Name: real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled bdnf in primary neurons
Uploaded: 2014-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons at JoVE.com

Wir möchten Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit für ihre technische Unterstützung danken. Die Studie wird von NIH (PN2 EY016525) und durch die Finanzierung von Down-Syndrom-Forschung und Behandlung-Stiftung und der Larry L. Hillblom Stiftung.

Chirurgische und Tierverfahren werden streng nach dem NIH-Führer für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Alle Experimente, die die Verwendung der Tiere werden von UCSD Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. 1. Plasmid Klonierung, Expression und Reinigung von Mono-biotinyliert BDNF (mBtBDNF) HINWEIS: Konstruieren Sie vor-und proBDNFavi BirA cDNA in pcDNA3.1-Vektor und coexprimieren in HEK293FT Zellen 10. Reinigen mBt...

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	<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+dynein-microtubule+network+is+required+for+NGF+signaling+through+the+Rap1/MAPK+pathway.">A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway.</a> Traffic. 8, 1503-1520 (2007).</li><li>Wortzel, I., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ERK+Cascade:+Distinct+Functions+within+Various+Subcellular+Organelles.">The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles.</a> Genes &amp; cancer. 2, 195-209 (2011).</li><li>Huang, E. J., Reichardt, L. 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T., Yang, J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+producing+mono-biotinylated,+biologically+active+neurotrophic+factors:+an+essential+reagent+for+single+molecule+study+of+axonal+transport.">A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport.</a> Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).</li><li>Tani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+a+ligand-receptor+complex+on+the+growth+cones+as+an+essential+step+for+the+uptake+of+nerve+growth+factor+at+the+distal+end+of+the+axon:+a+single-molecule+analysis.">Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).</li><li>Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-induced+internalization+of+the+p75+neurotrophin+receptor:+a+slow+route+to+the+signaling+endosome.">Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).</li><li>Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. 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J., Tonegawa, S., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+over-expression+in+the+forebrain+ameliorates+Huntington's+disease+phenotypes+in+mice.">Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice.</a> Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).</li><li>Gauthier, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+controls+neurotrophic+support+and+survival+of+neurons+by+enhancing+BDNF+vesicular+transport+along+microtubules.">Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules.</a> Cell. 118, 127-138 (2004).</li><li>Her, L. S., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+of+striatal+neurons+to+axonal+transport+defects+induced+by+mutant+huntingtin.">Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).</li><li>Rong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+intracellular+trafficking+of+huntingtin-associated+protein-1+is+critical+for+TrkA+protein+levels+and+neurite+outgrowth.">Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).</li></ol>

In dieser Studie wurde die Entwicklung einer neuen Technik berichten wir produzieren biologisch aktiven, monobiotinylierte BDNF (mBtBDNF), die verwendet werden können, um den axonalen Transport von BDNF verfolgen. Durch Konjugieren des Proteins Quantenpunkt Streptavidin, und unter Verwendung eines Mikrofluidkammer ermöglicht das Verfahren eine bis axonalen Transport von BDNF in primären Neuronen mit Einzelmolekülempfindlichkeit, in Echtzeit und mit räumlichen und zeitlichen Auflösung zu erfassen. Die hier verwende...

Neuronen sind stark polarisiert Zellen, deren lange und oft sehr ausgearbeiteten Prozesse sind von grundlegender Bedeutung für den Aufbau und die Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion neuronaler Schaltkreise. Das Axon spielt eine wichtige Rolle bei der Durchführung Ladungen zu und von Synapsen. Proteine ​​und Organellen in der Zelle synthetisiert Soma müssen durch Axone transportiert werden, um die präsynaptischen Terminal zu erreichen, um neuronale Funktion unterstützen. Entsprechend empfangenen Signale an distalen Axone müssen transduziert werden und zu der Soma. Diese Verfahren sind für das neuronale Überleben, Differenzierung und Wartung. Dadurch axonalen Transport in manchen Neuronen müssen über Entfernungen mehr als 1000-mal der Durchmesser des Zellkörpers durchgeführt werden, ist die Möglichkeit, ohne weiteres vorstellbar, dass auch kleine Mängel konnten deutlich beeinflussen und neuronalen Schaltungsfunktion. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), ein Mitglied der Neurotrophin-Familie von Wachstumsfaktoren in mA vorliegtny Hirnregionen, einschließlich Hippocampus, Großhirnrinde und des basalen Vorderhirns. BDNF spielt eine entscheidende Rolle bei der Wahrnehmung und Gedächtnis-Bildung durch Unterstützung des Überlebens, der Differenzierung und der Funktion von Nervenzellen, die in der kognitiven Schaltungen teilzunehmen. BDNF an seinen Rezeptor bindet, der Tyrosinkinase TrkB am Axonendigung wo es aktiviert TrkB-vermittelte Signalwege, einschließlich der Mitogen-aktivierte Proteinkinase / extrazelluläre Signal-regulierte Proteinkinase (MAPK / ERK), Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) und Phospholipase C-gamma (PLC &amp; ggr). Die Proteine, die in diesen Signalwegen beteiligt sind, auf endozytischen vesikulären Strukturen verpackt, um das BDNF / TrkB Signal Endosomen 1-6, die dann retrograd in die neuronalen Soma transportiert zu bilden. Mikrofluidische Kulturkammer ist eine sehr nützliche Plattform für die Untersuchung der Biologie axonalen unter normalen Bedingungen als auch bei der Einstellung von Verletzungen und Krankheits 7,8. Durch die Isolierung Axoneaus den Zellkörpern, hat das Gerät darf man speziell in Transport Axone 8-10 studieren. Die PDMS basiert mikrofluidische Plattformen mit 450 um Mikronut Barrieren in dieser Studie verwendet wurden kommerziell erworben (siehe Materialien Tabelle). BDNF Transport zu untersuchen, entwickelten wir eine neuartige Technologie, um monobiotinylierte BDNF (mBtBDNF) zu erzeugen. Wir nutzten die Biotin-Akzeptor-Peptid, AP (auch als AviTag bekannt). Es ist ein 15-Aminosäuresequenz, die einen Lysinrest, der spezifisch an Biotin durch den Escherichia coli-Enzym-Biotin-Ligase BirA ligiert werden kann, enthält. Fusionierten wir die AviTag an den C-Terminus der Maus pre-proBDNF cDNA durch PCR (Abbildung 1a). Das Konstrukt wurde in den Säuger-Expressionsvektor pcDNA3.1 myc-His-Vektor kloniert. Wir geklont auch die bakterielle DNA in die BirA pcDNA3.1 myc-Vektor sein. Die beiden Plasmide wurden transient in HEK293FT Zellen co-transfiziert, um beide Proteine ​​exprimieren. BirA katalysiert die Ligation von Biotin spezifisch an das Lysin liegen im AviTag am C-Terminus von BDNF in einem Verhältnis 1: 1 bis monobiotinylierte BDNF-Monomers. Biotinylierte, reifen BDNF mit einer Molekularmasse von ~ 18 kDa wurde gewonnen und aus den Medien unter Verwendung von Ni-Harz (1C) gereinigt. Die Biotinylierung von BDNF war vollständig, wie durch die Unfähigkeit beurteilt unmodifizierten BDNF durch Immunoblotting (Figur 1D) zu erfassen. Streptavidin konjugierten Quantenpunkte, QD 655, wurden verwendet, um zu kennzeichnen, um mBtBDNF QD-BDNF zu machen. Die Anwesenheit des AviTag nicht mit der Aktivität von BDNF stören die mBtBDNF konnte phosphorylierten TrkB (1E) zu aktivieren und stimulieren das Neuritenwachstum (1F), um das Ausmaß des rekombinanten menschlichen BDNF (rhBDNF). Immunfärbung gezeigt, dass QD-BDNF kolokalisiert mit TrkB in Hippocampus-Axone, die anzeigt, dass QD-BDNF bioaktiv (1G). Um die BDNF Transport zu untersuchen, wurde QD-BDNF zu distalen Axon Fach hinzugefügtMikrofluidik-Kulturen mit Rattenhippocampusneuronen E18 (2A). QD-BDNF retrograden Transport in Axonen wurde von Echtzeit-Live-Bildgebung des roten Fluoreszenzmarkierung (Trag Videos S1, S2) erfasst. Durch die Analyse der erzeugten kymograph, QD-BDNF beobachtet wurde retrograd mit einer Bewegungsgeschwindigkeit von 1,06 um / s (3A) transportiert werden. GFP oder mCherry-markierten BDNF wurden zur axonalen Bewegung von BDNF zu verfolgen. Die Hauptnachteile sind, dass sie nicht hell genug für Einzelmolekülstudien. Auch die Gegenwart von sowohl anterograden und retrograden BDNF Bewegungen macht es schwierig, zu beurteilen, ob die retrograd transportiert BDNF war in einem Neurotrophin / Rezeptor-Komplex. In diesem Video zeigen wir die Techniken verwendet, um Live-Handel mit QD-BDNF in mikrofluidischen Kammern mit primären Neuronen zu untersuchen. Die ultrabrightness und ausgezeichnete Photoquantenpunkte makes es möglich, langfristige Verfolgung von BDNF Transport durchzuführen. Diese Techniken können genutzt werden, um Studien der axonalen Funktion in AD, HD, und andere neurodegenerative Erkrankungen zu verbessern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="641">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:261px;">Name</td>
			<td style="width:205px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platinum pfx DNA polymerase&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11708021</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EcoRI&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>FD0274</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BamHI&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>FD0054</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293FT cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM-high glucose media</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-013-CV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">d-biotin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TurboFect&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>R0531</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6279</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ni-NTA resins</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S8820</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">silver staining kit&#160;</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant BDNF</td>
			<td>Genentech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microfluidic chambers</td>
			<td>Xona</td>
			<td>SND450</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24x40 mm No. 1 glass coverslips&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-060</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">poly-L-Lysine&#160;</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3438-100-01</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B27&#160;&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QD655-streptavidin conjugates</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;Q10121MP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Avi tag antibody</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>A00674</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">streptavidin-agarose beads&#160;</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>&#160;SA100-04</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6399</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRP-streptavidin&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-pTrkB antibody</td>
			<td colspan="2">a generous gift from Dr M. Chao of NYU</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-TrkB antibody</td>
			<td>BD Science</td>
			<td>610101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled bdnf in primary neurons

BDNF spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen Facetten neuronale Überleben, Differenzierung und Funktion. Strukturelle und funktionelle Defizite der Axone werden zunehmend als eine frühe Funktion von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit (AD) und Huntington-Krankheit (HD) angesehen. Noch unklar ist der Mechanismus (en), durch die axonale Verletzung induziert wird. Wir berichteten über die Entwicklung einer neuen Technik zur Herstellung von biologisch aktiven, monobiotinylierte BDNF (mBtBDNF), die verwendet werden können, um den axonalen Transport von BDNF verfolgen. Quantenpunkt-markierten BDNF (QD-BDNF) wurde durch Konjugation Quantenpunkt 655 bis mBtBDNF produziert. Eine mikrofluidische Vorrichtung wurde verwendet, um die Axone von Neuronen Zellkörper zu isolieren. Zugabe von QD-BDNF auf die axonalen Fach erlaubt die Live-Darstellung von BDNF Transport in Axonen. Wir zeigten, dass QD-BDNF retrograd bewegt wesentlichen ausschließlich mit wenigen Pausen, bei einer Bewegungsgeschwindigkeit von 1,06 um / s herzustellen. Dieses System kann verwendet werden, um mich zu untersuchennismen der axonalen Funktion gestört in AD oder HD, wie auch andere degenerative Erkrankungen.

Herstellung und Reinigung von biologisch aktiven Mono-biotinylierten BDNF Der Expressionsvektor der BDNF mit einer AviTag Sequenz (GGGLNDIFEAQKIEWHE) fusioniert wurde nach einem früher veröffentlichten Protokoll 10 erstellt. Die Molekularmasse des vollständigen Fusionsprotein wurde vorhergesagt ~ 32 kDa ( <a href="http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html" target="_blank">http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html</a> ) monobiotinyliertes reifen BDNF mit einer vorhergesagten Molekü...

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Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Axonalen Transport von BDNF, einem neurotrophen Faktor, ist entscheidend für das Überleben und die Funktion von verschiedenen Neuronenpopulationen. Einige degenerativen Erkrankungen werden durch Störungen des axonalen Struktur und Funktion markiert. Wir haben gezeigt, die Techniken verwendet, um Live-Handel mit QD-BDNF in mikrofluidischen Kammern mit primären Neuronen zu untersuchen.

Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Mechanische Manipulation von Neuronen zu Axonal Entwicklungssteuerung

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

Ein Protokoll für die Verwaltung von Real-Time-fMRT Neurofeedback Training

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Assay zur Messung des nukleozytoplasmatischen Transports in Echtzeit in motorischen Neuronen-ähnlichen NSC-34-Zellen

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Axonaler Transport von Organellen in Motorneuronenkulturen mit Mikrofluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...