Name: workflow for high-content, individual cell quantification of fluorescent markers from universal microscope data, supported by open source software
Uploaded: 2014-12-16T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd CRUK 15043 og CRUK 14251. Vi takker Daniel Wetterskog og Ka Kei Ho for teknisk assistanse og kritisk lesing av manuskriptet.

1. Experimental forstyrrelse og Cell Merking for Response Markers (Reverse Transfection siRNA Screen) <ol><li> I et sterilt vevskultur hette pipette 70 ul av 200 nM siRNA i 1x siRNA-buffer i brønner i en steril, ren 96-brønners plate. Fortynn transfeksjon lipid i 40 volumdeler serumfritt DMEM medier og dispenser 105 ul i hver brønn inneholdende siRNA. MERK: Fortynning 262,5 ul lipid inn i 10,5 ml serumfritt DMEM gir en masterblanding egnet for en hel plate med 96 brønner over siRNA, og leverer 2.6 ul lipid per brønn. Bruk av 200 nM siRNA startkonsentrasjon på dette trinnet vil levere en fungerende konsentrasjon på 20 nM i trinn 1.3, men prosedyrer vil arbeide for å arbeide konsentrasjoner ned til 5 nM, med start konsentrasjon justert (dvs. 50 nM). Lavere arbeidskonsentrasjon kan redusere off-target falske positive score, selv om de kan redusere omfanget av on-target respons, fører til økning av on-TARGEt falske negative priser. </li><li> Bland platen ved forsiktig vibrering i ti minutter ved romtemperatur. Under dele de resulterende 175 ul i tre 50 mL replikater per mål på en ugjennomsiktig, vevskultur behandlede, 96-brønners plate med en gjennomsiktig base. </li><li> Omvendt transfeksjon ved dispensering av 8000 celler per brønn i 150 ul DMEM inneholdende 10% serum direkte på 50 ul lipid-siRNA komplekser. Bruk HCT116 menneskelige kolorektal celler som stabilt uttrykker en GFP-merket markør rapportering CDK2 aktivitet 5,8. Ingen ytterligere blanding er nødvendig. Forsegl plate med en steril, klebende pustende membran for å kontrollere fuktighet og hindre plate &#39;kanteffekter&#39; og plassere platen i en fuktet inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 i 48 timer. </li><li> Aspireres media, slik at en liten restmengde av mediet forblir i brønnene. Fikser cellene ved tilsetning av 100 pl av 4% bufret formaldehyd til hver brønn og inkuberes i et avtrekksskap i 10 minutter ved værelses temperature. </li><li> Fjern fikseringsoppløsningen ved aspirering av platen. På dette tidspunkt enten stoppe eksperimentet ved å vaske platen tre ganger med 100 ul fosfatbufret saltvann (PBS), og deretter lagre forseglet under 100 ul PBS i mørke ved 4 ° C i opptil en uke eller fortsette med permeabilization av cellene. MERK: Vi anbefaler behandling plater så snart som mulig etter fiksering, og generelt foretrekker lagring av ferdigbehandlede plater. Biocide konserveringsmidler slik som thimerosal, natrium-azid eller kommersielle alternativer kan tilsettes for å hindre micoroganismal vekst. Tilsetning av fosfatase-inhibitorer bidrar til å bevare fosfo-epitoper, og andre midler for å bevare proteinmodifikasjons tilstander kan være nyttig i analysen relevante sammenhenger </li><li> Fjern PBS fra platen og permeabilisere cellene ved tilsetning av 100 ul av permeabilization løsning. Inkuber i 10 minutter ved værelsetemperatur uten rysting. Aspirer permeabilization løsning ved hjelp av en MultiCHAnnel pipette. Gjenta dette trinnet tre ganger. </li><li> Blokkere cellene ved tilsetning av 100 ul per brønn blokk løsning i 30 minutter ved romtemperatur. Fjern blokken løsning ved aspirering av plate, deretter probe med 50 ul av anti-P S780 RB1 antistoff fortynnet 500-fold i blokken løsningen i 2 timer i mørke ved romtemperatur. </li><li> Platen vaskes tre ganger med 100 ul vaskeløsning plate, slik at oppløsningen på platen i 5 minutter hver gang. Probe platen over natten i mørke ved 4 ° C med 50 ul fluorescensmerket-merket sekundært antistoff fortynnet 1000 ganger i blokk oppløsning supplert med 2 uM av kromatin-spesifikke DNA-fargestoff Bisbenzimide. Platen vaskes tre ganger som tidligere, og lagre forseglet under 100 ul PBS i mørke ved 4 ° C. Image plate i løpet av to uker. </li></ol> 2. Imaging and Image Segmentering <ol><li> Bruk en confocal eller spinner-disk fluorescens mikroskop med en 20X objektiv til å ta egen 16-bit, gråskala TIFF-bilder i tre kanaler som tilsvarer DNA fargestoff, GFP og immunofarging fluorophores. Fange mange ikke-overlappende bildesett, referert til her som rammer, å avbilde ca. 1000-2000 celler per brønn. </li><li> Navngi bildefilene systematisk slik at hver fil navn er en unik kombinasjon av &quot;eksperiment navn &#39;,&#39; vel adresse &#39;,&#39; rammenummer&quot; og &quot;kanalidentifikator &#39;, i denne rekkefølgen (figur 3). Den eksempel datasettet bruker &quot;Blue&quot; (kromatin DNA flekker) eller &quot;grønt&quot; (GFP) eller &quot;Red&quot; (den immun-farget fluorophore) som kanalidentifikatorer. Brønnen adresse, bildenummer og kanalidentifikator er videre betegnet som bilde metadata. Bruk understrekings symbolet for å unngå forvirrende godt og ramme metadata. </li><li> Navngi filer med disse metadataelementer i den angitte rekkefølgen. Dette er nødvendig for å sikre at de etterfølgende trinn i programvaren Correctly gruppe sett med bilder for analyse. </li><li> Last ned og installer freeware Cell Profiler, Aktiv Perl Community Edition, R statistisk programmeringsmiljø og RStudio. Godta alle standardvalgene under installasjon; PC-brukere å installere Active Perl bør sette alle alternativene knyttet til PATH, filtype foreningen og script kartlegging der du blir bedt om. Aktiv Perl er valgfritt for Mac-brukere, men de ellers vil måtte kjøre Perl-skript i trinn 3.2 fra Terminal kommandolinjen fremfor å bruke ikonet klikke. </li><li> Åpne Cell Profiler programvare, klikk &quot;Fil&quot;, &quot;Import Pipeline&quot; og deretter &quot;Fra fil&quot; og velg filen 3_channels_pipeline.cppipe (Tall S1A &amp; S1B). Filen inneholder instruksjoner som er nødvendige for programvaren å tolke bildefil metadata fra filnavnet konvensjonen beskrevet. Celle Profiler relaterer nå bildene, trekker kjerne-DNA og antistoff intensiteter fra these og bruker GFP kanal for å beregne forholdet mellom atom versus cytoplasma intensiteten for hver celle registreres (figurene 4 og 5). </li><li> Klikk på knappen &quot;Vis utgang innstillinger &#39;i nedre venstre hjørne av Cell Profiler vinduet. På toppen av den nye skjermen er tekstbokser merket &quot;Standard Input Folder&quot; og &quot;Standard Output Folder&quot;. En av gangen, klikker du på mappe-ikonene til høyre for disse boksene og velge plasseringen av bildefiler for analyse og målet for datautdragene, henholdsvis (Figur S1C). </li><li> Begynn bildeanalyse ved å trykke på &#39;analysere bilder &quot;-knappen i nedre venstre hjørne av Cell Profil. På bunnen av skjermen observere gjenværende tid for datauttrekk, den &quot;Stopp Analysis&quot; og &quot;Pause&quot; knappene. Om nødvendig stanse analyse ved å velge &quot;Pause&quot; -knappen når som helst, noe som er nyttignår du ser på bildene som blir analysert (beskrevet i trinn 2.8). </li><li> Eventuelt åpne vinduene for noen av bildeanalyse trinnene ved å klikke på øye-ikonene i panelet på ytterste venstre i programvinduet (figur S1D). Observere &#39;IdentifyPrimaryObjects&#39; vinduet og de ​​som for &#39;Sekundære &quot;og&quot; tertiær Objects for å sjekke at de gjeldende innstillingene i Cell Profiler for å utføre bildesegmentering er egnet (se figur 1 og diskusjon om råd om å endre disse innstillingene). </li><li> Klikk &quot;Ok&quot; i meldingsboksen som vises når analysen er ferdig. Gå til plasseringen &#39;Standard Output Folder &quot;der alle datafiler med resultatene lagres som kommaseparert-verdi (CSV) filer (Figur S2A). </li></ol> 3. data Extraction <ol><li> Finn den nye filen &#39;Nuclei.csv&#39;, som er inkludert blant deutgang fra Cell Profil. Denne filen inneholder enkelte celledata for fluorescerende atom antistoff intensitet, nukleært DNA intensitet og GFP-CDK2 reporter ratio verdier (figur 6A &amp; S2A). MERK: Ulike laboratorier vil ønske å behandle denne type data som passer til innholdet i sine egne analyser. Foreslått for den nåværende data er gating av cellene fra hver behandling tilstand i henhold til antistoff data og GFP-CDK2 reporter verdier ved hjelp av den medfølgende Perl script &#39;2_gate_classifier.pl&#39;. </li><li> Kopier gitt Perl script file &#39;2_gate_classifier.pl&#39; i den samme mappen som &quot;Nuclei.csv &#39;datafil (figur S2A). Dobbeltklikk på ikonet for Perl-skript, og når du blir bedt om, skriver hele navnet på datafilen etterfulgt av en &quot;.csv&quot; filnavn navn på filen der cellene skal gated og til slutt gate verdier for antistofffluorescens og GFP-CDK2 reporter data. MERK: Slik hovedsak bestemme gate innstillinger og bruke disse for analyse av data er omtalt nedenfor i representative data delen og Figur 6 (for å analysere dataene gitt bruk &#39;0.004 &quot;og&quot; 1.5 &quot;, henholdsvis). Mac-brukere bør kjøre Perl-skript fra Terminal kommandolinjen ved å skrive: &quot;perl 2_gate_classifier.pl &#39;. </li><li> Observere den nyopprettede filen som kombinerer rå individuelle celle analyseverdier fra den opprinnelige cellen Profiler data med etiketter sub-befolkningen som viser hvordan hver enkelt celle fra hver brønn utfører mot begge porter (figur 6C). </li><li> Plotte dataene for hver eksperimentell tilstand ved hjelp av de enkelte celle subpopulasjon etiketter ved å åpne RStudio programvare. Klikk &quot;Fil&quot; og &quot;Åpne fil&quot;, velg deretter tilgjengelig &#39;analysis.r&#39; fil. Observere kommandoene å plotte figur 6B, <strong&gt; 7 og 8 i øvre venstre vinduet i RStudio (figur S2B). I det øvre venstre vindu, mellom de doble sitat symboler på linjene 5 og 6, skriver datamaskinen adressen til mappen som inneholder gated data. Inkluder stasjonsbokstaven og navnet på selve filen, henholdsvis (for eksempel &quot;C: / analyse mappe / analyse output&quot; og &quot;nuclei_gated.csv&quot;). MERK: Hvis RStudio brukes for første gang på en gitt datamaskin, vil R-grafikk pakke &#39;ggplot2&#39; må installeres først. Dette er en gang bare skritt for en ny installasjon av RStudio, etter som dette trinnet blir overflødig. Å installere &#39;ggplot2&#39;, klikk på fanen som heter &quot;Pakker&quot; over vinduet i nedre høyre hjørne av RStudio, klikker du installere pakker &#39;knappen som vises under dette. Et nytt vindu vil vises. Skriv &#39;ggplot2&#39; (utelater sitater) inn i &quot;pakker&quot; sTempoet i denne nye vindu og til slutt klikker du på &quot;Installer&quot; knappen for å lukke vinduet, installere de nødvendige ggplot2 funksjoner og gå tilbake til hoved RStudio vinduet for å fortsette fra trinn 3.6. </li><li> Uthev linje 1 til og med 17 i øvre venstre vinduet i RStudio, klikk deretter &quot;Kjør&quot; -knappen. Dette vil gå inn eksperimentelle data, terskelverdier og godt sted detaljer i R (Figur S2C). R vil nå midlertidig ha de relevante data for plotting. </li><li> Heve enkeltblokker av de resterende kode under linje 17 og skape de tilsvarende tomter ved å klikke på &quot;Kjør&quot; knappen som før. Observere tomter i vinduet nederst i høyre hjørne av RStudio og lagre rekke formater ved å klikke på &quot;Export&quot; -knappen (figur S2D). </li><li> Under lukking RStudio, klikk &quot;Ikke Lagre&quot; når du blir bedt om. Dette hindrer forvirring på neste bruk av RStudio, som ellers vil holde datafra forrige sesjon. </li></ol>

<ol>
	<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Khan, A., Eldaly, H., Rajpoot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-gaussian+mixture+model+for+detection+of+mitotic+cells+in+breast+cancer+histopathology+images.">A gamma-gaussian mixture model for detection of mitotic cells in breast cancer histopathology images.</a> J Pathol Inform. 4, 11 (2013).</li><li>Selzer, P., Beibel, M., Gubler, H., Parker, C. N., Gabriel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multivariate+data+analysis+strategies+for+high-content+screening.">Comparison of multivariate data analysis strategies for high-content screening.</a> J Biomol Screen. 16 (3), 338-347 (2011).</li><li>Lyman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content,+high-throughput+analysis+of+cell+cycle+perturbations+induced+by+the+HSP90+inhibitor+XL888.">High content, high-throughput analysis of cell cycle perturbations induced by the HSP90 inhibitor XL888.</a> PLoS One. 6 (3), e17692 (2011).</li><li>Richardson, E., Stockwell, S. R., Li, H., Aherne, W., Cuomo, M. E., Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+screen+establishes+signalling+framework+for+DNA+damage-associated+G1+checkpoint+response.">Mechanism-based screen establishes signalling framework for DNA damage-associated G1 checkpoint response.</a> PLoS One. 7 (2), e17692 (2012).</li><li>Heynen-Genel, S., Pache, L., Chanda, S. K., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+and+high-content+screening+for+target+discovery+and+deconvolution.">Functional genomic and high-content screening for target discovery and deconvolution.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (10), 955-968 (2012).</li><li>Krausz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+siRNA+screening.">High-content siRNA screening.</a> Mol Biosyst. 3 (4), 232-240 (2007).</li><li>Gu, J., Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Cycle-dependent+Regulation+of+a+Human+DNA+Helicase+That+Localizes+in.">Cell Cycle-dependent Regulation of a Human DNA Helicase That Localizes in.</a> DNA Damage Foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).</li><li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pRB+phosphorylation.">Control of pRB phosphorylation.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (1), 21-27 (1998).</li><li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein--from+bench+to+bedside.">The retinoblastoma protein--from bench to bedside.</a> Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 97-107 (2005).</li><li>Nybo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+imaging+in+fixed+cells.">GFP imaging in fixed cells.</a> BioTechniques. 52 (6), 359-360 (2012).</li><li>Schwartz, R. L., Foy, B. D., Phoenix, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Learning Perl - Making Easy Things Easy and Hard Things Possible. , 1-363 (2011).</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , 978-970 (2009).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre

Arbeidsflyten beskrevet utgjør en prosedyre for flere brønner perturbance av celler ved hjelp av siRNA, da etterfølgende deteksjon og endelig bruk av en serie av software-støttet trinn for å lette ekstraksjon av kvantitative data fra den resulterende fluorescens mikroskopi bilder. Tilnærmingen er fokusert på leveranse av kjernefysiske og cytoplasmatiske intensitetsverdier for enkeltceller, som har bred praktisk anvendelse i mange celle-baserte applikasjoner. De eksempeldata som brukes her ble generert på et siRNA-skjermen ramme der to fluoriserende analyser for G1 fasecellesyklus transitt testes og korreleres tilbake til en mer direkte måling av biofysiske nukleært DNA-innhold. Bruken av et fluorescerende DNA-flekken til bilde nukleært DNA er en uunnværlig trinn i bildet segmenteringsprosessen som det tillater identifisering av de enkelte celler, og den resulterende &#39;Nuclei maske&#39; tjener som utgangspunkt for å identifisere tilsvarende cytoplasmic regioner. GFP-merket CDK2 reporter, som blir stabilt uttrykt i cellene, gir en variabel, men konsekvent høyere enn bakgrunnssignalet i cytoplasma etter som dette rom kan være avgrenset. Den samme analysen rørledningen skal gjelde for analyse av protein trans hendelser ved hjelp av andre egnede fluorescens-linked journalister og deres respons på perturbance. Også anvendelse av GFP-CDK2 reporter med cytoplasma-spesifikke fluorescerende fargestoffer ville tillate alternativ bruk av denne algoritme for å måle dimensjonene av cytoplasma og de relative størrelser av cellene i bildene. En annen utforming hensyn ved bilde segmentering strategi som beskrives her er bruken av celleProfil for å levere integrerte intensitetsverdier for DNA-kvantifisering. Integrering av intensiteten verdier for atom DNA flekker data tillate for mulige variasjoner i nucleus størrelse, og representerer en tett kamp for kvantifisering profiler settfor propidiumjodid farget FACS data. Imidlertid kan integrerte intensiteten ikke gir et hensiktsmessig middel for å vurdere proteinfunksjon der gjennomsnittlig konsentrasjon, eksemplifisert ved midlere intensitet av fluorescens-antigen, er mer biologisk relevant enn den integrerte totale mengden av protein (og tilhørende fluorescens) i et cellerommet. Derfor betyr intensitetsverdier ble anvendt for P-S780 RB1 og GFP-data. Muligheten for å endre mellom de to modusene (gjennomsnittlig eller integrert) av data vurderingen er funnet på &#39;ExportToSpreadsheet&#39; panel av Cell Profiler programvare. Innstillingene analyse i 3_channels_pipeline.cppipe filen er optimalisert for bildene i eksempeldatasettet. Analyse av nye bilder sett med denne protokollen vil kreve at filnavnene vedta navnekonvensjonen beskrevet ovenfor (figur 3). Også, verdier følsomhet som passer lysstyrken nukleært DNA farging og terskler for bakgrunnenintensiteter i de nye bildesettene må kanskje justeres innenfor Cell Profiler innstillinger. Gitt nøkkelrolle DNA farging holder for å bygge de ulike bildesegmenterings masker, er anvendelsen av riktige følsomhetsinnstillinger for denne kanalen nøkkelen til vellykket analyse av nye bildedata med Cell Profiler programvare. Den medfølgende Cell Profiler innstillingsfil (3_channels_pipeline.cppipe) inneholder notater på de mest nyttige parametre for å tilpasse analysen til nye data. Disse notatene er i tekstboksen øverst på skjermen i Cell Profiler i hovedvinduet og inkluderer veiledning om hvordan du endrer følsomhetsinnstillinger og justering av antall kanaler som skal analyseres. Som tiltalt i protokoll avsnitt 2.8, for å teste innstillingene for nye bildedata kan det være nødvendig å observere bildesegmentering under bildeanalyse ved å klikke åpne &#39;øye&#39; ikoner for hver av &quot;Identifiser ... Objects &#39;protokolltrinn (figur S1D </strong&gt;). Spesielt vil visualisering av bildedataene gjennom &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; vise om Nuclei masken er korrekt identifisert fra bilder av DNA farging. På Cell Profiler programvare side for de &quot;IdentifyPrimaryOjects &#39;modulen er terskelen korreksjonsfaktoren. Prøving og feiling justering av denne verdien vil løse de fleste atomgjenkjenningsfeil. Verdiene balansere DNA-kanalen på bakgrunn intensitet for hvert bilde. Terskel korreksjonsfaktorverdier hengsel rundt 1, der større enn dette er strengere (bra for klare bilder) og mindre enn 1 er mildere (egnet til bilder med mindre kontrast mellom farging og bakgrunn). Den rå produksjonen av enkelte celle data fra Cell Profiler kan analyseres i varierende måter å dekke behovene til andre studier. Vist her er bruken av et Perl skript å anvende portene til to av de målte parametrene per celle for å hjelpe til å trekke ut biologiske trender fra en datad tillatelse kryssreferanser av de identifiserte subpopulasjoner med ytterligere målinger. Selv om det er like mulig å inkludere elementer av gating innenfor rammen av Cell Profiler, den alternative ruten som brukes her gir større fleksibilitet og hastighet, spesielt hvis store datasett må vurderes. Den tregeste scenen i etter image oppkjøpet faser av gjeldende protokollen er driften av Cell Profiler programvare. Cell profiler her kjøres uten å innføre porter for å frembringe en un-gated rådatasett som kan analyseres på nytt med påfølgende Perl script raskere og, om nødvendig, iterativt med forskjellige port verdier. Ikke alle studier vil vite på forhånd egnet gate verdier som dette kan variere med reagenser på en gitt sett av data, og potensielt over tid. Det er derfor anbefalt å generere histogrammer som viser rådata distribusjon innhentet fra Cell Profiler for positive kontroller og mock-forstyrrede celler for å identifisere passende gate values for parametrene av interesse. Perl-skript er skrevet en strengt definert kolonne struktur av data fra Cell Profiler for å akseptere og kan slutte å virke hvis en bruker endrer antall parametere produksjonen av Cell Profiler hjelp av &#39;ExportToSpreadsheet&#39; innstillinger. For å gjennomføre endring av innstillingene notater er inkludert i Perl script-filer. For å se disse se manuset i en tekst editor, fortrinnsvis en programmerer tekst editor satt til fargekode Perl-elementer (f.eks http://www.activestate.com/komodo-edit). Disse notatene viser hvor du skal justere skript for å tilpasse seg endringer i dataformat. I likhet med Perl-skript, R-kode-filen som følger (analysis.r), som inneholder instruksjoner for å plotte tallene fra bildeanalyse data, kan leses i en teksteditor eller RStudio programvare for å se flere notater på bruk og tilpasning. Disse notatene kan bli supplert med informasjon om regulære uttrykk og Perl &lt;sup&gt; 12 og ggplot2 13 pakke for R, som begge danner grunnlaget for hvordan dataene er lest, kommentert og plottet, henholdsvis. Nye studier ved hjelp av fluorescens mikroskopi, så vel som rådata deponert med fri publikasjoner er mottagelig for analysemetoder, slik som de som er beskrevet her. Selve innholdet av høy innholdsdata gir seg til rekursiv analyse med ulike analytiske vektlegging avhengig av forskningsinteresser av enhver observatør. Selv om de spørsmål som kan bli stilt av data er begrenset av sondene opprinnelig brukt, bildedata kan ofte være menings reanalysert utenfor rammen av studiene som genererte dem.

Arbeidet presenteres her beskriver bruk av fritt tilgjengelig programvare Cell Profiler for å utføre algoritmen styrt nedbryting av fluorescerende mikroskopi bilder av heftende celler for å identifisere individuelle celler og definerte subcellulære regioner. Denne fremgangsmåten, betegnet som bildesegmentering, tillater den påfølgende multi-parametrisk analyse av de avbildede celler ved å kvantifisere fluorescensmerkede markører lokalisert i hver celle eller subcellulære region (betegnet som segmenterte objekter). Denne arbeidsflyten gir grunnlag for å muliggjøre høy innholdsanalyse, og er ment som et verktøy som kan videreutvikles og endres for å passe multi-parametrisk, analyserer enkelt celle i laboratorier uten tilgang til spesialiserte høyt innhold instrumenter eller proprietær programvare. Filene som følger med dette manuskriptet er blant annet et testsett med relevante rå bildedata, algoritme innstillinger og støtter skript for å generere analysen beskrevet. Den gitt algoritme innstillinger feller Cell Profiler er optimalisert for eksempel datasettet og diskusjon avsnitt detaljer hvilke justeringer kan være nødvendig for å muliggjøre bruk av bildedata fra andre studier. Når kvantitative data er hentet ved hjelp av Cell Profiler, kan forskjellige laboratorier har ulike krav til hvordan du kan bruke den informasjonen som presenteres av de enkelte celleverdier i rådata; vist her er en metode ved hvilke porter er påført på de rå data for hver analyse. Ved hjelp av disse portene, er dataene forvandlet til binære form av respons, slik visualisering av trender knytte ulike behandlinger med subpopulasjoner av celler som gjennomgår respons definert av portene. Portene er satt basert på observasjoner av datafordelinger innhentet for aktuelle negative og positive kontroller for hver relevant måling. Bruken av portene er bare ett eksempel på hvordan man skal håndtere den rå, cellebaserte målinger. Også vist her er bruk av kjernefysisk DNA intensitet megasurements i sin rå form som en sammenhengende rekke verdier i kombinasjon med gated data. Andre måter å håndtere bildeanalysedata bør vurderes, avhengig av naturen av studien; statistiske alternativ til å bruke portene for å tildele celler til subpopulasjoner er rapportert to og systematiske sammenligninger av strategier for å oppsummere høy innholdsdata på tvers av et stort antall parametere har blitt rapportert tre. Høy innholds analyser av bildedata har funnet bruk i mobilnettet studier av narkotika-respons, reverse genetikk og miljømessige stress signaliserer 4-6. Fortjeneste av høy innholdsanalyse stammer fra det faktum at algoritmiske analyse av fluorescensmikroskopi data tillater kvantitative og romlige parametre som skal behandles samtidig på tvers av individuelle celler 7. På denne måten kan cellulære utfall for flere analyser bli sammen, differensial oppførsel av assay-defined celle subpopulasjoner kan spores innen eksperimentelle forhold og analyser kan omfatte vurdering av morfologiske variablene. Den strategier og analyser arbeidsflyt diskutert her, som for andre high-innhold tilnærminger, er i stand til å levere multiplekserte data som er kryss-referert til individuelle celler. Høy innhold metoder dress studier som genererer fluorescerende mikroskop bilder og gjelder for analyse av data som spenner fra titalls bilder produsert i lav gjennomstrømning konvensjonell fluorescens-basert mikros gjennom til de tusenvis av bilder produsert ved hjelp av automatiserte høyt innhold screening plattformer. Arbeidsflyten er illustrert her med eksempeldata som separate analyser måles i form av enten atom fluorescerende markør intensiteter eller kjernefysiske / cytoplasma translokasjon av et fluorescerende reporter protein, henholdsvis. Arbeidsflyten er fleksibel ved at disse analysene kan betraktes hver for seg eller i kombinasjon, avhengig av each gitt problemstilling ved forskjellige etterforskere. Eksempeldataene er produsert som en del av et RNA-interferens (RNAi) eksperiment (figur 1). Små interfererende RNA-oligonukleotider (siRNA) blir brukt til å knockdown spesifikke proteiner i HCT116 humane kolorektale carcinom-celler som resulterer i endringer for to lysrør reportere av cyklin-avhengig kinase (CDK) aktivitet. Den CDK6-avhengig fosforylering av atom retinoblastom protein ved serin 780 (P-S780 RB1) bestemmes ved antistoff-farging. I de samme celler, blir et grønt fluorescerende protein-merkede rapportør av CDK2-aktivitet (GFP-CDK2 reporter) bedømt ved dets atom til cytoplasma-forhold der i fravær av CDK2-aktivitet reporteren befinner seg i kjernen og ved CDK2 aktiveringstransport inn i cytoplasma 8. I tillegg er DNA hos hver celle farget ved anvendelse av en DNA-interkalerende fargestoff, Bisbenzimide, som tjener som et middel for å identifisere celler og definerer grenser kjerner i bildene så vel enSA mål på DNA overflod gir informasjon om cellesyklusen stilling av cellen (figur 2). Virksomheten til CDK6 og CDK2 kan påvises som celler transitt fra G1 til S-fasen av cellesyklusen 5 og lykkes hverandre 9,10, og som sådan, er nært samsvar mellom de to journalistene i enkeltceller forventet. Demonstrasjonen datasettet anvendes her analyser som et eksempel på virkningen av siRNA rettet CDK6, retinoblastom protein (RB1) og en ikke-måls negativ kontroll (tabell 1). Knockdown av CDK6 vil avstedkomme både en nedsettelse av P-S780 RB1 epitop og en akkumulering av celler i G1-fasen av cellesyklusen. Den RB1 knockdown tjener som et reagens kontroll for spesifisiteten av fosfo-S780 antistoff. Fluorescens mikroskopbilder fra formalinfiksert 11, fluorescensmerket farget HCT116 vevkulturceller brukes for algoritmisk bildeanalyse. Den resulterende numeriske data blir så brukt til åkryssreferanse journalistene og måle effekten av de ulike knockdown stater. Den potensielle størrelsen på dataene som produseres av denne typen analyse kan være en utfordring til normale analyseverktøy. For eksempel kan de individuelle celledata være større enn noen regnearkprogrammer skal romme. Inkludert er Perl-skript som utfører enkle, svært repeterende, veiledet behandling av data for å hjelpe analyse av store datasett. Perl-skript er skrevet spesielt for utdatafiler produsert av Cell Profiler, ved behandling av bildefiler med en bestemt fil navnekonvensjon (figur 3), og gir mulighet for variable antall felt per brønn som skal brukes i analysen. Det er ofte viktig å port individuelle celleanalysedata til å spore trender i celle subpopulasjoner 5 og vist her er bruken av et Perl skript for å flagge hver celle på grunnlag av et sett portforutbestemt for hver analysetype. Det finnes også tilleggs Perl-skriptsom oppsummerer data resultat for de enkelte brønner (eller forhold), og leverer: prosentandel av celler i løpet av den innstilte porten og middelverdiene av de rå analyse score. Den sistnevnte, mer homogen måte å vise de data er gyldig der responser påvirker alle eller de fleste av cellene i en brønn. Som diskutert ovenfor, er mindre anvendelige enn det som gis av den enkelte celle data gating der responsen er begrenset til en undergruppe av celler i en populasjon som for vurdering. Anvendeligheten av den beskrevne arbeids er ikke begrenset til perturbasjon av siRNA eller markør analysene beskrevet. Studier har brukt denne tilnærmingen til analysen responser i vevskulturstudier eksperimenter med kombinasjoner av siRNA, kjemiske hemmere og strålebehandling, og for vurdering av andre enn CDK6 markører og CDK2 aktivitet fem. Konseptuelt kan det eksperimentelle strategi en rekke biologisk nyttige subcellulære regioner som skal registreres automatiski individuelle celler i fluorescerende mikroskop bilder. Som sådan, kan denne tilnærmingen gi kvantitative, multiplekserte data avslørende biologisk informasjon som kan være savnet gjennom teknikker som fokuserer på bestander i stedet for individuelle celler. Med mindre endringer, kan tilnærming og analyse arbeidsflyt beskrevet gi kvantitative, enkelte celle data for eventuelle fluorescens-basert analyse utganger og cellebiologiske reaksjoner, der kvantitativ vurdering av DNA-innhold, kvantifisering av kjernefysisk eller cytoplasma fluorescens eller skyt av markører mellom disse to avdelinger, enten individuelt eller i en multiplekset måte, er av interesse. Som publisering krav økende tendens mot innlevering av åpent tilgjengelig rådata, tilgang til og fortrolighet med gratis verktøy for mikroskopi bildeanalyse slik som de som er beskrevet her vil også være av direkte interesse for laboratorier som ønsker å Analyser på nytt publiserte data.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="604">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AllStars negative control siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1027280</td>
			<td style="width:167px;">Negative control siRNA.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CDK6 siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Dharmacon/ Custom synthesis</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Antisense sequence: 5&#39; CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">RB1 siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Dharmacon/ Custom synthesis</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Antisense sequence: 5&#39; GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">5x siRNA buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Scientific</td>
			<td>B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:167px;">To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nulcease-free water (non-DEPC)</td>
			<td style="width:103px;">Applied Biosystems</td>
			<td>AM9937</td>
			<td style="width:167px;">For dilution of siRNA buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hiperfect</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right">301705</td>
			<td style="width:167px;">Transfection lipid.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">41966052</td>
			<td style="width:167px;">Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">96 well tissue culture plate</td>
			<td style="width:103px;">Falcon</td>
			<td align="right">3072</td>
			<td style="width:167px;">Plain, 96-well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes.</td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">Packard Viewplate</td>
			<td style="width:103px;">Perkin Elmer LAS</td>
			<td align="right">6005182</td>
			<td style="width:167px;">96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Breathable membrane</td>
			<td style="width:103px;">Alpha Labs</td>
			<td style="width:119px;">LW2783</td>
			<td style="width:167px;">Sterile, gas-permeable, adhesive membrane.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT5012-1CS</td>
			<td style="width:167px;">10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100PC</td>
			<td>Non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;">Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2287</td>
			<td style="width:167px;">For plate wash solution.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-P-S780 RB1 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Abcam</td>
			<td>ab32513</td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AlexaFluor647 Anti-rabbit</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td>A21245</td>
			<td style="width:167px;">Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hoechst 33342 (Bisbenzimide)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Plate wash solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Tris-buffered saline containing 0.1 % Tween-20.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Block solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Profiler 2.1</td>
			<td style="width:103px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Active Perl Community Edition</td>
			<td style="width:103px;">ActiveState</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">R programming environment</td>
			<td style="width:103px;">The R Foundation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.r-project.org</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rstudio</td>
			<td style="width:103px;">Rstudio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

workflow for high-content, individual cell quantification of fluorescent markers from universal microscope data, supported by open source software

Fremskritt i forståelsen av de kontrollmekanismer som styrer oppførselen til cellene i heftpattedyr vevskulturstudier modellene blir stadig mer avhengige av moduser av encellede analyse. Metoder som leverer kompositt data som gjenspeiler gjennomsnittsverdiene av biomarkører fra celle populasjoner risikerer å miste undergruppe dynamikk som gjenspeiler mangfoldet i studert biologiske system. I tråd med dette, er tradisjonelle tilnærminger blir erstattet av, eller støttes med, mer sofistikerte former for cellulær analyse utviklet for å tillate vurdering av høyt innhold mikroskopi. Disse analysene potensielt generere et stort antall bilder av fluorescerende biomarkører som aktiveres av medfølgende proprietære programvarepakker, åpner for multi-para målinger per celle. Imidlertid har de relativt høye kapitalkostnader og overspecialization av mange av disse enhetene forhindret deres tilgjengelighet til mange etterforskere. Beskrevet her er enuniverselt anvendbar arbeidsflyt for kvantifisering av flere fluorescerende markørintensitet fra spesifikke subcellulære regioner av enkeltceller som er egnet for bruk med bilder fra de fleste fluorescerende mikroskop. Nøkkelen til denne arbeidsflyten er gjennomføringen av fritt tilgjengelig Cell Profiler programvare en å skille enkeltceller i disse bildene, segment dem inn i definerte subcellulære regioner og levere fluorescens markør intensitet verdier spesifikt til disse regionene. Utvinningen av de enkelte celleintensitetsverdier fra bildedata er den sentrale hensikten med denne arbeidsflyten og vil bli illustrert med analyse av styredata fra en siRNA skjerm for G1 sjekkpunkt regulatorer i adherente humane celler. Imidlertid kan arbeidsflyten som presenteres her anvendes for analyse av data fra andre former for celle perturbasjon (f.eks sammensatte skjermer) og andre former for fluorescens-basert cellulære markører og dermed bør være nyttige for en rekke laboratorier.

Watch this Scientific Journal Video about Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software at JoVE.com

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Arbeidsflyt for High-innhold, Individuell Cell Kvantifisering av Fluorescent Markers fra Universal Microscope data, som støttes av Open Source Software

Presentert er en fleksibel informatikk arbeidsflyt slik at multiplex bildebasert analyse av fluorescensmerkede celler. Arbeidsflyten kvantifiserer atom og cytoplasmatiske markører og beregner markør translokasjon mellom disse rommene. Prosedyrer er gitt for forstyrrelse av celler ved hjelp av siRNA og pålitelig metode for markeringen deteksjon ved indirekte immunofluorescens i 96-brønners format.

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

En kvantitativ fitnessanalyse Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

En High-innhold Imaging arbeidsflyt for å studere Grb2 signalveier Komplekser av Expression kloning

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profilering Individuell humane embryonale stamceller ved kvantitativ RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Sporing og Kvantifisering utviklingsprosesser i<em&gt; C. elegans</em&gt; Ved hjelp av Open-source verktøy

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source Høy innholdsanalyse Utnytte Automated Fluorescence Lifetime Imaging Mikros

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Cellular Redox Profiling ved hjelp av høy innholdsmikroskopi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-partikkel Analyse for Super-oppløsning Mikroskopi med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: en åpen kilde data integrasjon verktøyet for stor data Transcriptomics designet for malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...