empfindlichkeitseinstellungen für diesen Kanal Schlüssel für die erfolgreiche Analyse der neuen Bilddaten mit der Zell Profiler Software. Die zur Verfügung gestellten Zell Profiler Einstellungsdatei (3_channels_pipeline.cppipe) enthält Hinweise auf die am häufigsten nützliche Parameter zur Anpassung der Analyse neuer Daten. Diese Hinweise sind in das Textfeld am oberen Rand des Bildschirms in der Zelle Profiler Hauptfenster und sind Leitlinien für die Änderung der Empfindlichkeitseinstellungen und Einstellung die Anzahl der Kanäle untersucht werden. Wie in Abschnitt 2.8-Protokoll, um die Einstellungen für neue Bilddaten zu testen angeklagt kann es notwendig sein, um die Bildsegmentierung während der Bildanalyse, indem Sie auf die offene &quot;Auge&quot; Symbole für jeden der zu beobachten &quot;Identifizieren ... Objekte&quot; Protokollschritte (Abbildung S1D </strong&gt;). Insbesondere wird die Visualisierung der Bilddaten durch &quot;IdentifyPrimaryOjects &#39;zeigen, wenn die Kerne Maske korrekt aus Bildern der DNA-Färbung identifiziert. Auf der Zell Profiler Software Seite für die &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; Modul ist der Schwellenwert-Korrekturfaktor. Versuch und Irrtum Einstellung dieses Wertes werden die meisten Kernerkennungsfehler zu beheben. Die Werte Gleichgewicht der DNA Kanal gegen die Hintergrundintensität für jedes Bild. Threshold Korrekturfaktor Werte Scharnier um 1, wobei mehr als dieses ist strenger (gut für klare Bilder) und weniger als 1 ist nachsichtig (um Bilder geeignet mit weniger Kontrast zwischen Färbung und Hintergrund). Das rohe Ausgabe einzelner Zellendaten aus Zell Profiler kann in unterschiedlicher Weise auf die Bedürfnisse der anderen Studien entsprechen analysiert werden. Hier dargestellt ist der Einsatz von einem Perl-Skript zu Toren, zwei der gemessenen Parameter pro Zelle, um das Extrahieren biologische Trends aus der Daten ein, um assistd Genehmigung Querverweise der identifizierten Untergruppen mit zusätzlichen Messungen. Zwar ist es auch möglich, Elemente der Anschnitt im Rahmen der Zell Profiler umfassen, die alternative Route verwendet hier eine größere Flexibilität und Geschwindigkeit, insbesondere wenn große Datenmengen zu beurteilen sein. Der langsamste Stufe in den post-Bildaufnahme Phasen des derzeitigen Protokolls ist der Betrieb des Zell Profiler Software. Zell Profiler hier wird ohne dass Tore, ein un-gated Rohdatensatz, die schneller mit der anschließenden Perl-Skript erneut analysiert werden können, erzeugen mit unterschiedlichen Gate-Werten führen und, wenn nötig, iterativ. Nicht alle Studien werden im Voraus wissen, die geeignet Tor Werte, da dies mit Reagenzien, an einem bestimmten Satz von Daten unterscheiden und möglicherweise im Laufe der Zeit. Es wird daher empfohlen, Histogramme Darstellung der Rohdaten Verteilung von Zell Profiler für positive Kontrollen und Mock-gestörten Zellen, um erhalten zu generieren, um geeignete Gate wertvolle identifizierenes für die Parameter von Interesse. Die Perl-Script geschrieben, um einen fest definierten Spaltenstruktur von Daten aus Zell Profiler akzeptieren und kann nicht mehr funktionieren, wenn ein Benutzer die Anzahl der Parameter Ausgabe von Cell Profiler mit den Einstellungen des &quot;ExportToSpreadsheet &#39;modifiziert. Als Beitrag zur Umsetzung Änderung der Einstellungen Noten innerhalb der Perl-Skript-Dateien enthalten. Um zu sehen, diese sehen können Sie das Skript in einem Texteditor, vorzugsweise Texteditor für Programmierer, um Farbcode Perl-Elemente gesetzt (zB http://www.activestate.com/komodo-edit). Diese Hinweise zeigen an, wo das Skript anpassen, um auf Änderungen im Datenformat anpassen. Ähnlich wie bei den Perl-Skripte, die R-Code-Datei zur Verfügung gestellt (analysis.r), enthält die Anweisungen für die Darstellung der Zahlen aus der Bildanalyse-Daten können in einem Texteditor oder RStudio Software gelesen werden, um zusätzliche Hinweise zur Verwendung und Anpassung zu sehen. Diese Notizen können mit Details zu regulären Ausdrücken und Perl &lt;ergänzensup&gt; 12 und die ggplot2 13 Paket für R, die beide bilden die Grundlage dafür, wie die Daten gelesen werden, kommentiert und aufgetragen sind. Neue Studien unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie sowie Rohdaten mit Open-Source-Publikationen hinterlegt sind zugänglich für Analysemethoden, wie sie hier beschrieben. Das Wesen der High-Content-Daten eignet sich für rekursive Analyse mit verschiedenen analytischen Schwerpunkte je nach Forschungsinteresse eines jeden Betrachters. Obwohl die Fragen, die von den Daten gefragt werden können, sind von den Sonden ursprünglich beschränkt Bilddaten können oft sinn über den Rahmen von Studien, die sie erzeugt, erneut analysiert werden.

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Verwendung der frei verfügbaren Software-Zelle Profiler Algorithmus geführte Abbau von Fluoreszenzmikroskopische Bilder von anhaftenden Zellen, einzelne Zellen und definiert subzellulären Regionen zu identifizieren durchzuführen. Dieser Ansatz, der als Bildaufteilung bezeichnet, erlaubt die anschließende Mehrparameter-Analyse der abgebildeten Zellen durch Quantifizierung fluoreszenzmarkierten Markern in jede Zelle oder subzellulären Bereich (bezeichnet als segmentierten Objekten) lokalisiert. Dieser Workflow stellt eine Grundlage für ermöglicht High-Content-Analyse und soll als Werkzeug, das weiter ausgebaut werden kann und geändert werden, um Multi-parametrischen anpassen, einzelne Zellanalysen im Labor, ohne Zugang zu spezialisierten High-Content-Instrumenten oder proprietäre Software dienen. Die mit diesem Manuskript geliefert Dateien enthalten ein Testset relevanter Rohbilddaten, Algorithmus-Einstellungen und die Unterstützung Skripte, um die beschriebene Analyse zu generieren. Die zur Verfügung gestellten Algorithmus Einstellungen foder Zell Profiler sind für die Beispieldatensatz und der Diskussion Abschnitt Details, welche Anpassungen notwendig sein, um den Einsatz von Bilddaten aus anderen Studien ermöglichen optimiert. Sobald quantitativen Daten wurde mit Zell Profiler extrahiert, kann verschiedenen Labors unterschiedliche Anforderungen an, wie man das von den einzelnen Zellwerten im Rohdaten dargebotener Informationen haben; hier dargestellt ist ein Ansatz, mit dem Gatter werden auf die Rohdaten für jeden Assay verwendet. Verwendung dieser Gatter werden die Daten in binäre Bezug Reaktion umgewandelt, so dass die Visualisierung des Trends Verknüpfung verschiedener Behandlungen mit den Subpopulationen von Zellen, die eine Antwort durch den Gates definiert. Die Tore sind auf Beobachtungen der für die entsprechende negative und positive Kontrollen erhalten für jeden relevanten Messdaten Verteilungen eingestellt. Die Verwendung von Toren ist nur ein Beispiel dafür, wie man die rohe, zellbasierten Messungen fort. Auch hier dargestellt ist die Verwendung von Kern-DNA Intensität michasurements in ihrer Rohform als kontinuierlicher Wertebereich in Kombination mit den gated Daten. Andere Ansätze zur Verwaltung von Bildanalysedaten in Betracht gezogen werden, je nach der Art der Studie; statistische Alternativen zur Verwendung von Toren für die Zuordnung von Zellen, um Subpopulationen wurden berichtet 2 und systematische Vergleiche von Strategien, um High-Content-Daten zusammenzufassen über eine große Anzahl von Parametern berichtet worden 3. High-Content-Analyse von Bilddaten haben den Einsatz in Zellstudien von Medikamenten-Reaktion gefunden, reverse Genetik und Umweltbelastung Signal 4-6. Das Verdienst des Hochinhaltsanalyse beruht auf der Tatsache, dass algorithmische Analyse von Fluoreszenzmikroskopie Daten erlaubt die quantitative und räumliche Parameter gleichzeitig in einzelnen Zellen 7 betrachtet werden. Auf diese Weise können Zellergebnisse für mehrere Assays mit Querverweisen, Differentialverhalten Assay-d sein,efined Zell-Subpopulationen innerhalb Versuchsbedingungen und Assays verfolgt werden können Berücksichtigung der morphologischen Variablen umfassen. Die Strategien und Analyseablauf hier diskutiert, wie für die anderen High-Content-Ansätze sind in der Lage Liefern gemultiplexter Daten, die sich auf einzelne Zellen mit Querverweisen. High-Content-Methoden Anzug Studien, die Fluoreszenz-Mikroskop Bilder zu erzeugen und sind bis in die Tausende von Bildern für die Analyse von Daten, die von Zehn Bilder in geringem Durchsatz herkömmlicher Fluoreszenzbasis Mikroskopie erzeugt mit automatisierten High-Content-Screening-Plattformen produziert. Der Workflow wird hier mit Beispieldaten aus dem separaten Assays werden in Bezug auf die beiden Kernfluoreszenzmarker Intensitäten oder nuklearen / cytoplasmatischen Translokation eines fluoreszierenden Reporterproteins, gemessen dargestellt. Der Arbeitsablauf ist flexibel, da diese Tests können einzeln oder in Kombination betrachtet, je nach eac werdenh Fragestellung gegeben von verschiedenen Forschern. Die Beispieldaten sind als Teil einer RNA-Interferenz (RNAi) Experiment (1) hergestellt. Kleine interferierende RNA-Oligonukleotide (siRNA) werden verwendet, um bestimmte Proteine ​​in HCT116 menschlichen colorektalen Karzinomzellen, die in Änderungen für zwei fluoreszierenden Reportern von Cyclin-abhängigen Kinase (CDK) Aktivität führen Knockdown. Die CDK6-abhängige Phosphorylierung des Kern Retinoblastomprotein an Serin 780 (P-S780 RB1) durch Antikörper-Färbung beurteilt. In den gleichen Zellen wird ein grün fluoreszierendes Protein-markierten Reporter von CDK2 Aktivität (GFP-Reporter CDK2) durch sein Atom zu Plasma-Relation, wo in der Abwesenheit von CDK2 Aktivität der Reporter befindet sich im Kern und auf CDK2 Aktivierung Shuttles in das Zytoplasma beurteilt 8. Zusätzlich wird die Kern-DNA von jeder Zelle mit einem DNA-interkalierenden Farbstoff gefärbt, Bisbenzimid, die als Mittel, um Zellen in den Bildern zu erkennen und definieren Kerne Grenzen dient sowie einesa Maß der DNA Fluss die Informationen auf die Zellzyklusposition der Zelle (2). Die Aktivitäten der CDK6 und CDK2 sind als Zellen Transit von G1 nach S-Phase des Zellzyklus 5 nachweisbar und folgen einander 9,10 und als solche Übereinstimmung zwischen den beiden Reportern in einzelnen Zellen zu erwarten ist. Die Demonstration Datensatz verwendet hier analysiert als ein Beispiel die Wirkung von siRNA zielt CDK6 Retinoblastomprotein (RB1) und eine nicht-Ziel negative Kontrolle (Tabelle 1). Knockdown CDK6 sollte sowohl eine Abnahme des P-S780 RB1-Epitop und eine Ansammlung von Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus auszulösen. Das RB1 Zuschlags dient als Reagenz, um die Spezifität des Phospho-S780-Antikörper. Fluoreszenzmikroskopische Bilder von Formalin fixiert 11, fluoreszierend gefärbt HCT116 Gewebekulturzellen für das algorithmische Bildanalyse verwendet. Die resultierenden Zahlendaten werden dann verwendet,Querverweis die Reporter und messen die Auswirkungen der verschiedenen Zuschlags Staaten. Das Potential Größe der durch diese Art der Analyse gewonnenen Daten können eine Herausforderung zur normalen Analysewerkzeuge darstellen. Zum Beispiel können die einzelnen Zellendaten größer als einige Tabellenkalkulationssoftware aufzunehmen. Enthalten sind Perl-Skripte, die eine einfache, hoch repetitiv, überwacht die Verarbeitung der Daten durchzuführen, um Analyse grosser Datenmengen zu unterstützen. Die Perl-Skripte sind speziell für die von Cell Profiler, bei der Verarbeitung von Bilddateien mit einem bestimmten Dateinamenskonvention (Abbildung 3) erzeugten Ausgabedateien geschrieben und erlauben eine variable Anzahl von Feldern pro Vertiefung in die Analyse verwendet werden. Es ist zu Gate einzelnen Zellassay Daten häufig wichtig, Trends in Zellsubpopulationen 5 verfolgen und hier dargestellt, ist die Verwendung eines Perl-Skript flag jede Zelle basierend auf einem Satz Gate für jeden Test-Typ vorgegeben ist. Ebenfalls enthalten sind optionale Perl-Skriptenwelche eine Zusammenfassung der Daten Ergebnis für einzelne Vertiefungen (oder Bedingungen) liefert: Prozentsatz von Zellen innerhalb der eingestellten Gate und die Mittelwerte der Ausgangstestergebnisse. Letztere, homogener Art der Betrachtung der Daten ist gültig, wenn Antworten wirken sich auf alle oder die Mehrzahl der Zellen in einem gut. Wie oben erläutert, ist eine solche Beurteilung weniger nützlich, als die von den einzelnen Zelldaten Gating wo Reaktion auf eine Untergruppe von Zellen innerhalb einer Population beschränken lieferte. Die Nützlichkeit der beschriebenen Arbeitsablauf wird durch siRNA oder die beschriebenen Marker-Assays nicht auf Störung begrenzt. Studien haben diesen Ansatz verwendet, um Reaktionen in der Gewebekultur-Experimente mit Kombinationen von siRNA, chemische Inhibitoren und Strahlenbehandlung und für die Beurteilung der Ausnahme CDK6 Marker und CDK2 Aktivität 5 zu untersuchen. Konzeptionell kann die experimentelle Strategie eine Vielzahl von biologisch nützliche subzellulären Regionen automatisch registriert werdenin der Fluoreszenzmikroskopbilder vorhanden einzelnen Zellen. Auf diese Weise kann dieser Ansatz quantitative Multiplex Daten, aus denen biologische Informationen, die durch Techniken, die auf die Bevölkerung und nicht einzelne Zellen konzentrieren entgehen lassen kann ergeben. Mit geringfügigen Änderungen kann die Vorgehensweise und Analyse-Workflow beschrieben quantitative, einzelne Zelldaten für alle fluoreszenzbasierte Assay-Ausgänge und zellbiologischen Reaktionen, ergeben, wo quantitative Bewertung der DNA-Gehalt, Quantifizierung von Kern- oder Zytoplasma-Fluoreszenz oder das Pendeln von Markierungen zwischen diesen zwei Fächern entweder einzeln oder in einer Multiplexweise von Interesse ist. Als Publishing-Anforderungen sind in der Regel stärker auf die Einreichung der offen zugänglichen Rohdaten, den Zugang zu und die Vertrautheit mit kostenlosen Tools zur Bildmikroskopische Analyse, wie sie hier beschrieben wird, auch von unmittelbarem Interesse sein, Labore uns auf veröffentlichten Daten erneut analysieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="604">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AllStars negative control siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1027280</td>
			<td style="width:167px;">Negative control siRNA.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CDK6 siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Dharmacon/ Custom synthesis</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Antisense sequence: 5&#39; CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">RB1 siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Dharmacon/ Custom synthesis</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Antisense sequence: 5&#39; GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">5x siRNA buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Scientific</td>
			<td>B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:167px;">To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nulcease-free water (non-DEPC)</td>
			<td style="width:103px;">Applied Biosystems</td>
			<td>AM9937</td>
			<td style="width:167px;">For dilution of siRNA buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hiperfect</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right">301705</td>
			<td style="width:167px;">Transfection lipid.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">41966052</td>
			<td style="width:167px;">Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">96 well tissue culture plate</td>
			<td style="width:103px;">Falcon</td>
			<td align="right">3072</td>
			<td style="width:167px;">Plain, 96-well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes.</td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">Packard Viewplate</td>
			<td style="width:103px;">Perkin Elmer LAS</td>
			<td align="right">6005182</td>
			<td style="width:167px;">96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Breathable membrane</td>
			<td style="width:103px;">Alpha Labs</td>
			<td style="width:119px;">LW2783</td>
			<td style="width:167px;">Sterile, gas-permeable, adhesive membrane.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT5012-1CS</td>
			<td style="width:167px;">10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100PC</td>
			<td>Non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;">Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2287</td>
			<td style="width:167px;">For plate wash solution.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-P-S780 RB1 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Abcam</td>
			<td>ab32513</td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AlexaFluor647 Anti-rabbit</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td>A21245</td>
			<td style="width:167px;">Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hoechst 33342 (Bisbenzimide)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Plate wash solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Tris-buffered saline containing 0.1 % Tween-20.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Block solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Profiler 2.1</td>
			<td style="width:103px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Active Perl Community Edition</td>
			<td style="width:103px;">ActiveState</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">R programming environment</td>
			<td style="width:103px;">The R Foundation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.r-project.org</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rstudio</td>
			<td style="width:103px;">Rstudio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

workflow for high-content, individual cell quantification of fluorescent markers from universal microscope data, supported by open source software

Fortschritte im Verständnis der Kontrollmechanismen, die das Verhalten von Zellen in adhärenten Säugetierzellkultur-Modelle werden zunehmend abhängig von Arten der Einzelzellanalyse. Methoden, die zusammengesetzten Daten, die die mittleren Werte der Biomarker von Zellpopulationen liefern riskieren Subpopulation Dynamik, die die Heterogenität der untersuchten biologischen System zu reflektieren. In diesem Sinne werden die traditionellen Ansätze ersetzt, oder, komplexere Formen der zellulären Assay basiert auf der Beurteilung durch High-Content-Mikroskopie erlauben unterstützt. Diese Assays potenziell für eine große Anzahl von Bildern von fluoreszierenden Biomarkern, die von proprietären Softwarepakete begleitenden aktiviert, ermöglicht die Mehrparametermessungen pro Zelle. Jedoch haben die relativ hohe Kapitalkosten und overspecialization vieler dieser Vorrichtungen ihrer Zugänglichkeit für viele Forscher verhindert. Beschrieben wird hier einuniversell einsetzbare Arbeitsablauf für die Quantifizierung von multiplen Fluoreszenzmarker Intensitäten von spezifischen subzellulären Regionen einzelner Zellen, die zur Verwendung mit Bildern von den meisten Fluoreszenzmikroskope. Der Schlüssel zu diesem Workflow ist die Umsetzung des frei verfügbaren Zell Profiler Software ein, um einzelne Zellen in diesen Bildern, Segment sie in definierten subzellulären Regionen unterscheiden und liefern Fluoreszenzmarker Intensitätswerte spezifisch für diesen Regionen. Die Extraktion einzelner Zellintensitätswerte von Bilddaten ist das zentrale Ziel dieser Arbeitsablauf und wird mit der Analyse der Steuerdaten von einer siRNA-Bildschirm für G1-Checkpoint Regulatoren in adhärenten menschlichen Zellen veranschaulicht. Jedoch kann der Workflow hier dargestellt, um die Analyse von Daten von anderen mittels Zellstörung angewendet werden (beispielsweise Verbindung Bildschirmen) und andere Formen der Fluoreszenz zelluläre Marker und sollten somit für einen weiten Bereich von Labors.

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Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Workflow für Hoch Inhalt, einzelne Zell Quantifizierung der Fluoreszenzmarker von Universal Mikroskop Daten, Unterstützung von Open Source Software

Dargestellt ist eine flexible Informatik Workflow ermöglicht Multiplex bildbasierte Analyse fluoreszenzmarkierten Zellen. Der Workflow quantifiziert nukleäre und zytoplasmatische Marker und berechnet Marker Translokation zwischen diesen Fächern. Verfahren für Störung von Zellen mit siRNA und zuverlässige Methode zur Markerdetektion durch indirekte Immunfluoreszenz in 96-Well-Formaten zur Verfügung gestellt.

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Research

JoVE Journal

Biology

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