Name: luminescence resonance energy transfer to study conformational changes in membrane proteins expressed in mammalian cells
Uploaded: 2014-09-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM094246، وجمعية القلب الأميركية غرانت 11GRNT7890004، ومؤسسة العلوم الوطنية غرانت MCB-1110501.

1. إنشاء تعبيد تحتوي على البروتين من الفائدة استنساخ الجين التعبير عن بروتين من الفائدة الى ناقلات مناسبة. استخدام ناقلات مثل سلسلة pcDNA أو pRK5 كما هي مناسبة تماما للتعبير في أنظمة الثدييات مثل خلايا HEK293 وCHO. <p class="jove_title" style=";text-align:ri...

<ol>
	<li>Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+biophysical+applications+of+lanthanide-based+probes.">Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).</li><li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer:+a+spectroscopic+ruler.">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler.">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).</li><li>Selvin, P. R., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+energy+transfer+using+a+terbium+chelate:+improvements+on+fluorescence+energy+transfer.">Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).</li><li>Chen, J., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+luminescent+chelates+of+terbium+and+europium.">Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium.</a> Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).</li><li>Ge, P., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+luminescent+lanthanide+chelates:+part+2.">Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2.</a> Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).</li><li>Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRET+investigations+of+conformational+changes+in+the+ligand+binding+domain+of+a+functional+AMPA+receptor.">LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor.</a> Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).</li><li>Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+mediated+conformational+changes+in+an+Acid+Sensing+Ion+Channel.">Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel.</a> J. Bio. Chem. 288, (2013).</li><li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+at+the+agonist+binding+domain+of+the+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor.">Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).</li><li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+arrangement+in+N-methyl-D-aspartate+(NMDA)+receptors.">Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).</li><li>Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terbium(III)+chelate+as+an+efficient+donor+for+multiple-wavelength+fluorescent+acceptors.">Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors.</a> Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).</li></ol>

انتقال البيئي بعيد المدى هي تقنية قوية تسمح للعلماء بقياس المسافات بين المجالات داخل بروتين واحد وكذلك بين مفارز في بروتين multimeric. على هذا النحو، ومناسبة تماما انتقال البيئي بعيد المدى لدراسة التغييرات وديناميكية بتكوين جزئي للبروتينات أو الجزيئات الأخرى. بروتوكول ...

التلألؤ نقل الطاقة الرنين (انتقال البيئي بعيد المدى) هو مشتق من المعروف الإسفار الرنين نقل الطاقة (الحنق) تقنية 1. مماثلة لتأكل، انتقال البيئي بعيد المدى يمكن استخدامها لقياس المسافات والتغيرات المسافة بين المانحين ومتقبل fluorophores تعلق على مواقع محددة على البروتين من الفائدة ضمن نطاق 10-100 Å 1-3. مبادئ انتقال البيئي بعيد المدى هي أيضا مشابهة لالحنق في ذلك نقل الطاقة الرنين يحدث بين اثنين fluorophores القريبة عندما الطيف الانبعاثات من fluorophore المانحة يتداخل مع امتصاص الطيف من fluorophore المتقبلة. وترتبط كفاءة هذا النقل لبعد المسافة بين اثنين fluorophores بواسطة المعادلة التالية: <img alt="المعادلة 1" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq1.jpg" width="120" /> مكافئ. 1 حيث R هي المسافة بين اثنين fluorophores، E هو كفاءة ENنقل ergy، وR 0، ناقش أدناه، هو نصف قطر فورستر للزوج fluorophore، أي المسافة التي كفاءة النقل هي نصف القصوى. من هذه المعادلة، يمكن للمرء أن يرى أن يرتبط الكفاءة لحجم المسافة مرفوعة للقوة السادسة عكسية 1. هذا هو معكوس السادس الاعتماد السلطة التي تسمح للانتقال البيئي بعيد المدى الحنق والقياسات لتكون حساسة بشكل رائع حتى للتغيرات مسافة صغيرة عند قرب R 0 من الزوج الحنق. القدرة على تسمية المواقع على وجه التحديد المطلوب على بروتينات أو الجزيئات الأخرى يسمح لأحد للاستفادة من هذه الحساسية لرصد التغيرات متعلق بتكوين. بالمقارنة مع الحنق، والذي يستخدم جزيئات الصبغة العضوية التقليدية، انتقال البيئي بعيد المدى يوفر مزايا إضافية. في انتقال البيئي بعيد المدى، بدلا من استخدام الصبغة العضوية مثل fluorophore المانحة، وهي الموجبة سلسلة اللانثينيدات، وعادة السل 3+ أو الاتحاد الأوروبي 3+، ويستخدم 1،4-6. Fluorophores التي تقع شالتانجو هذه الفئة، على سبيل المثال، التيربيوم كلاب، هي أيضا تنوعا للغاية لأنها يمكن استخدامها مع مجموعة واسعة من fluorophores المتقبلة. يتم إجراء هذه المرونة ممكنا لأن أطياف انبعاث اللانثينيدات بالكلاب تحتوي على عدة قمم الانبعاثات حادة، والسماح لنوع واحد من fluorophore المانحة ليتم استخدامها مع واحد من مجموعة واسعة من fluorophores المتقبلة. وبالتالي، يمكن الكشف عن الانبعاثات توعية متقبل دون أي خوف من تلوث تنزف من خلال من الانبعاثات المانحة 5. المجرب يختار متقبل محددة على أساس المسافة المتوقعة بين اثنين fluorophores (الشكل 1 والجدول 1). في هذه fluorophores اللانثينيدات بالكلاب، وبالكلاب الأيونات المعدنية بنسبة جزيء يحتوي على مجموعة الهوائي أن محسس اللانثينيدات عادة سيئة لامتصاص الإثارة فضلا عن مجموعة وظيفية bioreactive إلى حبل أيون إلى مجموعة وظيفية محددة على جزيء 1، 5،6. انسالبريد متحمس، اللانثينيدات الاسترخاء على ارض الدولة من خلال إطلاق الفوتونات مع معدل تسوس في نطاق ميلي ثانية واحدة. لأن تسوس ليست تخفيف القميص، إلى القميص ولا الاسترخاء الثلاثي، إلى القميص، انبعاث الفوتونات لا يمكن أن يسمى بشكل صحيح أو مضان تفسفر، ولكن أكثر وصفه بشكل صحيح التلألؤ 1. اضمحلال طويل من اللانثينيدات التلألؤ يساعد بشكل كبير في القياسات مدى الحياة. ويمكن بعد ذلك قياسات عمر استخدامها لتحديد كفاءة من خلال العلاقة التالية: <img alt="المعادلة 2" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq2.jpg" width="120" /> مكافئ. 2 حيث E هو كفاءة نقل، τ D هو عمر المانحة (اللانثينيدات بالكلاب) عندما لا تشارك في نقل الطاقة، وτ DA هو عمر المتبرع عند المشاركة في نقل الطاقة مع متقبل. مع انتقال البيئي بعيد المدى، يمكن τ DA اللهبحيث يتم قياسه وفقا لعمر الانبعاثات متقبل لتوعيتهم عمر التيربيوم هو اكبر من ذلك بكثير وfluorophore متقبل العضوية. ومتقبل تنبعث مع نفس العمر والتحريض على الإثارة (اللانثينيدات المانحة) لها، والمساهمة في أي عمر من عمر مضان الجوهرية الخاصة ومتقبل هي ضئيلة نسبيا. عن طريق قياس الانبعاثات توعية بدلا من الانبعاثات المانحة، ونحن أيضا قضاء على الحاجة إلى ضمان وضع العلامات في تمام نسبة 1: 1 من المانحين لالمتقبلة. يمكن بدلا من ذلك أن يكون المسمى البروتين في وقت واحد مع كل متقبل وfluorophores المانحة. وهناك سكان المسمى بتباين يؤدي، ولكن البروتينات المسمى المزدوج المانحة لا تنبعث في طول الموجة متقبل وسوف المزدوج متقبل البروتينات المسمى لا يكون متحمس. وعلاوة على ذلك، يجب أن تكون المسافة بين fluorophores نفسه، بغض النظر عن الموقع الذي السيستين تعلق fluorophore نظرا ل، وخاصة عند استخدام اللانثينيدات الخواص بمثابة المانحة، وبالتالي فإن نيد لتحديد موقع معين لتلقي إما الجهة المانحة أو متقبل غير ضروري. قد تتأثر كثافة مع السكان غير متجانسة، ولكن ينبغي أن يكون لا يزال أكثر من كافية ليتم الكشف. عند تخطيط التجارب، ينبغي أملت اختيار fluorophores من قيمة R 0 من الزوج وكذلك نطاق مسافة المتوقع الذي يتم قياسه. يتم تعريف قيمة R 0 بواسطة المعادلة التالية: <img alt="المعادلة 3" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq3.jpg" width="250" /> مكافئ. 3 حيث R هو نصف قطر 0 فورستر في أنجسترومز، κ 2 هو عامل التوجه بين اثنين من الأصباغ (يفترض عادة أن يكون 2/3)، φ D هو العائد الكم من الجهات المانحة، J هو التداخل الطيفي يتجزأ بين المتبرع طيف الانبعاث والامتصاص الطيف متقبل في M - 1سم -1 4 نانومتر، و n هو معامل الانكسار من الوسط 1. وقد أضاف لدينا المختبر تعديل لأسلوب انتقال البيئي بعيد المدى التقليدية عن طريق إدخال موقع الاعتراف البروتيني بين المواقع التسمية المانحة ومتقبل على البروتين يجري بحثها. هذا التعديل يسمح للتحقيق في النظم غير المنقى مثل خلايا الثدييات كلها 7. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص عند استخدام cysteines كمواقع لوصفها، لأن في عملية وضع العلامات مع الأصباغ maleimide مترافق التي تربط لمجموعات سلفهيدريل السيستين، بروتينات أخرى على الخلايا التي وصفت أيضا cysteines. ومع ذلك، بما في ذلك مواقع الانقسام البروتيني على البروتين من الفائدة وقياس عمر قبل وبعد الانقسام، يمكن للمجرب طرح كميا في إشارة الخلفية بعد انشقاق الأنزيم البروتيني من إشارة الخام. هذا الطرح يعزل إشارة محددة تنشأ من البروتين من الفائدة (الشكللدى عودتهم 2). باستخدام التعديل المذكورة أعلاه، انتقال البيئي بعيد المدى يمكن استخدامها لقياس التغيرات المسافة بين المانحين التيربيوم كلاب والتحقيق متقبل على البروتين، وبالتالي رصد التغيرات متعلق بتكوين في الحالة الفسيولوجية القريب البروتين دون الحاجة لتنقية. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig1highres.jpg" width="500" /> الرقم 1.The في امتصاص الأطياف وانبعاث التيربيوم بالكلاب باللون الأسود، بالإضافة إلى متقبل التمثيلي، اليكسا 488، في الحمراء. لاحظ قمم الانبعاثات متعددة وحادة، وضيق نطاق الانبعاثات لكل ذروة التيربيوم كلاب. هذا النمط يسمح للالتيربيوم ليتم استخدامها مع مجموعة متنوعة من fluorophores المتقبلة ويسهل قياس الانبعاثات توعيتهم ضمن هذه النطاقات حيث يظهر التيربيوم أي انبعاث. ذروة الانبعاثات التيربيوم لفي 486 نانومتر تتداخل بشكل جيد مع ل<html> bsorption ذروة اليكسا 488، والسماح لنقل الطاقة الرنين تحدث بين اثنين fluorophores. والطول الموجي من 515 نانومتر هو خيار ممتاز لكشف الانبعاثات توعيتهم لهذا الزوج كما هو الحال في وادي بين قمم الانبعاثات التيربيوم، وجدا قرب اليكسا 488 في ذروة الانبعاثات من 520 نانومتر. لاحظ أنه يجري بالقرب من ذروة متقبل، على الرغم من المرغوب فيه، ليس مطلوبا-565 نانومتر لا يزال قادرا على كشف اليكسا 488 الانبعاثات أيضا دون الكشف عن الانبعاثات التيربيوم. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="374" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="27"><td height="27" style="height:27px;width:147px;"> fluorophore متقبل </td><td style="width:45px;"> R 0 (Å) </td><td style="width:183px;"> الانبعاثات الطول الموجي (نانومتر) </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:147px;"> أتو 465 </td><td align="right" style="width:45px;"> 36 </td>3PX؛ &quot;&gt; 508 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> فلوريسئين </td><td align="right" style="width:45px;"> 45 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> الكسا 488 </td><td align="right" style="width:45px;"> 46 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> الكسا 680 </td><td align="right" style="width:45px;"> 52 </td><td align="right" style="width:183px;"> 700 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> الكسا 594 </td><td align="right" style="width:45px;"> 53 </td><td align="right" style="width:183px;"> 630 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> الكسا 555 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 565 </td></tr><trارتفاع = &quot;22&quot;&gt; <td height="22" style="height:22px;width:147px;"> و Cy3 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 575 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. قائمة fluorophores المتقبلة تستخدم عادة للانتقال البيئي بعيد المدى باستخدام كلاب التيربيوم كما المتبرع 11. تم قياس R 0 القيم عندما كانت تعلق على المانحة ومتقبل إلى ناهض نطاق ذوبان ملزم لمستقبلات أمبا. وهو مثالي لقياس قيمة R 0 مرة أخرى لكل نظام جديد قيد الدراسة. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. لمحة عامة عن طريقة انتقال البيئي بعيد المدى المعروضة. (A) ومستقبلات أمبا هو بروتين الغشاء الذي يخضع لتغيرات متعلق بتكوين عليه ملزم يجند. يجند ثنائية على شكل محارةوحلقت نطاق الاكتشاف هنا باللون الأحمر. (B) وجود المجال ملزم يجند من أمبا عندما لا بد أن البروتين في التشكل مفتوح (يسار). عندما بد أن يجند الغلوتامات، يغلق البروتين حول يجند لها (يمين). عن طريق وضع fluorophores في مواقع الثبوتية على الائتلاف الحزبي، يمكن أن ينظر إلى طبيعة هذا التغيير متعلق بتكوين والمسافة بين التغييرات fluorophores، والتي سوف ثم تؤثر مضان مدى الحياة. (C) عندما وصفها خلايا بأكملها، قد تحدث وسم كل من البروتين من الفائدة وكذلك بروتينات غشاء الخلفية (يسار). بعد انشقاق الأنزيم البروتيني، فإن إشارة انتقال البيئي بعيد المدى من البروتين من الفائدة تختفي بسبب الافراج عن جزء قابل للذوبان، وترك إشارة الخلفية سليمة (يمين). ويمكن بعد هذا إشارة الخلفية تطرح من إشارة الخام.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1394">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:693px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PV3579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F-150</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10254</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20346</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10256</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20344</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">QuantaMaster 3-SS</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the ms range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">FluoreScan 2.0</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Origin 8.6</td>
			<td style="width:223px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Quartz Cuvette</td>
			<td style="width:223px;">Starna Cells, Inc</td>
			<td style="width:119px;">3-Q-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Stir Bar&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Bel-Art Products</td>
			<td style="width:119px;">F37119-0007</td>
			<td>Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence resonance energy transfer to study conformational changes in membrane proteins expressed in mammalian cells

نقل التلألؤ الرنين الطاقة، أو انتقال البيئي بعيد المدى، هي تقنية قوية تستخدم لقياس المسافات بين موقعين في البروتينات ضمن نطاق مسافة 10-100 Å. عن طريق قياس المسافات تحت مختلف الظروف و ligated، والتغيرات متعلق بتكوين البروتين يمكن تقييمها بسهولة. مع انتقال البيئي بعيد المدى، وهو اللانثينيدات، التيربيوم في معظم الأحيان بالكلاب، ويستخدم في fluorophore المانحة، وتكفل مزايا مثل عمر أطول للمانحين الوحيد الانبعاثات، والمرونة في استخدام fluorophores المتقبلة متعددة، وفرصة للكشف عن انبعاث متقبل توعيتهم وسيلة سهلة لقياس نقل الطاقة دون التعرض لخطر أيضا الكشف عن إشارة المانحة الوحيد. هنا، نحن تصف طريقة لاستخدام انتقال البيئي بعيد المدى على بروتينات غشاء أعرب ويعاير على سطح خلايا الثدييات سليمة. ونحن نقدم موقع البروتيني الانقسام بين الزوج fluorophore انتقال البيئي بعيد المدى. بعد الحصول على إشارة انتقال البيئي بعيد المدى الأصلية، انشقاق في ذلك الموقع بإزالة الإشارة انتقال البيئي بعيد المدى محددة من البروتين لالفائدة مما يسمح لنا لطرح كميا في إشارة الخلفية التي تبقى بعد الانقسام. يسمح هذا الأسلوب لأكثر القياسات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لبذل دون الحاجة لتنقية البروتين.

مقياس انتقال البيئي بعيد المدى الناجح مع المانحين اللانثينيدات ينبغي أن يكون المتبرع مدى الحياة إلا في نطاق الوقت ميلي ثانية واحدة. فإن عمر الانبعاثات انتقال البيئي بعيد المدى لتوعيتهم البروتين المسمى مع كل من الجهات المانحة ومتقبل يكون أبرزها أقصر، مع عمر في نطاق ?...

Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells at JoVE.com

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

نقل التلألؤ الرنين الطاقة لدراسة التغييرات بتكوين جزئي في غشاء البروتينات أعرب في خلايا الثدييات

نحن هنا وصف طريقة التلألؤ تحسين نقل الطاقة الرنين (انتقال البيئي بعيد المدى) حيث نقدم موقع البروتيني الانقسام بين المواقع fluorophore المانحة ومتقبل. هذا التعديل يسمح لنا للحصول على إشارات محددة انتقال البيئي بعيد المدى الناشئة عن بروتينات غشاء الفائدة، والسماح لدراسة البروتينات الغشاء دون تنقية البروتين.

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

تصور البروتينات والمجمعات ضخم الجزيئات التي كتبها EM اللطخة السلبية : من إعداد الشبكة إلى الحصول على الصور

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

والنظام التجريبي لدراسة Mechanotransduction في خلايا رئة الجنين

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

الكمية الحنق (فورستر نقل الطاقة الرنين) تحليل لتحديد حركية SENP1 البروتياز

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

غشاء العمود الفقري: أداة كيميائية حيوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات للبروتينات الغشاء<em&gt; في فيفو</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

الكمي لالعالمي الانبساطي وظيفة عن طريق تحليل يستند النمذجة-الحركية من Transmitral التدفق عبر الشكلية ملء Parametrized الانبساطي

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A Protocol for Using FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer FRET-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

بروتوكول لعن طريق نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) أجهزة الاستشعار لقياس -Force القوات الميكانيكية عبر مجمع ينك النووية

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

تذوب الكتابة اليكتروسبينينج من السقالات Poly(ε-caprolactone) ثلاثي الأبعاد مع مورفولوجيس يمكن السيطرة عليها لتطبيقات هندسة الأنسجة

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

استزراع خلايا الثدييات في السقالات ببتيد ثلاثي الأبعاد

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

المداري تهز ثقافة خلايا الثدييات في السفن على شكل س لإنتاج المجاميع الموحدة

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

توصيف التغيرات التشكيلية أحادية الجزيء تحت تدفق القص مع المجهر الفلوري

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...