Name: workflow for high-content, individual cell quantification of fluorescent markers from universal microscope data, supported by open source software
Uploaded: 2014-12-16T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software at JoVE.com

Detta arbete har finansierats med bidrag CRUK 15043 och CRUK 14251. Vi tackar Daniel Wetterskog och Ka Kei Ho för tekniskt bistånd och kritisk läsning av manuskriptet.

1. Experimentell Perturbation och Cell Märkning för Response Markers (Omvänd Transfection siRNA Screen) <ol><li> I en steril vävnadsodling huva pipett 70 pl 200 nM siRNA i 1x siRNA buffert i brunnar i en steril, vanligt 96 brunnar. Späd transfektion lipid i 40 volymer av serumfritt DMEM-medium och dispensera 105 ^ il i varje brunn innehållande siRNA. OBS: Utspädning 262,5 il lipid i 10,5 ml serumfritt DMEM ger en huvudblandning lämplig för en hel 96-brunnsplatta av siRNA, leverera 2,6 | il av lipid per brunn. Användning av 200 nM siRNA startkoncentration i detta steg kommer att leverera en fungerande koncentration på 20 nM i steg 1.3, men rutiner kommer att arbeta för att arbeta koncentrationer ned till 5 nM, med utgångskoncentrationen justeras därefter (dvs 50 nM). Lägre arbets koncentration kan minska off-target falska positiva poäng, även om de kan minska storleken på on-mål svar, vilket leder till ökad on-target falskt negativa. </li><li> Blanda plattan genom försiktig vibration för tio minuter vid rumstemperatur. Dela upp de resulte 175 pl i tre 50 ^ replikerar per mål på en ogenomskinlig, vävnadskultur behandlas, 96-brunnar med en transparent bas. </li><li> Omvänd transfektera genom dispense 8.000 celler per brunn i 150 pl DMEM innehållande 10% serum direkt på 50 il lipid-siRNA komplex. Använd HCT116 humana kolorektala celler stabilt uttrycker en GFP-märkta markör rapportering CDK2 aktivitet 5,8. Inga ytterligare blandning är nödvändig. Täta plattan med en steril, lim membran som andas för att kontrollera luftfuktigheten och förhindra platt &quot;kanteffekter&quot; och placera plattan i en fuktad inkubator vid 37 ° C, 5% CO2 under 48 timmar. </li><li> Suga ut mediet så att en liten restmängd av medie kvar i brunnarna. Fixera cellerna genom att tillsätta 100 pl av 4% buffrad formaldehyd till varje brunn och inkubera i ett dragskåp i 10 min vid rums temperatur. </li><li> Ta bort fästlösningen genom att aspirera plattan. Vid denna punkt antingen avbryta experimentet genom tvättning av plattan tre gånger med 100 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och sedan lagra förseglas under 100 il PBS i mörker vid 4 ° C i upp till en vecka, eller fortsätta med permeabilisering av cellerna. OBS: Vi rekommenderar behandlingsplattor så snart som möjligt efter fixering, och i allmänhet föredrar lagring av fullt bearbetade plåtar. Biocidprodukter konserveringsmedel såsom timerosal, natriumazid, eller kommersiella alternativ kan tillsättas för att förhindra micoroganismal tillväxt. Tillsättning av fosfatasinhibitorer bidrar till att bevara Fosfor-epitoper, och andra sätt att bevara proteinmodifierings stater kan vara användbar i relevanta analyssammanhang </li><li> Avlägsna PBS från plattan och permeabilisera cellerna genom att tillsätta 100 pl av permeabilisering lösning. Inkubera under 10 min vid rumstemperatur utan skakning. Aspirera permeabilization lösningen med en MultichAnnel pipett. Upprepa detta steg tre gånger. </li><li> Blockera cellerna genom tillsats av 100 | il blockningslösning per brunn under 30 min vid rumstemperatur. Avlägsna blockningslösning genom att aspirera plattan, sedan sonden med 50 pl av anti P-S780 RB1 antikropp utspädd 500-faldigt i blocket lösningen för 2 h i mörker vid rumstemperatur. </li><li> Tvätta plattan tre gånger med 100 | il platta tvättlösning, som lämnar lösningen på plattan under 5 minuter varje gång. Sond plattan över natten i mörker vid 4 ° C med 50 | il fluorescent-märkt sekundär antikropp utspädd 1000-faldigt i blocklösning kompletterad med 2 | iM av kromatin-specifik DNA-färgämne Bisbenzimide. Tvätta plattan tre gånger såsom tidigare och lagra förseglas under 100 | j, l PBS i mörker vid 4 ° C. Bild plattan inom två veckor. </li></ol> 2. Imaging och Bildsegmente <ol><li> Använd en konfokala eller spinning-disk fluorescensmikroskop med en 20X mål att ta separat 16-bitars, gråskala TIFF-bilder i tre kanaler som motsvarar DNA färgämnet, GFP och immunfärgnings fluoroforer. Fånga många icke-överlappande bilduppsättningar, som här kallas ramar, till bilden ungefär 1000-2000 celler per brunn. </li><li> Namnge bildfiler systematiskt så att varje filnamn är en unik kombination av &quot;experiment namnet&quot;, &quot;väl adress&quot;, &quot;ramnummer&quot; och &quot;kanalidentifierare&quot;, i denna ordning (Figur 3). Den inställda exempeldata använder &quot;Blue&quot; (kromatin DNA färgning) eller &quot;grönt&quot; (GFP) eller &quot;Röd&quot; (den immun färgade fluoroforen) som kanal identifierare. Den väl adress, ramnummer och kanalidentifieraren är vidare på kallad bildens metadata. Använd understreck symbol för att undvika förvirrande väl och ram metadata. </li><li> Namnge filerna med dessa metadataelementen i den angivna ordningen. Detta är nödvändigt för att säkerställa att de efterföljande programsteg Correctly grupp uppsättningar bilder för analys. </li><li> Ladda ner och installera freeware Cell Profiler, Active Perl Community Edition, R miljö statistisk programmering och RStudio. Acceptera alla standardalternativ under installationen; PC-användare installerar Active Perl ger möjlighet för alla alternativ som rör PATH, filändelsen förening och manus kartläggning där du blir tillfrågad. Active Perl är frivilligt för Mac-användare, men de annars kommer att behöva köra Perl-skript i steg 3.2 från Terminal kommandoraden istället för att använda ikonen klicka. </li><li> Öppna Cell Profiler programvara, klicka på &quot;File&quot;, &quot;Importera Pipeline&quot; sedan &quot;Från fil&quot; och välj filen 3_channels_pipeline.cppipe (Siffror S1A &amp; S1B). Filen innehåller instruktioner som är nödvändiga för programvaran att tolka bildfil metadata från filnamnskonvention beskrivs. Cell Profiler avser nu bilderna, utdrag nukleärt DNA och intensiteter antikropps från these och använder GFP kanalen för att beräkna förhållandet mellan nukleär kontra cytoplasma intensiteten för varje cell detekteras (fig 4 &amp; 5). </li><li> Klicka på &quot;Inställningar Se utgångs kallade knappen i det nedre vänstra hörnet av Cell Profiler fönstret. På toppen av den nya skärmen är textrutor märkta &quot;Default Input Folder&quot; och &quot;Default Output Folder&quot;. En i taget, klicka på mapp-ikonerna till höger om dessa rutor och markera platsen för bildfiler för analys och destinationen för de extraherade data, respektive (Figur S1C). </li><li> Börja bildanalysen genom att trycka på &quot;Analysera Images knappen i det nedre vänstra hörnet av Cell Profiler. Längst ner på skärmen observera återstående tid för datautvinning, den &quot;Stoppa Analysis&quot; och &quot;Paus&quot; knapparna. Om det behövs en paus i analysen genom att välja &quot;Paus&quot; knappen när som helst, vilket är användbartnär du tittar på bilderna som analyseras (beskrivs i steg 2,8). </li><li> Eventuellt öppna fönstren för någon av bildanalys steg genom att klicka på ögon ikonerna i panelen på den yttersta vänster av programfönstret (figur S1D). Observera &quot;IdentifyPrimaryObjects&quot; fönstret och de för &quot;Sekundära&quot; och &quot;tertiära Objects för att kontrollera att de aktuella inställningarna i Cell Profiler för att utföra bildsegmente är lämpliga (se figur 1 och diskussion för råd om att ändra dessa inställningar). </li><li> Klicka på &quot;OK&quot; i meddelanderutan som visas när analysen är klar. Gå till platsen &quot;Default Output Folder&quot; där alla datafiler med resultaten sparas som kommaseparerade-värde (.csv) filer (Figur S2A). </li></ol> 3. Dataextrahera <ol><li> Hitta den nya filen &quot;Nuclei.csv&quot;, som ingår bland deutdata från Cellinformation. Den här filen innehåller enskilda celldata för fluorescerande nukleär antikropp intensitet, kärn-DNA intensitet och GFP-CDK2 reporter kvotvärden (figur 6A &amp; S2a). OBS: Olika laboratorier kommer att vilja behandla denna typ av data för att passa den typ av sina egna analyser. Föreslås för det aktuella uppgifterna är gating av celler från varje behandlingstillstånd enligt de uppgifter antikropps och GFP-CDK2 reporter värden med hjälp av den medföljande Perl script &#39;2_gate_classifier.pl &quot;. </li><li> Kopiera förutsatt Perl skriptfilen &quot;2_gate_classifier.pl&quot; i samma mapp som den &quot;Nuclei.csv&quot; datafil (Figur S2A). Dubbelklicka på ikonen för Perl-skript och, när du uppmanas, skriver det fullständiga namnet på datafilen följt av ett &quot;.csv&quot; filnamn namn för filen i vilken cellerna ska gated och slutligen grind värden för antikroppfluorescens och GFP-CDK2 reporter uppgifter. OBS: Hur man huvudsakligen avgör gate inställningar och använda dessa för analys av data diskuteras nedan i Representant Data sektionen och figur 6 (för att analysera data tillhandahålls användning &quot;0,004&quot; och &quot;1.5&quot;, respektive). Mac-användare bör köra Perl-skript från Terminal kommandoraden genom att skriva: &quot;perl 2_gate_classifier.pl&quot;. </li><li> Observera den nyskapade filen som kombinerar de råa enskilda cellanalysvärden från de ursprungliga Cell Profiler data med underbefolknings etiketter som visar hur varje cell från varje brunn utför mot både grindar (figur 6C). </li><li> Plotta data för varje experimentell tillstånd att använda de individuella cell subpopulation etiketter genom att öppna RStudio programvaran. Klicka på &quot;File&quot; och &quot;Öppna fil&quot;, välj sedan den medföljande &quot;analysis.r&quot; fil. Observera kommandona för att rita figurer 6B, <strong&gt; 7 och 8 i det övre vänstra fönstret i RStudio (Figur S2B). I det övre vänstra fönstret, mellan de dubbla citationstecken symboler på linjerna 5 och 6, skriver datoradress för den mapp som innehåller de gated uppgifterna. Inkludera enhetsbeteckningen och namnet på själva filen, respektive (t.ex. &quot;C: / mappAnalys / analys output&quot; och &quot;nuclei_gated.csv&quot;). OBS: Om RStudio används för första gången på en viss dator, kommer R grafikpaketet &quot;ggplot2&quot; måste installeras först. Detta är en endast en gång steg för en ny installation av RStudio, varefter detta steg blir överflödig. För att installera &quot;ggplot2&quot;, klicka på fliken som heter &quot;paket&quot; ovanför fönstret i det nedre högra hörnet av RStudio, klicka på knappen &quot;Installera paket&quot; knappen som visas nedanför detta. Ett nytt fönster kommer att visas. Skriv &quot;ggplot2&quot; (utan citat) i &quot;Paket stakten i denna nya fönster och slutligen klicka på &quot;Install&quot; för att stänga fönstret, installera nödvändiga ggplot2 funktionerna och återgå till huvud RStudio fönster för att fortsätta från steg 3.6. </li><li> Markera raderna 1 till 17 i det övre vänstra fönstret i RStudio, klicka sedan på &quot;Kör&quot; knappen. Detta kommer att gå in experimentella data, tröskelvärden och väl platsinformation till R (Figur S2C). R kommer nu tillfälligt hålla relevanta data för plottning. </li><li> Markera enskilda block av den återstående koden nedanför linjen 17 och skapa motsvarande tomter genom att klicka på &quot;Kör&quot; knappen som tidigare. Observera tomter i fönstret i det nedre högra hörnet av RStudio och spara antal format genom att klicka på &quot;Exportera&quot; -knappen (Figur S2D). </li><li> Medan stängning RStudio, klicka på &quot;Spara inte&quot; när du ombeds. Detta förhindrar förvirring på nästa användning av RStudio, som annars kommer att hålla uppgifterfrån föregående session. </li></ol>

<ol>
	<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Khan, A., Eldaly, H., Rajpoot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-gaussian+mixture+model+for+detection+of+mitotic+cells+in+breast+cancer+histopathology+images.">A gamma-gaussian mixture model for detection of mitotic cells in breast cancer histopathology images.</a> J Pathol Inform. 4, 11 (2013).</li><li>Selzer, P., Beibel, M., Gubler, H., Parker, C. N., Gabriel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multivariate+data+analysis+strategies+for+high-content+screening.">Comparison of multivariate data analysis strategies for high-content screening.</a> J Biomol Screen. 16 (3), 338-347 (2011).</li><li>Lyman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content,+high-throughput+analysis+of+cell+cycle+perturbations+induced+by+the+HSP90+inhibitor+XL888.">High content, high-throughput analysis of cell cycle perturbations induced by the HSP90 inhibitor XL888.</a> PLoS One. 6 (3), e17692 (2011).</li><li>Richardson, E., Stockwell, S. R., Li, H., Aherne, W., Cuomo, M. E., Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+screen+establishes+signalling+framework+for+DNA+damage-associated+G1+checkpoint+response.">Mechanism-based screen establishes signalling framework for DNA damage-associated G1 checkpoint response.</a> PLoS One. 7 (2), e17692 (2012).</li><li>Heynen-Genel, S., Pache, L., Chanda, S. K., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+and+high-content+screening+for+target+discovery+and+deconvolution.">Functional genomic and high-content screening for target discovery and deconvolution.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (10), 955-968 (2012).</li><li>Krausz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+siRNA+screening.">High-content siRNA screening.</a> Mol Biosyst. 3 (4), 232-240 (2007).</li><li>Gu, J., Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Cycle-dependent+Regulation+of+a+Human+DNA+Helicase+That+Localizes+in.">Cell Cycle-dependent Regulation of a Human DNA Helicase That Localizes in.</a> DNA Damage Foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).</li><li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pRB+phosphorylation.">Control of pRB phosphorylation.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (1), 21-27 (1998).</li><li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein--from+bench+to+bedside.">The retinoblastoma protein--from bench to bedside.</a> Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 97-107 (2005).</li><li>Nybo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+imaging+in+fixed+cells.">GFP imaging in fixed cells.</a> BioTechniques. 52 (6), 359-360 (2012).</li><li>Schwartz, R. L., Foy, B. D., Phoenix, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Learning Perl - Making Easy Things Easy and Hard Things Possible. , 1-363 (2011).</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , 978-970 (2009).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna

Arbetsflödet beskrivs utgör ett förfarande för flerkälls perturbance av celler genom att använda siRNA, efterföljande markör upptäckt och äntligen använda av en serie mjukvarustödda åtgärder för att underlätta utvinning av kvantitativa data från de resulterande fluorescerande mikroskopiska bilder. Ansatsen är inriktad på leverans av nukleära och cytoplasmiska intensitetsvärden för enskilda celler, som har bred praktisk tillämpning i många cellbaserade applikationer. De exempeldata som används här genererades i en siRNA skärminställning där två fluorescerande analyser för G1 fas cellcykelns transitering testas och korrelerade tillbaka till en mer direkt biofysiska mått på kärn DNA-innehåll. Användningen av ett fluorescerande DNA fläck till bilden kärn-DNA är ett nödvändigt steg i bildsegmente processen eftersom det möjliggör identifiering av enskilda celler och den resulterande &quot;Nuclei mask&quot; tjänar som utgångspunkt för att identifiera motsvarande cytoplasmiC-regioner. GFP-tagged CDK2 reporter, som stabilt uttrycks i cellerna, ger en variabel ännu genomgående högre än bakgrundssignalen i cytoplasman genom vilket detta fack kan avgränsas. Samma pipeline analys bör vara tillämplig på analys av proteintransloka händelser med hjälp av andra lämpliga fluorescens bundna reportrar och deras svar på perturbance. Dessutom skulle substituera GFP-CDK2-reporter med cytoplasma specifika fluorescerande färgämnen tillåta alternativ användning av denna algoritm för att mäta dimensionerna av cytoplasma och de relativa storlekarna för cellerna i bilderna. En annan utformning övervägande i bildsegmentestrategi som beskrivs här är att använda Cell Profiler för att leverera integrerade intensitetsvärden för DNA kvantifiering. Integration av intensiteten värden för nukleärt DNA färgnings uppgifter möjliggör möjliga variationer i nucleus storlek, och representerar en nära match för kvantifiering profilerna settför propidiumjodid målat FACS data. Dock kan integrerade intensiteten inte ge ett lämpligt medel för att bedöma proteinfunktion där den genomsnittliga koncentrationen, exemplifierad av medelintensitet antigen fluorescens, är mer biologiskt relevant än den integrerade totala mängden protein (och tillhörande fluorescens) inom en cell fack. Därför menar intensitetsvärden användes för P-S780 RB1 och GFP uppgifter. Alternativet att ändra mellan de två lägena (betyder eller integrerad) data bedömning finns på &quot;ExportToSpreadsheet&quot; panel Cell Profiler programvara. Inställningarna analys i 3_channels_pipeline.cppipe filen är optimerade för bilderna i uppsättningen exempeldata. Analys av nya bilder set med detta protokoll kommer att kräva att filnamnen antar namnkonventionen som beskrivs ovan (Figur 3). Dessutom värderar känslighet för att passa ljusstyrka nukleärt DNA färgning och trösklar för bakgrundintensiteter i de nya bilduppsättningar kan behöva justeras inom Cell Profiler inställningar. Med tanke på den nyckelroll DNA färgning håller för att bygga de olika bildsegmente masker, är tillämpningen av korrekta känslighetsinställningar för den här kanalen nyckeln till en framgångsrik analys av nya bilddata med Cell Profiler programvara. Den tillhandahålls Cell Profiler inställningsfil (3_channels_pipeline.cppipe) innehåller anteckningar om de oftast användbara parametrar för att anpassa analysen till nya uppgifter. Dessa anteckningar är i textrutan längst upp på skärmen i Cell Profiler i huvudfönstret och inkludera riktlinjer om att ändra känslighetsinställningar och justera antalet kanaler som ska analyseras. Som åtalade i protokoll avsnitt 2.8, för att testa inställningarna för nya bilddata kan det vara nödvändigt att observera bildsegmente under bildanalys genom att klicka öppna de &quot;ögon&quot; ikoner för varje &quot;Identifiera ... Objekt&quot; protokollsteg (figur S1D </strong&gt;). I synnerhet kommer visualisering av bilddata genom &quot;IdentifyPrimaryOjects&quot; visar om Nuclei masken korrekt identifierats från bilder av DNA färgning. På Cell Profiler mjukvarusidan för de &quot;IdentifyPrimaryOjects&quot; modul är tröskelkorrektionsfaktor. Trial and error justering av detta värde kommer att fixa de flesta kärnkrafts fel erkännande. Värdena balansera DNA-kanalen mot bakgrund intensiteten för varje bild. Tröskelkorrigeringsfaktorvärden gångjärn runt 1, där större än detta är strängare (bra för tydliga bilder) och mindre än 1 är seende (anpassad till bilder med mindre kontrast mellan färgning och bakgrund). Den råa produktionen av enskilda celldata från Cell Profiler kan analyseras på olika sätt för att passa behoven hos andra studier. Visas här är användningen av ett Perl-skript för att tillämpa portarna till två av de parametrar som mäts per cell för att bistå utvinna biologiska trender från data ettd tillstånd samkörning av de identifierade subpopulationer med ytterligare mätningar. Även om det är lika möjligt att inkludera delar av grind inom ramen för Cell Profiler, den alternativa rutten används här ger större flexibilitet och snabbhet, speciellt om stora datamängder behöver bedömas. Den långsammaste steget i efterbildförvärvsfaser nuvarande protokollet är driften av Cell Profiler programvara. Cell Profiler här drivs utan införande grindar för att alstra en un-gated rådatauppsättning, som kan omanalyseras med den efterföljande Perlskript snabbare och, om så behövs, iterativt med olika grind värden. Inte alla studier vet i förväg lämpliga grind värden som kan variera med reagenser på en viss uppsättning data, och potentiellt över tiden. Det är därför rekommenderat att generera histogram som visar rådata fördelningen erhållits från Cell Profiler för positiva kontroller och mock-störda celler i syfte att identifiera lämpliga gate values för parametrarna av intresse. De Perl-skript är skrivna för att acceptera en fast definierad kolumnstruktur av data från Cell Profiler och kan sluta fungera om en användare ändrar antalet parametrar produktionen med Cell Profiler hjälp av &quot;ExportToSpreadsheet&quot; inställningar. Att bidra till att genomföra ändringar av inställningarna noterna inkluderas inom Perl skriptfiler. För att se dessa läser manuset i en textredigerare, företrädesvis en programmerare textredigerare inställd på färgkod Perl element (t.ex. http://www.activestate.com/komodo-edit). Dessa anteckningar anger var att justera skript för att anpassa sig till förändringar i dataformat. I likhet med Perl-skript, R-kod fil tillhandahålls (analysis.r), innehåller instruktioner för att rita siffrorna från dataanalys bilden, kan läsas i en textredigerare eller RStudio programvara för att se ytterligare anteckningar om användning och anpassning. Dessa anteckningar kan kompletteras med information om reguljära uttryck och Perl &lt;sup&gt; 12 och ggplot2 13 paket för R, som båda ligger till grund för hur data läses, kommenterad och ritas, respektive. Nya studier med fluorescensmikroskopi samt rådata som deponerats hos öppen källkod publikationer är mottagliga för analysmetoder såsom de som beskrivs här. Själva karaktären av hög halt uppgifter lämpar sig för rekursiva analys med olika analytiska inriktningar beroende på forskningsintressen given observatör. Även de frågor som kan ställas på de uppgifter som begränsas av proberna ursprungligen använts, bilddata kan ofta menings omanalyseras utanför ramen för de studier som genererade dem.

Arbetet presenteras här beskriver användningen av fritt tillgänglig programvara Cell Profiler för att utföra algoritmen styrd fördelning av fluorescerande mikroskopiska bilder av vidhäftande celler för att identifiera enskilda celler och definierade subcellulära regioner. Detta tillvägagångssätt, som kallas bildsegmentering, medger att efterföljande multi parametrisk analys av de avbildade cellerna genom att kvantifiera fluorescensmärkta markörer lokaliserade till varje cell eller subcellulär regionen (kallad segmente objekt). Detta arbetsflöde utgör en grund för att möjliggöra hög innehållsanalys och är avsedd att fungera som ett verktyg som kan vidareutvecklas och modifieras för att passa flera parametriska analyser individuell cell i laboratorier utan tillgång till specialiserade hög halt instrument eller proprietär programvara. Filerna medföljer detta manuskript inkluderar ett test uppsättning relevanta råbilddata, algoritminställningar och stödjande skript för att generera den analys som beskrivs. Den tillhandahålls algoritminställningar feller Cell Profiler är optimerade för de exempeldata som och diskussionsavsnittet detaljer vilka justeringar kan vara nödvändiga för att möjliggöra användning av bilddata från andra studier. När kvantitativa data har extraherats med hjälp av Cell Profiler, kan olika laboratorier har olika krav på hur man kan använda den information som presenteras av de enskilda cellvärden i rådata; som visas här är ett tillvägagångssätt genom vilket grindar appliceras på rådata för varje analys. Med hjälp av dessa portar, är de data som omvandlas till binära termer av svar, vilket gör visualisering av trender som förbinder olika behandlingar med de subpopulationer av celler som genomgår svar definieras av grindarna. Grindarna sätts utifrån observationer av datafördelning erhållits för lämpliga negativa och positiva kontroller för varje relevant mätning. Användningen av grindar är bara ett exempel på hur man kan hantera de råa, cellbaserade mätningar. Också visas här är användningen av nukleärt DNA intensitet migasurements i sin råa form som en kontinuerlig rad värden i kombination med gated data. Andra tillvägagångssätt för hantering av data bildanalys bör övervägas, beroende på naturen av studien; statistiska alternativ till att använda grindar för att tilldela celler till subpopulationer har rapporterats 2 och systematiska jämförelser av strategier för att sammanfatta data med hög innehålls över ett stort antal parametrar har rapporterats 3. Hög innehålls analyser av bilddata har funnit användning i cellulära studier av läkemedelssvar, omvända genetik och miljöstress signalering 4-6. Förtjänsten av hög innehållsanalys härrör från det faktum att algoritmisk analys av fluorescensmikroskopi uppgifter möjliggör kvantitativa och rumsliga parametrar som skall beaktas samtidigt över enskilda celler 7. På detta sätt kan cellulära utfall för flera analyser vara korsreferenser, differentiell beteende analys-defined cellsubpopulationer kan spåras inom experimentella förhållanden och analyser kan omfatta granskning av morfologiska variabler. Den strategier och analyser arbetsflöde diskuteras här, som för andra high-innehåll tillvägagångssätt, kan leverera multiplexerade data som kors refererade till enskilda celler. Hög halt metoder kostym studier som genererar fluorescerande mikroskop bilder och är tillämpliga för analys av data som sträcker sig från tiotals bilder som produceras i låg genomströmning konventionell fluorescens-baserade mikroskopi genom de tusentals bilder som framställts med hjälp av automatiserade hög halt screening plattformar. Arbetsflödet illustreras här med exempeldata från vilka separata analyser mäts i termer av antingen kärn fluorescerande markör intensiteter eller nukleär / cytoplasma translokation av ett fluorescerande reporter protein, respektive. Arbetsflödet är flexibel i att dessa analyser kan behandlas separat eller i kombination beroende på each given frågeställning av olika utredare. De exempeldata produceras som en del av en RNA-interferens (RNAi) experiment (Figur 1). Små störande RNA oligonukleotider (siRNA) används för att VÄLDIGANDE specifika proteiner i HCT116 mänskliga kolorektala cancerceller som resulterar i förändringar för två fluorescerande reportrar av cyklin-beroende kinas (CDK) aktivitet. Den CDK6 beroende fosforylering av kärn retinoblastomprotein vid serin 780 (P-S780 RB1) bedöms av antikroppsfärgning. I samma celler, är ett grönt fluorescerande protein-märkta reporter av CDK2-aktivitet (GFP-CDK2 reporter) bedöms av landets kärnenergi till cytoplasma förhållandet var i avsaknad av CDK2 aktivitet reportern bosatt i kärnan och vid CDK2 aktiverings skyttlar i cytoplasman 8. Dessutom är det nukleära DNA i varje cell färgas med hjälp av en DNA-interkalerande färgämne, Bisbenzimide, som fungerar som ett sätt att identifiera celler och definiera kärnor gränserna bilderna samt ensa mått av DNA överflöd med information om cellcykelläge av cellen (Figur 2). Verksamheten i CDK6 och CDK2 är detekterbara som celler transit från G1 till S-fasen av cellcykeln 5 och avlöser varandra 9,10 och som sådan, är nära överensstämmelse mellan de två reportrarna i enskilda celler förväntat. Demonstrationen dataset används här analyser som exempel effekten av siRNA riktar CDK6, retinoblastom protein (RB1) och en icke-inriktning negativ kontroll (tabell 1). Knockdown av CDK6 bör framkalla både en minskning av P-S780 RB1 epitopen och en ackumulering av celler i G1-fasen av cellcykeln. Den RB1 knockdown fungerar som en reagens kontroll för specificiteten hos fosfor-S780 antikropp. Fluorescensmikroskop bilder från formalin fast 11, fluorescerande färgade HCT116 vävnadskulturceller används för algoritmisk bildanalys. Den resulterande numeriska data används sedan för attkorshänvisning reportrarna och bedöma konsekvenserna av de olika knockdown stater. Den potentiella storleken på de data som produceras av denna typ av analys kan presentera en utmaning till normala analysverktyg. Till exempel kan de individuella celldata vara större än vissa kalkylprogram kommer att rymma. Inkluderat är Perl-skript som utför enkla, högt repetitiva, övervakad behandling av uppgifter för att underlätta analys av stora datamängder. De Perl-skript är skrivna speciellt för de utgående filer som produceras av Cell Profiler, när de behandlar bildfiler med en specifik fil namnkonvention (Figur 3), och möjliggör variabla antal fält per brunn som ska användas i analysen. Det är ofta viktigt att grinden individuell cell analysuppgifter för att spåra trender i cellsubpopulationer 5 och visas här är användningen av ett Perl-skript för att flagga varje cell baserat på en uppsättning grind förutbestämd för varje analys typ. Ingår även valfria Perl-skriptsom sammanfattar uppgifterna utfallet för enskilda brunnar (eller villkor), leverera: andelen celler inom den inställda grinden och medelvärdena för de råa analys poängen. Den senare, mer homogena sätt att visa data, är giltigt där svaren påverkar alla eller de flesta celler i en brunn. Som diskuterats ovan, är mindre användbar än den som ges av den enskilda cellen uppgifter gating där svar begränsas till en delmängd av celler inom en population sådan bedömning. Nyttan av den beskrivna arbetsflödet är inte begränsad till störning av siRNA eller marköranalyser beskrivna. Studier har använt denna metod för att analysera svaren i vävnadskultur experiment med kombinationer av siRNA, kemiska hämmare och strålbehandling samt för bedömning av andra än CDK6 markörer och CDK2 aktivitet 5. Begreppsmässigt låter den experimentella strategin en mängd biologiskt användbara subcellulära regioner som skall registreras automatiskti enskilda celler som finns i fluorescerande mikroskop bilder. Som sådan, kan detta tillvägagångssätt ge kvantitativa, multiplexade uppgifter avslöjar biologisk information som kan missas genom tekniker som fokuserar på populationer snarare än enskilda celler. Med smärre modifieringar, kan den metod och analys arbetsflöde beskrivs ge kvantitativa, individuella celldata för eventuella fluorescensbaserade analys utgångar och cellbiologiska reaktioner, där kvantitativ bedömning av DNA-innehåll, kvantifiering av kärnkraft eller cytoplasmatisk fluorescens eller skytt av markörer mellan dessa två fack, antingen individuellt eller i ett multiplex sätt är av intresse. Som förlags krav tenderar alltmer mot inlämnande av öppet tillgängliga rådata, tillgång till och förtrogenhet med gratis verktyg för mikroskopi bildanalys såsom de som beskrivs här kommer också att vara av direkt intresse för labb som vill omanalysera publicerade data.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="604">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AllStars negative control siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1027280</td>
			<td style="width:167px;">Negative control siRNA.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CDK6 siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Dharmacon/ Custom synthesis</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Antisense sequence: 5&#39; CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">RB1 siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Dharmacon/ Custom synthesis</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Antisense sequence: 5&#39; GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">5x siRNA buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Scientific</td>
			<td>B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:167px;">To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nulcease-free water (non-DEPC)</td>
			<td style="width:103px;">Applied Biosystems</td>
			<td>AM9937</td>
			<td style="width:167px;">For dilution of siRNA buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hiperfect</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right">301705</td>
			<td style="width:167px;">Transfection lipid.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">41966052</td>
			<td style="width:167px;">Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">96 well tissue culture plate</td>
			<td style="width:103px;">Falcon</td>
			<td align="right">3072</td>
			<td style="width:167px;">Plain, 96-well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes.</td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">Packard Viewplate</td>
			<td style="width:103px;">Perkin Elmer LAS</td>
			<td align="right">6005182</td>
			<td style="width:167px;">96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Breathable membrane</td>
			<td style="width:103px;">Alpha Labs</td>
			<td style="width:119px;">LW2783</td>
			<td style="width:167px;">Sterile, gas-permeable, adhesive membrane.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT5012-1CS</td>
			<td style="width:167px;">10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100PC</td>
			<td>Non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;">Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2287</td>
			<td style="width:167px;">For plate wash solution.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-P-S780 RB1 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Abcam</td>
			<td>ab32513</td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AlexaFluor647 Anti-rabbit</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td>A21245</td>
			<td style="width:167px;">Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hoechst 33342 (Bisbenzimide)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Plate wash solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Tris-buffered saline containing 0.1 % Tween-20.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Block solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Profiler 2.1</td>
			<td style="width:103px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Active Perl Community Edition</td>
			<td style="width:103px;">ActiveState</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">R programming environment</td>
			<td style="width:103px;">The R Foundation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.r-project.org</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rstudio</td>
			<td style="width:103px;">Rstudio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

workflow for high-content, individual cell quantification of fluorescent markers from universal microscope data, supported by open source software

Framsteg inom förstå kontrollmekanismer som styr beteendet hos celler i vidhäftande däggdjursvävnadskulturmodeller blir alltmer beroende av former av encelliga analys. Metoder som levererar sammansatta uppgifter återspeglar medelvärden av biomarkörer från cellpopulationer riskerar att förlora subpopulation dynamik som speglar det heterogena studerade biologiska systemet. I linje med detta, är traditionella metoder ersätts av, eller stöds med, mer sofistikerade former av cellulär analys som utvecklats för att möjliggöra en bedömning av hög halt mikroskopi. Dessa analyser potentiellt generera ett stort antal bilder av fluorescerande biomarkörer, vilket möjliggörs genom åtföljande proprietära programvarupaket, tillåter fler parametriska mätningar per cell. Dock har de relativt höga kapitalkostnader och overspecialization av många av dessa enheter hindrade deras tillgänglighet till många utredare. Beskrivs här är enuniversellt användbar arbetsflöde för kvantifiering av flera fluorescerande markör intensiteter från specifika subcellulära regioner i enskilda celler lämpliga för användning med bilder från de flesta fluorescerande mikroskop. Nyckeln till detta arbetsflöde är genomförandet av den fritt tillgängliga Cell Profiler programvara 1 att särskilja enskilda celler i dessa bilder, segment dem till definierade subcellulära regioner och leverera fluorescens markör intensitetsvärden som är specifika för dessa regioner. Utvinningen av individuella cellintensitetsvärden från bilddata är det centrala syftet med detta arbetsflöde och kommer att illustreras med analysen av styrdata från en siRNA skärm för G1 checkpoint tillsynsmyndigheter i vidhäftande humana celler. Däremot kan arbetsflödet presenteras här tillämpas på analys av data från andra medel för cell störning (t.ex. sammansatta skärmar) och andra former av fluorescensbaserade cellulära markörer och därmed bör vara användbara för ett brett spektrum av laboratorier.

Watch this Scientific Journal Video about Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software at JoVE.com

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Arbetsflöde för hög halt, Individuell Cell Kvantifiering av fluorescerande markörer från Universal Mikroskop Data, som stöds av Open Source Software

Presenteras är en flexibel informatik arbetsflöde möjliggör multiplex bildbaserad analys av fluorescerande celler. Arbetsflödet kvantifierar nukleära och cytoplasmiska markörer och beräknar markör sloka mellan dessa avdelningar. Förfaranden tillhandahålls för störning av celler med användning av siRNA och tillförlitlig metod för analys av markör detektering genom indirekt immunofluorescens i 96-brunnars format.

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryon med en Epifluorescent Mikroskop och Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

En kvantitativ Fitness analys Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

En hög halt Imaging arbetsflöde för att studera Grb2 signalering komplex genom expressionskloning

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profilering individuella mänskliga embryonala stamceller genom kvantitativ RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Spårning och kvantifiera utvecklingsprocesser i<em&gt; C. elegans</em&gt; Använda Open-source-verktyg

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source Hög innehållsanalys Använda automatiserade fluorescens Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Cellulär redoxprofilering med hög innehållsmikroskopi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Öppen källkod Single-partikelanalys för Super högupplösande mikroskopering med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: ett open source data integreringsverktyg för stordata transcriptomics avsedda för malaria vektorn Anopheles gambiae

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...