Name: workflow for high-content, individual cell quantification of fluorescent markers from universal microscope data, supported by open source software
Uploaded: 2014-12-16T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами CRUK 15043 и CRUK 14251. Мы благодарим Даниэль Wetterskog и Ка Kei Хо технической помощи и критическое прочтение рукописи.

<ol>
	<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Khan, A., Eldaly, H., Rajpoot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-gaussian+mixture+model+for+detection+of+mitotic+cells+in+breast+cancer+histopathology+images.">A gamma-gaussian mixture model for detection of mitotic cells in breast cancer histopathology images.</a> J Pathol Inform. 4, 11 (2013).</li><li>Selzer, P., Beibel, M., Gubler, H., Parker, C. N., Gabriel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multivariate+data+analysis+strategies+for+high-content+screening.">Comparison of multivariate data analysis strategies for high-content screening.</a> J Biomol Screen. 16 (3), 338-347 (2011).</li><li>Lyman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content,+high-throughput+analysis+of+cell+cycle+perturbations+induced+by+the+HSP90+inhibitor+XL888.">High content, high-throughput analysis of cell cycle perturbations induced by the HSP90 inhibitor XL888.</a> PLoS One. 6 (3), e17692 (2011).</li><li>Richardson, E., Stockwell, S. R., Li, H., Aherne, W., Cuomo, M. E., Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+screen+establishes+signalling+framework+for+DNA+damage-associated+G1+checkpoint+response.">Mechanism-based screen establishes signalling framework for DNA damage-associated G1 checkpoint response.</a> PLoS One. 7 (2), e17692 (2012).</li><li>Heynen-Genel, S., Pache, L., Chanda, S. K., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+and+high-content+screening+for+target+discovery+and+deconvolution.">Functional genomic and high-content screening for target discovery and deconvolution.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (10), 955-968 (2012).</li><li>Krausz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+siRNA+screening.">High-content siRNA screening.</a> Mol Biosyst. 3 (4), 232-240 (2007).</li><li>Gu, J., Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Cycle-dependent+Regulation+of+a+Human+DNA+Helicase+That+Localizes+in.">Cell Cycle-dependent Regulation of a Human DNA Helicase That Localizes in.</a> DNA Damage Foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).</li><li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pRB+phosphorylation.">Control of pRB phosphorylation.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (1), 21-27 (1998).</li><li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein--from+bench+to+bedside.">The retinoblastoma protein--from bench to bedside.</a> Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 97-107 (2005).</li><li>Nybo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+imaging+in+fixed+cells.">GFP imaging in fixed cells.</a> BioTechniques. 52 (6), 359-360 (2012).</li><li>Schwartz, R. L., Foy, B. D., Phoenix, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Learning Perl - Making Easy Things Easy and Hard Things Possible. , 1-363 (2011).</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , 978-970 (2009).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать

Рабочий процесс описывается представляет собой процедуру многоямного perturbance клеток с использованием миРНК, последующее обнаружение маркеров и, наконец, использовать в серии с программным шагов для облегчения извлечения количественных данных из полученного флуоресцентной микроскопии изображений. Подход ориентирован на доставку ценностей ядерных и цитоплазматических интенсивности отдельных клеток, который имеет широкое практическое применение во многих приложениях на основе клеток. Примерные данные, используемые здесь был создан в установки экрана миРНК в котором два флуоресцентные анализы для транзита клеточного цикла G1 фазы прошли проверку и коррелирует вернуться к более прямым биофизической меры содержания ядерной ДНК. Использование флуоресцентным красителем ДНК к фотографиям ядерной ДНК является необходимым шагом в процессе сегментации изображения, так как позволяет идентифицировать отдельные клетки и в результате &quot;Ядра маска&quot; служит отправной точкой для определения соответствующего cytoplasmiС регионы. GFP с метками CDK2 репортер, который стабильно экспрессируются в клетках, дает переменную пока последовательно выше, чем фонового сигнала в цитоплазме, с помощью которых этот отсек может быть разграничены. Же трубопровод анализ должен быть применим к анализу транслокацию белка событий, используя другие подходящие флуоресценции связаны журналистам и их реакцию на perturbance. Кроме того, подставляя GFP-CDK2 корреспондент цитоплазмы конкретных флуоресцентных красителей позволит альтернативное использование этого алгоритма для измерения размеров в цитоплазме и относительные размеры клеток в изображениях. Другой дизайн рассмотрения в сегментации стратегии изображения, описанного здесь использование сотовых Profiler для доставки комплексных значений интенсивности для количественного ДНК. Интеграция интенсивности значения для ядерной ДНК данных окрашивания позволяют возможных изменений в ядро ​​размером, и представляет собой близкое соответствие для количественного профилей виделдля пропидий йодид окрашенных FACS данных. Тем не менее, интегральная интенсивность не может обеспечить надлежащие средства для оценки функции белка, где средняя концентрация, на примере средней интенсивности флуоресценции антигена, более биологически значимым, чем интегрированного общего количества белка (и связанного с флуоресценцией) в пределах соты отсека. Поэтому средние значения интенсивности были использованы для P-S780 RB1 и данных GFP. Возможность изменять между этими двумя режимами (средний или интегрированный) оценки данных, найденных на панели &quot;ExportToSpreadsheet&quot; программного обеспечения Cell Profiler. Настройки анализа в файле 3_channels_pipeline.cppipe оптимизированы для изображений в наборе данных в следующем примере. Анализ новых изображений множеств с этим протоколом будет требовать, чтобы имена файлов принять именования описано выше (Рисунок 3). Кроме того, чувствительность значения в соответствии с яркостью окраски ядерной ДНК и порогов для фонаинтенсивности в новых наборов изображений может потребоваться корректировка в настройках сотовый Profiler. Учитывая ключевую роль окрашивание ДНК имеет место для строительства различных сегментации изображения маски, применение правильных настроек чувствительности для данного канала является ключом к успешному анализа новых данных изображения с программным обеспечением Cell Profiler. Файл настроек при условии, сотовый Profiler (3_channels_pipeline.cppipe) содержит информацию о наиболее часто полезно параметров для адаптации анализ к новым данным. Эти заметки хранятся в текстовом поле в верхней части экрана в Профили главном окне Cell и включают в себя рекомендации по изменению настроек чувствительности и корректировки количество каналов, которые будут проанализированы. Как предъявлены обвинения в Протоколе разделе 2.8, чтобы проверить настройки для новых данных изображения может быть необходимо соблюдать сегментацию во время анализа изображений, нажав открыть «глаз» иконки для каждого из «Определить ... предметов« шаги протокола (рис S1D </strong&gt;). В частности, визуализация данных изображения через «IdentifyPrimaryOjects&quot; покажет, будет ли маска Ядра правильно идентифицированы изображений окрашивания ДНК. На страницу программного обеспечения Cell Profiler для модуля &quot;IdentifyPrimaryOjects&quot; является фактором порог коррекции. Методом проб и ошибок настройки этого значения будет исправить большинство ошибок ядерных распознавания. Значения сбалансировать канал ДНК от интенсивности фона для каждого изображения. Значения коэффициента коррекции порога зависеть вокруг 1, где больше, более жесткое (хорошо для четких изображений) и менее чем 1 мягок (подходит для изображений с меньшим контрастом между окрашиванием и фона). Сырой продукции отдельных данных клеток из клеток Profiler могут быть проанализированы различными способами, чтобы удовлетворить потребности других исследований. Здесь показано использование скрипта Perl применять ворота двух измеряемых параметров на ячейку в целях содействия извлечения биологических тенденций от ап данныхРазрешение d перекрестных ссылок выявленных групп населения с дополнительными измерениями. Хотя это в равной степени можно включать элементы стробирования в рамках клеточной Profiler, альтернативный маршрут используется здесь обеспечивает большую гибкость и скорость, особенно если большие наборы данных должны быть оценены. Медленный этап в фазах после приобретения образ текущего протокола является работа программного обеспечения Cell Profiler. Сотовый профилировщик здесь выполняется без наложения ворота с получением сырого набор данных не-закрытый, которые могут быть повторно проанализированы с последующим сценария Perl более быстро и, в случае необходимости, многократно с различными значениями затвора. Не все исследования будут заранее знать подходящие значения ворота, как это может варьироваться в зависимости от реагентов на любой набор данных, и, возможно, с течением времени. Он, таким образом, рекомендуется произвести гистограммы, изображающие сырой распределение данных, полученных из клеток Profiler для положительного контроля и макет возмущенных клеток для того, чтобы определить подходящий ворота VALUES для параметров, представляющих интерес. Сценарии Perl написаны принять жестко определенную структуру столбца данных из ячейки Profiler и может прекратить работу, если пользователь изменяет количество выходных параметров по мобильному Profiler, используя настройки &quot;ExportToSpreadsheet. Чтобы помочь реализовать изменение запискам, включены в файлах Perl скрипт с настройками. Чтобы увидеть эти просмотреть скрипт в текстовом редакторе, предпочтительно текстовый редактор программиста на цвет элементов кода Perl (например, http://www.activestate.com/komodo-edit). Эти заметки показывают, где для регулировки сценарий адаптироваться к изменениям в формате данных. Как и в сценарии Perl, файл R-код, предоставленный (analysis.r), содержащая инструкции для построения фигуры из анализа данных изображения, можно прочитать в текстовом редакторе или программного обеспечения RStudio, чтобы увидеть дополнительные замечания по использованию и адаптации. Эти заметки могут быть дополнены с подробной информацией о регулярных выражений и Perl &lt;SUP&gt; 12 и ggplot2 13 пакет для R, оба из которых составляют основу для того, как данные считываются, аннотированный и построены, соответственно. Новые исследования с использованием флуоресцентной микроскопии, а также необработанные данные, размещенные в открытых исходных публикаций поддаются методов анализа, таких как те, которые описаны здесь. Сама природа данных с высоким содержанием поддается рекурсивного анализа с различных аналитических акценты в зависимости от научных интересов любого данного наблюдателя. Хотя вопросы, которые могут быть заданы из данных ограничивается датчиками первоначально использовались данные изображения, часто можно осмысленно переосмыслены выходит за рамки исследований, которые генерировали их.

Работа, представленная здесь описывается использование свободно доступного программного обеспечения Cell Profiler для выполнения алгоритма наведения разбивку флуоресцентной микроскопии изображений прикрепленных клеток для идентификации отдельных клеток и определенные субклеточные регионы. Этот подход, называемый сегментации изображения, позволяет последующее мульти-параметрический анализ отображаемого клеток путем количественной флуоресцентно меченых маркеров, локализованных в каждую ячейку или субклеточном области (именуемого сегментированных объектов). Этот рабочий процесс, является основанием для включения высоким содержанием анализ и предназначен для использования в качестве инструмента, который может быть дополнительно разработана и изменение в соответствии с многопараметрического, отдельная клетка анализов в лабораториях, не имеющих доступа к специализированным высоких содержанием документов или проприетарное программное обеспечение. Файлы, поставляемые с этой рукописи включают в себя тестового набора соответствующих данных изображений в формате RAW, параметры алгоритма и поддерживающих скрипты для создания анализа, описанного. При условии, настройки алгоритма Fили сотовый Profiler оптимизированы для примера набора данных и детали Обсуждение раздела, что может быть необходимо корректировки, чтобы разрешить использование данных изображений из других исследований. После того, как количественные данные были извлечены с помощью мобильного Profiler, различные лаборатории могут иметь разные требования для того, как использовать информацию, представленную отдельных значений ячеек в исходных данных; показанный здесь, один подход, с помощью которого ворота применяются к необработанным данным для каждого анализа. Использование этих воротах, данные преобразуются в двоичные точки зрения ответ, что позволяет визуализировать тенденций, связывающих различные процедуры с субпопуляций клеток, подвергающихся ответ, определяемый ворот. Ворота устанавливаются на основе наблюдений за распределениям данных, полученных для соответствующих положительных и отрицательных контролей для каждого соответствующего измерения. Использование ворот является лишь одним примером того, как управлять сырье, измерения на основе клеток. Кроме того, показано здесь является использование интенсивности ядерной ДНК меняasurements в сыром виде в виде непрерывного диапазона значений в сочетании с закрытых данных. Другие подходы к управлению данными анализа изображений следует учитывать, в зависимости от характера исследования; статистические альтернативы использованию ворота для назначения клетки к субпопуляции были зарегистрированы 2 и систематические сравнения стратегий для обобщения данных высокого контента в большое количество параметров были зарегистрированы 3. High-контент анализ данных изображения нашли применение в сотовых исследований лекарственной ответ обратной генетики и экологический стресс сигнализации 4 - 6. Заслуга высокопроизводительного анализа содержания связано с тем, что алгоритмическая анализ флуоресцентной микроскопии данных позволяет количественные и пространственные параметры должны быть рассмотрены одновременно на отдельных клеток 7. Таким образом, сотовые результаты многочисленных анализов могут быть перекрестные ссылки, дифференциальное поведение анализа-Defined субпопуляции клеток могут быть отслежены в экспериментальных условиях и анализы могут включать в себя рассмотрение морфологических переменных. Стратегии и анализ документооборота обсуждается здесь, как и для других подходов высокого содержания, способных доставлять мультиплексированных данных, которые имеют перекрестные ссылки на отдельные клетки. High-контент методы костюм исследования, которые генерируют флуоресцентного микроскопа изображений и применимы к анализу данных, начиная от нескольких десятков изображений, полученных в условиях низкой пропускной обычной флуоресценции на основе микроскопии до тысячи изображений, полученных с использованием автоматизированных высокие содержанием платформы скрининга. Рабочий процесс иллюстрируется здесь с примерами данных, из которых отдельные анализы измеряется в единицах либо ядерных люминесцентных интенсивности маркера или ядерной / цитоплазматической транслокации флуоресцентного репортерного белка, соответственно. Рабочий процесс является гибким в том, что эти анализы можно рассматривать отдельно или в комбинации в зависимости от ВАСч данного исследования вопрос разными исследователями. Примерные данные получены в рамках РНК-интерференция (RNAi) эксперимента (рис 1). Малых интерферирующих РНК олигонуклеотиды (миРНК) используются в нокдаун специфических белков в НСТ116 человек колоректального клеток карциномы, которые приводят к изменениям в течение двух люминесцентных журналистами киназы (CDK) деятельности циклинзависимой. CDK6-зависимого фосфорилирования белок ретинобластомы ядерного на серин 780 (P-S780 RB1) оценивается с помощью окрашивания антител. В тех же клеток, зеленый флуоресцентный белок меченного корреспондент CDK2 деятельности (GFP-CDK2 Reporter) оценивается ее ядерный цитоплазматической отношение, где в отсутствие CDK2 деятельности репортер проживает в ядре и при активации CDK2 челноков в цитоплазму 8. Кроме того, ядерной ДНК каждой клетки окрашивали с использованием ДНК-интеркалирующего красителя, Bisbenzimide, который служит в качестве средства для идентификации клеток и определить границы ядер в изображениях, аSA показатель плотности ДНК, содержащий информацию о положении клеточного цикла клетки (рис 2). Активность CDK6 и CDK2 могут быть обнаружены в клетках транзита из G1 в S-фазе клеточного цикла 5 и сменяют друг друга 9,10 и, таким образом, близко согласование между двумя репортерами в отдельных клетках, как ожидается. Демонстрация набора данных используется здесь анализ в качестве примера эффект киРНК нацелена CDK6, белка ретинобластомы (RB1) и ненацеливании отрицательный контроль (таблица 1). Нокдаун CDK6 должны вызывать как уменьшение в RB1 эпитопом Р-S780 и накопление клеток в G1 фазе клеточного цикла. RB1 нокдаун служит контролем реагентов для специфичности антитела фосфо-S780. Флуоресцентного микроскопа изображения с формалином фиксированных 11, флуоресцентно окрашенные НСТ116 тканевых культур клетки используются для алгоритмической анализа изображений. Полученный числовые данные затем используется дляперекрестных ссылок, что журналисты и оценить влияние различных бросовым государств. Потенциальный размер данных, полученных такого анализа могут представлять угрозу для нормальных инструментов анализа. Например, данные, индивидуальные клеточные может быть больше, чем некоторые таблицы программное обеспечение размещения. Включены Perl скрипты, которые выполняют простую, высоко повторяющуюся, руководил обработки данных, чтобы помочь анализа больших наборов данных. Сценарии Perl написаны специально для выходных файлов, произведенных сотовым Profiler, при обработке графических файлов с определенным присвоения имен файлов (рис 3), а также позволяют переменным числом полей в скважине, которые будут использоваться в анализе. Это часто важно, чтобы данные затвора отдельная клетка анализа для отслеживания тенденций в клеточных субпопуляций 5 и показано здесь является использование сценария Perl с флагом каждая ячейка на основе заданного заранее определенного ворот для каждого типа анализа. Кроме того, включены дополнительные скрипты Perlв которых суммированы результаты данных для отдельных скважин (или условий), обеспечивая: процент клеток в пределах установленного ворот и средних значений исходных показателей анализа. Последний, более однородной способ просмотра данных, действительна, где ответы влияют на все или большинство клеток в хорошо. Как обсуждалось выше, такая оценка является менее полезным, чем той, которая обеспечивается индивидуальной стробирования данных клеток, где реакция ограничена до подмножества клеток в популяции. Полезность описанного процесса не ограничивается возмущением по миРНК или маркерных анализов, описанных. Исследования использовали этот подход для анализа ответов в Культура ткани эксперименты с использованием комбинации миРНК, химические ингибиторы и лучевой терапии, а также для оценки других, чем CDK6 маркеров и CDK2 деятельности 5. Концептуально, экспериментальная стратегия позволяет множество биологически полезных субклеточных регионах, которые будут автоматически зарегистрированыВ отдельных клеток, присутствующих в флуоресцентного микроскопа изображений. Таким образом, этот подход может дать количественные, мультиплексированных данных, раскрывая биологическую информацию, которая может быть пропущенный через методы, которые сосредотачиваются на популяции, а не отдельных клеток. С незначительными изменениями, рабочий процесс подход и анализ описаны может дать количественные, индивидуальные данные клетки для каких-либо флуоресценции основе анализа результатов и клеточных биологических реакций, где количественная оценка содержания ДНК, количественное ядерной или цитоплазматической флуоресценции или челночный маркеров между этими два отсека по отдельности или в режиме мультиплексирования представляет интерес. Как Требования издательства более склонны к представлению в открытом доступе исходных данных, доступа к ним и знакомство с бесплатными инструментами для анализа микроскопических изображений, такие как те, что описаны здесь также будет представлять непосредственный интерес в лаборатории, глядя на повторный анализ опубликованных данных.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="604">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AllStars negative control siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1027280</td>
			<td style="width:167px;">Negative control siRNA.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CDK6 siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Dharmacon/ Custom synthesis</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Antisense sequence: 5&#39; CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">RB1 siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Dharmacon/ Custom synthesis</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Antisense sequence: 5&#39; GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">5x siRNA buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Scientific</td>
			<td>B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:167px;">To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nulcease-free water (non-DEPC)</td>
			<td style="width:103px;">Applied Biosystems</td>
			<td>AM9937</td>
			<td style="width:167px;">For dilution of siRNA buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hiperfect</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right">301705</td>
			<td style="width:167px;">Transfection lipid.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">41966052</td>
			<td style="width:167px;">Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">96 well tissue culture plate</td>
			<td style="width:103px;">Falcon</td>
			<td align="right">3072</td>
			<td style="width:167px;">Plain, 96-well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes.</td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">Packard Viewplate</td>
			<td style="width:103px;">Perkin Elmer LAS</td>
			<td align="right">6005182</td>
			<td style="width:167px;">96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Breathable membrane</td>
			<td style="width:103px;">Alpha Labs</td>
			<td style="width:119px;">LW2783</td>
			<td style="width:167px;">Sterile, gas-permeable, adhesive membrane.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT5012-1CS</td>
			<td style="width:167px;">10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100PC</td>
			<td>Non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;">Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2287</td>
			<td style="width:167px;">For plate wash solution.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-P-S780 RB1 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Abcam</td>
			<td>ab32513</td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AlexaFluor647 Anti-rabbit</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td>A21245</td>
			<td style="width:167px;">Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hoechst 33342 (Bisbenzimide)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Plate wash solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Tris-buffered saline containing 0.1 % Tween-20.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Block solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Profiler 2.1</td>
			<td style="width:103px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Active Perl Community Edition</td>
			<td style="width:103px;">ActiveState</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">R programming environment</td>
			<td style="width:103px;">The R Foundation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.r-project.org</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rstudio</td>
			<td style="width:103px;">Rstudio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

workflow for high-content, individual cell quantification of fluorescent markers from universal microscope data, supported by open source software

Достижения в понимании механизмов контроля, регулирующих поведение клеток в прикрепленных млекопитающих моделей культуры ткани становятся более зависимыми от режимов анализа одноклеточного. Методы, которые поставляют композитных данные, отражающие средние значения биомаркеров из клеточных популяций рискуем потерять динамику подгрупп населения, которые отражают неоднородность исследуемой биологической системе. В соответствии с этим, традиционные подходы заменяются или поддерживается, более совершенных форм клеточном анализе разработанных с целью оценки High-контент микроскопии. Эти анализы потенциально генерировать большое количество изображений флуоресцентных биомаркеров, которые позволили сопровождая собственные программные пакеты, позволяет многопараметрических измерений в клетке. Тем не менее, относительно высокие капитальные затраты и сверхспециализации многих из этих устройств не позволили их доступность многих исследователей. Описанный здесьуниверсально применимой рабочий процесс для количественного определения нескольких люминесцентных интенсивности маркеров из определенных субклеточных регионах отдельных клеток, пригодных для использования с изображениями от большинства люминесцентных микроскопов. Ключом к этому рабочего процесса реализация в свободном доступе сотовый Профили программного обеспечения 1 различить отдельные клетки в этих изображениях сегмент их в определенные внутриклеточные регионов и доставить интенсивность флуоресценции маркера конкретные значения этих регионах. Добыча отдельных значений интенсивности клеточного из данных об изображении главная цель этого процесса и будет показано при анализе данных управления от экрана миРНК для G1 регуляторов контрольно-пропускном пункте в прикрепленных клетках человека. Тем не менее, представленные здесь технологический процесс может быть применен к анализу данных, полученных другими способами клеток возмущения (например, соединение экраны) и другие формы флуоресценции на основе клеточных маркеров и, таким образом, должны быть полезны для широкого круга лабораторий.

Watch this Scientific Journal Video about Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software at JoVE.com

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Workflow для высокого содержания, отдельная клетка количественной флуоресцентных маркеров из Всеобщей микроскоп данных, поддерживаемые ПО с открытым кодом

Представлен гибкий информатика рабочий позволяя мультиплексированных на основе образа анализ флуоресцентно меченых клеток. Рабочий процесс количественно ядерных и цитоплазматических маркеров и вычисляет маркер перемещение между этими отсеками. Процедуры предназначены для возмущения клеток с использованием миРНК и надежную методику для обнаружения маркера путем непрямой иммунофлуоресценции в форматах 96-а.

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Нейронов и астроцитов сотрудничеству культуры Пробирной высоких Анализ содержания Нейротоксичность

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Изображений С. Элеганс Эмбрионы использованием Epifluorescent Микроскоп и открытое программное обеспечение

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Количественный анализ рабочих процессов Фитнес

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Высокое содержание изображений Workflow по изучению Grb2 сигнализации комплексы выражением Клонирование

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Профилирования Индивидуальный человеческих эмбриональных стволовых клеток путем количественного RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Отслеживание и Количественная процессов развития в<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Использование инструментов с открытым кодом

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source High Content Analysis Используя Автоматизированное время жизни флюоресценции визуализации микроскопии

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Сотовая редокс-профилирование с использованием высококонцентрированной микроскопии

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

С открытым исходным кодом Анализ Одночастичного для супер-разрешение микроскопии с VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: Инструмент интеграции данных с открытым исходным кодом для транскриптомики больших данных, предназначенный для гамбии переносчика малярии Anopheles

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...