Name: real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled bdnf in primary neurons
Uploaded: 2014-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons at JoVE.com

Nous tenons à remercier Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit pour leur assistance technique. L&#39;étude est soutenue par de subvention du NIH (PN2 EY016525) et par le financement de la recherche et du syndrome de Down Treatment Foundation et la Fondation Larry L. Hillblom.

Les interventions chirurgicales et animales sont réalisées dans le strict respect de la NIH Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les expériences impliquant l&#39;utilisation d&#39;animaux sont approuvés par l&#39;UCSD institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité. 1. plasmide de clonage, expression et purification de Mono-biotinylé BDNF (mBtBDNF) REMARQUE: construire pré-proBDNFavi et BirA ADNc dan...

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	<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+dynein-microtubule+network+is+required+for+NGF+signaling+through+the+Rap1/MAPK+pathway.">A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway.</a> Traffic. 8, 1503-1520 (2007).</li><li>Wortzel, I., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ERK+Cascade:+Distinct+Functions+within+Various+Subcellular+Organelles.">The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles.</a> Genes &amp; cancer. 2, 195-209 (2011).</li><li>Huang, E. J., Reichardt, L. 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C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-induced+internalization+of+the+p75+neurotrophin+receptor:+a+slow+route+to+the+signaling+endosome.">Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).</li><li>Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. 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J., Tonegawa, S., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+over-expression+in+the+forebrain+ameliorates+Huntington's+disease+phenotypes+in+mice.">Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice.</a> Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).</li><li>Gauthier, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+controls+neurotrophic+support+and+survival+of+neurons+by+enhancing+BDNF+vesicular+transport+along+microtubules.">Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules.</a> Cell. 118, 127-138 (2004).</li><li>Her, L. S., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+of+striatal+neurons+to+axonal+transport+defects+induced+by+mutant+huntingtin.">Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).</li><li>Rong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+intracellular+trafficking+of+huntingtin-associated+protein-1+is+critical+for+TrkA+protein+levels+and+neurite+outgrowth.">Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).</li></ol>

Dans cette étude, nous rapportons le développement d&#39;une nouvelle technique pour produire biologiquement active, monobiotinylé BDNF (mBtBDNF) qui peut être utilisé pour tracer le transport axonal de BDNF. En conjuguant la protéine de quantum dot de la streptavidine, et en utilisant une chambre microfluidique, le procédé permet de détecter le transport axonal de BDNF dans les neurones primaires avec sensibilité molécule unique, en temps réel et avec une résolution spatiale et temporelle. Les outils utili...

Les neurones sont des cellules dont la très processus long et souvent très élaborés sont fondamentales pour établir et maintenir la structure et la fonction des circuits neuronaux polarisés. L&#39;axone joue un rôle essentiel dans le transport de cargaisons à destination et à partir de synapses. Les protéines et organites synthétisés dans le corps cellulaire doivent être transportés à travers les axones pour atteindre la terminaison présynaptique pour soutenir la fonction neuronale. De même, les signaux reçus à axones distaux doivent être transduites et transmis au soma. Ces processus sont essentiels pour la survie neuronale, la différenciation et la maintenance. Dans ce transport axonal dans certains neurones doit être effectuée sur des distances de plus de 1 000 fois le diamètre du corps de la cellule, la possibilité est envisagée facilement que même de petites déficits pourraient avoir une incidence nettement la fonction neuronale et circuit. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), un membre de la famille des neurotrophines de facteurs de croissance, est présent en marégions du cerveau ny, y compris l&#39;hippocampe, le cortex cérébral, et cerveau antérieur basal. BDNF joue un rôle crucial dans la cognition et la mémoire formation en soutenant la survie, la différenciation et la fonction des neurones qui participent à des circuits cognitifs. BDNF se lie à son récepteur, le TrkB tyrosine kinase, à la terminaison axonale où il active les voies de signalisation TrkB médiée dont le mitogène protéine kinase activée / extracellulaire de la protéine kinase régulée par un signal (MAPK / ERK), le phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) et la phospholipase C-gamma (PLCy). Les protéines qui participent à ces voies de signalisation sont conditionnés sur des structures vésiculaires endocytose pour former l&#39;endosome 1-6, qui sont ensuite transportées de façon rétrograde vers le soma neuronal signalisation BDNF / TrkB. La chambre de culture microfluidique est une plate-forme très utile pour étudier la biologie des axones dans les conditions normales, ainsi que dans le cadre des lésions et des maladies 7,8. Par isoler les axonesde corps cellulaires, le dispositif a permis d&#39;étudier un transport spécifiquement dans les axones 8-10. Les plates-formes microfluidiques PDMS base avec 450 um barrières microsillons utilisées dans cette étude ont été achetés dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Pour d&#39;étudier le transport du BDNF, nous avons développé une nouvelle technologie pour produire monobiotinylé BDNF (mBtBDNF). Nous avons profité du peptide biotine accepteur, AP (également connu sous le nom AviTag). Il s&#39;agit d&#39;une séquence d&#39;acides 15 aminés qui contient un résidu de lysine qui peut être spécifiquement lié à un par la biotine ligase coli Escherichia enzyme biotine, BirA. Nous avons fusionné la AviTag à l&#39;extrémité C-terminale de la souris pré-proBDNF ADNc par PCR (figure 1A). La construction a été clonée dans le vecteur d&#39;expression de mammifère, pcDNA3.1-myc son vecteur. Nous avons également cloné l&#39;ADN BirA bactérienne dans le pCDNA3.1 myc son vecteur. Les deux plasmides ont été transitoirement co-transfectées dans des cellules HEK293FT d&#39;exprimer les deux protéines. BirA catalysé la ligature de Bioten particulier de la lysine résident dans le AviTag à l&#39;extrémité C-terminale de BDNF dans un rapport de 1: 1 pour produire monobiotinylé monomère BDNF. Biotinylé, BDNF matures avec une masse moléculaire de ~ 18 kDa a été récupéré et purifié à partir du support à l&#39;aide de résine Ni-(Figure 1C). La biotinylation du BDNF a été terminée, comme jugé par l&#39;incapacité à détecter BDNF non modifié par immunoblot (Figure 1D). Streptavidine points quantiques conjugués, QD 655, ont été utilisés pour étiqueter mBtBDNF faire QD-BDNF. La présence de la AviTag n&#39;interfère pas avec l&#39;activité de BDNF comme le mBtBDNF était capable d&#39;activer TrkB phosphorylée (figure 1E) et de stimuler la croissance des neurites (figure 1F), dans la mesure du BDNF humain recombinant (rhBDNF). Immunocoloration montré que QD-BDNF colocalisé avec TrkB dans les axones de l&#39;hippocampe, ce qui indique que QD-BDNF est bioactif (figure 1G). Pour étudier le transport du BDNF, QD-BDNF a été ajouté à distale compartiment axone d&#39;cultures microfluidiques contenant rat E18 neurones de l&#39;hippocampe (figure 2A). QD-BDNF transport rétrograde dans les axones a été capturé par imagerie en temps réel en direct de l&#39;étiquette fluorescente rouge (Soutien vidéos de S1, S2). En analysant le produit kymographe, QD-BDNF a été observée pour être transportée de manière rétrograde, à une vitesse de l&#39;ordre de 1,06 um / sec (figure 3A) en mouvement. GFP ou mCherry étiqueté BDNF ont été utilisés pour suivre le mouvement des axones de BDNF. Les principaux inconvénients sont qu&#39;ils ne sont pas assez brillant pour les études de molécules uniques. En outre, la présence à la fois antérograde et rétrograde BDNF mouvements, il est difficile d&#39;évaluer si oui ou non le BDNF a été transportée de manière rétrograde dans un complexe neurotrophine / récepteur. Dans cette vidéo, nous démontrons les techniques utilisées pour examiner le trafic en direct de QD-BDNF dans des chambres microfluidiques utilisant neurones primaires. Le ultrabrightness et une excellente photostabilité de points quantiques makes permettant d&#39;effectuer un suivi à long terme du transport du BDNF. Ces techniques peuvent être exploitées pour améliorer les études de la fonction axonale dans AD, HD, et d&#39;autres maladies neurodégénératives.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="641">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:261px;">Name</td>
			<td style="width:205px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platinum pfx DNA polymerase&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11708021</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EcoRI&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>FD0274</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BamHI&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>FD0054</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293FT cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM-high glucose media</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-013-CV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">d-biotin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TurboFect&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>R0531</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6279</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ni-NTA resins</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S8820</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">silver staining kit&#160;</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant BDNF</td>
			<td>Genentech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microfluidic chambers</td>
			<td>Xona</td>
			<td>SND450</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24x40 mm No. 1 glass coverslips&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-060</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">poly-L-Lysine&#160;</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3438-100-01</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B27&#160;&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QD655-streptavidin conjugates</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;Q10121MP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Avi tag antibody</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>A00674</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">streptavidin-agarose beads&#160;</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>&#160;SA100-04</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6399</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRP-streptavidin&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-pTrkB antibody</td>
			<td colspan="2">a generous gift from Dr M. Chao of NYU</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-TrkB antibody</td>
			<td>BD Science</td>
			<td>610101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled bdnf in primary neurons

BDNF joue un rôle important dans plusieurs aspects de la survie neuronale, la différenciation et la fonction. Les déficits structurels et fonctionnels dans les axones sont de plus en plus considérés comme une caractéristique précoce des maladies neurodégénératives, dont la maladie d&#39;Alzheimer (MA) et la maladie de Huntington (HD). Ne sait pas encore, c&#39;est le mécanisme (s) par lequel des lésions axonales est induite. Nous avons signalé le développement d&#39;une nouvelle technique pour produire biologiquement active, monobiotinylé BDNF (mBtBDNF) qui peut être utilisé pour tracer le transport axonal de BDNF. Quantum dot marqué BDNF (QD-BDNF) a été produit par la conjugaison de points quantiques 655 à mBtBDNF. Un dispositif microfluidique a été utilisé pour isoler les axones des corps cellulaires des neurones. Ajout de QD-BDNF dans le compartiment axonal permis imagerie en temps réel du transport du BDNF dans les axones. Nous avons démontré que QD-BDNF déplacé essentiellement exclusivement rétrograde, avec très peu de pauses, à une vitesse de l&#39;ordre de 1,06 um / s en mouvement. Ce système peut être utilisé pour enquêter sur moicanismes de la fonction axonale perturbé dans AD ou HD, ainsi que d&#39;autres maladies dégénératives.

Production et purification de biologiquement active BDNF Mono-biotinylé Le vecteur d&#39;expression de BDNF fusionnée avec une séquence AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) a été réalisé selon un protocole précédemment publié 10. La masse moléculaire de la protéine de fusion pleine longueur a été prévue pour être ~ 32 kDa ( <a href="http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html" target="_blank">http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html</a> ) monobiotinylé BDNF mûr avec une masse m...

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Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Le transport axonal de BDNF, un facteur neurotrophique, est essentiel pour la survie et la fonction de plusieurs populations neuronales. Certaines maladies dégénératives sont marqués par la rupture de la structure et de la fonction axonale. Nous avons démontré les techniques utilisées pour examiner le trafic en direct de QD-BDNF dans des chambres microfluidiques utilisant neurones primaires.

Imagerie en temps réel des axonale Transport de Quantum Dot marqué BDNF dans les neurones primaires

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Research

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