Name: real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled bdnf in primary neurons
Uploaded: 2014-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons at JoVE.com

हम उनके तकनीकी सहायता के लिए यू (पॉलीन) हू, राहेल Sinit धन्यवाद देना चाहूंगा. अध्ययन एनआईएच अनुदान (PN2 EY016525) द्वारा और डाउन सिंड्रोम अनुसंधान और उपचार फाउंडेशन और लैरी एल Hillblom फाउंडेशन से धन के द्वारा समर्थित है.

शल्य चिकित्सा और पशु प्रक्रियाओं की देखभाल के लिए एनआईएच गाइड करने के लिए और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग अनुसार कड़ाई से बाहर किया जाता है. जानवरों के उपयोग से जुड़े सभी प्रयोगों UCSD संस्थागत पशु की देखभा...

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	<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+dynein-microtubule+network+is+required+for+NGF+signaling+through+the+Rap1/MAPK+pathway.">A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway.</a> Traffic. 8, 1503-1520 (2007).</li><li>Wortzel, I., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ERK+Cascade:+Distinct+Functions+within+Various+Subcellular+Organelles.">The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles.</a> Genes &amp; cancer. 2, 195-209 (2011).</li><li>Huang, E. J., Reichardt, L. 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C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-induced+internalization+of+the+p75+neurotrophin+receptor:+a+slow+route+to+the+signaling+endosome.">Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).</li><li>Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. 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J., Tonegawa, S., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+over-expression+in+the+forebrain+ameliorates+Huntington's+disease+phenotypes+in+mice.">Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice.</a> Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).</li><li>Gauthier, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+controls+neurotrophic+support+and+survival+of+neurons+by+enhancing+BDNF+vesicular+transport+along+microtubules.">Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules.</a> Cell. 118, 127-138 (2004).</li><li>Her, L. S., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+of+striatal+neurons+to+axonal+transport+defects+induced+by+mutant+huntingtin.">Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).</li><li>Rong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+intracellular+trafficking+of+huntingtin-associated+protein-1+is+critical+for+TrkA+protein+levels+and+neurite+outgrowth.">Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).</li></ol>

इस अध्ययन में, हम जैविक रूप से सक्रिय निर्माण करने के लिए एक उपन्यास तकनीक के विकास रिपोर्ट, BDNF की axonal परिवहन पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि BDNF (mBtBDNF) monobiotinylated. क्वांटम डॉट streptavidin के लिए प्रोटीन conjugating, औ...

न्यूरॉन्स अत्यधिक जिसका लंबी और अक्सर अत्यधिक सविस्तार प्रक्रियाओं की स्थापना और तंत्रिका सर्किट की संरचना और समारोह को बनाए रखने के लिए मौलिक हैं कोशिकाओं ध्रुवीकरण कर रहे हैं. अक्षतंतु को और synapses से कार्गो को ले जाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. सेल सोमा में संश्लेषित प्रोटीन और organelles न्यूरोनल समारोह का समर्थन करने के प्रीसानेप्टिक टर्मिनल तक पहुंचने के लिए एक्सोन के माध्यम से ले जाया जाना चाहिए. तदनुसार, संकेत बाहर का axons transduced करने की आवश्यकता पर प्राप्त किया और सोमा को अवगत करा दिया. इन प्रक्रियाओं neuronal अस्तित्व, भेदभाव, और रखरखाव के लिए आवश्यक हैं. कुछ न्यूरॉन्स में कि axonal परिवहन दूरी के माध्यम से 1,000 से अधिक बार सेल शरीर के व्यास का आयोजन किया जाना चाहिए, संभावना आसानी से भी छोटे घाटा स्पष्ट रूप से neuronal और सर्किट समारोह को प्रभावित कर सकता है कि कल्पना की है. मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक (BDNF), वृद्धि कारकों के neurotrophin परिवार के एक सदस्य, एमए में मौजूद हैहिप्पोकैम्पस, प्रमस्तिष्क प्रांतस्था, और बेसल अग्रमस्तिष्क सहित NY मस्तिष्क क्षेत्रों,. BDNF संज्ञानात्मक सर्किट में भाग लेने कि न्यूरॉन्स के अस्तित्व, भेदभाव, और समारोह का समर्थन करके अनुभूति और स्मृति गठन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. BDNF यह माइटोजन सक्रिय प्रोटीन काइनेज / बाह्य संकेत विनियमित प्रोटीन kinase (MAPK / ERK), phosphatidylinositol-3-kinase सहित TrkB की मध्यस्थता संकेत दे रास्ते सक्रिय है जहां अक्षतंतु टर्मिनल पर, अपने रिसेप्टर, tyrosine kinase TrkB को बांध (PI3K) और phospholipase सी गामा (PLCγ). इन संकेत दे रास्ते में भाग लेने कि प्रोटीन तो प्रतिगमनपूर्वक न्यूरोनल सोमा लिए ले जाया जाता है कि endosome 1-6 संकेत BDNF / TrkB के लिए फार्म endocytic vesicular संरचनाओं पर पैक कर रहे हैं. microfluidic संस्कृति कक्ष सामान्य परिस्थितियों के साथ ही चोट और बीमारी 7,8 की सेटिंग में axonal जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक बहुत ही उपयोगी मंच है. अलग axons द्वारासेल शरीर से, युक्ति axons 8-10 में विशेष रूप से परिवहन अध्ययन करने के लिए एक की अनुमति दी है. इस अध्ययन में इस्तेमाल 450 माइक्रोन microgroove बाधाओं के साथ PDMS आधारित microfluidic प्लेटफार्मों व्यावसायिक रूप से (सामग्री तालिका देखें) खरीदे थे. BDNF परिवहन की जांच करने के लिए, हम monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) का उत्पादन करने के लिए एक उपन्यास प्रौद्योगिकी विकसित की है. हम (भी AviTag के रूप में जाना जाता है) बायोटिन स्वीकर्ता पेप्टाइड, एपी का फायदा उठाया. यह विशेष रूप से Escherichia कोलाई एंजाइम बायोटिन ligase, बीरा द्वारा एक बायोटिन को ligated जा सकता है कि एक लाइसिन अवशेषों जिसमें एक 15 अमीनो एसिड अनुक्रम है. हम पीसीआर (चित्रा 1 ए) द्वारा माउस पूर्व proBDNF सीडीएनए की सी टर्मिनस तक AviTag जुड़े. निर्माण स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर, pcDNA3.1 MYC-उसकी वेक्टर में क्लोन किया गया था. हम भी pcDNA3.1 MYC-उसकी वेक्टर में बैक्टीरियल बीरा डीएनए क्लोन. दो plasmids क्षणिक दोनों प्रोटीन व्यक्त करने HEK293FT कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट सह रहे थे. बीरा Biot के बंधाव उत्प्रेरितविशेष रूप से लाइसिन करने के लिए एक 1 पर BDNF की सी टर्मिनस पर AviTag भीतर रहते में: 1 अनुपात BDNF मोनोमर monobiotinylated निर्माण करने के लिए. Biotinylated, ~ 18 केडीए के एक आणविक जन के साथ BDNF परिपक्व बरामद और नी राल (चित्रा 1C) का उपयोग करते हुए मीडिया से शुद्ध किया गया था. (चित्रा -1) Immunoblotting द्वारा असंशोधित BDNF का पता लगाने में असमर्थता द्वारा न्याय के रूप में BDNF की biotinylation, पूरा हो गया था. Streptavidin संयुग्मित क्वांटम डॉट्स, QD 655, QD-BDNF बनाने के लिए mBtBDNF लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया. mBtBDNF phosphorylated TrkB (चित्रा 1E) को सक्रिय करने और पुनः संयोजक मानव BDNF (rhBDNF) की सीमा तक neurite परिणाम (चित्रा 1F) को प्रोत्साहित करने में सक्षम था के रूप में AviTag की उपस्थिति BDNF की गतिविधि के साथ हस्तक्षेप नहीं किया. QD-BDNF QD-BDNF bioactive (चित्रा 1G) का संकेत है कि, हिप्पोकैम्पस axons में TrkB साथ colocalized पता चला है कि immunostaining. BDNF परिवहन अध्ययन करने के लिए, QD-BDNF के बाहर का अक्षतंतु डिब्बे में जोड़ा गयाचूहे E18 hippocampal न्यूरॉन्स (2A चित्रा) युक्त microfluidic संस्कृतियों. Axons भीतर QD-BDNF प्रतिगामी परिवहन लाल फ्लोरोसेंट टैग (सहायक वीडियो S1, S2) के वास्तविक समय रहते इमेजिंग द्वारा कब्जा कर लिया था. उत्पन्न kymograph विश्लेषण करके, QD-BDNF के आसपास 1.06 माइक्रोन / सेक (चित्रा 3) की एक चलती वेग में प्रतिगमनपूर्वक जाया जाएगा मनाया गया. GFP या mCherry टैग BDNF BDNF की axonal आंदोलन को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. प्रमुख कमियां वे एक अणु के अध्ययन के लिए काफी उज्ज्वल नहीं हो रहे हैं. इसके अलावा, दोनों अग्रगामी और प्रतिगामी BDNF आंदोलनों की उपस्थिति यह मुश्किल प्रतिगमनपूर्वक जाया BDNF एक neurotrophin / रिसेप्टर परिसर में किया गया था या नहीं, का मूल्यांकन करने के लिए बनाता है. इस वीडियो में, हम प्राथमिक न्यूरॉन्स का उपयोग microfluidic कक्षों में QD-BDNF का जीना तस्करी की जांच करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक का प्रदर्शन. ultrabrightness और क्वांटम डॉट्स पहुंच के उत्कृष्ट photostabilityतों यह संभव BDNF परिवहन के लंबी अवधि के प्रदर्शन पर नज़र रखने के लिए. इन तकनीकों में ई, HD, और अन्य neurodegenerative विकारों में axonal समारोह के अध्ययन को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="641">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:261px;">Name</td>
			<td style="width:205px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platinum pfx DNA polymerase&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11708021</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EcoRI&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>FD0274</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BamHI&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>FD0054</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293FT cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM-high glucose media</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-013-CV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">d-biotin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TurboFect&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>R0531</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6279</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ni-NTA resins</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S8820</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">silver staining kit&#160;</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant BDNF</td>
			<td>Genentech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microfluidic chambers</td>
			<td>Xona</td>
			<td>SND450</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24x40 mm No. 1 glass coverslips&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-060</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">poly-L-Lysine&#160;</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3438-100-01</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B27&#160;&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QD655-streptavidin conjugates</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;Q10121MP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Avi tag antibody</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>A00674</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">streptavidin-agarose beads&#160;</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>&#160;SA100-04</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6399</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRP-streptavidin&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-pTrkB antibody</td>
			<td colspan="2">a generous gift from Dr M. Chao of NYU</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-TrkB antibody</td>
			<td>BD Science</td>
			<td>610101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled bdnf in primary neurons

BDNF neuronal अस्तित्व, भेदभाव, और समारोह के कई पहलुओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. Axons में संरचनात्मक और कार्यात्मक घाटा तेजी से अल्जाइमर रोग (ई) और हंटिंग्टन रोग (एचडी) सहित neurodegenerative रोगों, का एक प्रारंभिक सुविधा के रूप में देखा जाता है. अभी तक यह स्पष्ट नहीं axonal चोट प्रेरित है जिसके द्वारा तंत्र (एस) है. हम जैविक रूप से सक्रिय निर्माण करने के लिए एक उपन्यास तकनीक के विकास की सूचना दी, BDNF की axonal परिवहन पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि BDNF (mBtBDNF) monobiotinylated. क्वांटम डॉट लेबल BDNF (G-BDNF) mBtBDNF क्वांटम डॉट 655 conjugating द्वारा तैयार की गई थी. एक microfluidic डिवाइस न्यूरॉन सेल शरीर से axons अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. Axonal डिब्बे में QD-BDNF के अलावा axons में BDNF परिवहन के लाइव इमेजिंग की अनुमति दी. हम QD-BDNF के आसपास 1.06 माइक्रोन / सेकंड की एक चलती वेग में, बहुत कुछ pauses के साथ, प्रतिगमनपूर्वक अनिवार्य रूप से विशेष रूप से ले जाया गया है कि प्रदर्शन किया. इस प्रणाली मुझे जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैई या HD में बाधित axonal समारोह है, साथ ही अन्य अपक्षयी विकारों के chanisms.

उत्पादन और जैविक रूप से सक्रिय मोनो biotinylated BDNF का शोधन एक AviTag अनुक्रम (GGGLNDIFEAQKIEWHE) के साथ जुड़े हुए BDNF की अभिव्यक्ति वेक्टर एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 10 के अनुसार बनाया गया था. पूरी लंबाई संलयन प्र?...

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Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF, एक neurotrophic कारक, की axonal परिवहन कई neuronal आबादी के अस्तित्व और समारोह के लिए महत्वपूर्ण है. कुछ अपक्षयी विकार axonal संरचना और समारोह के विघटन से चिह्नित कर रहे हैं. हम प्राथमिक न्यूरॉन्स का उपयोग microfluidic कक्षों में QD-BDNF का जीना तस्करी की जांच करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक का प्रदर्शन किया.

क्वांटम के Axonal परिवहन की वास्तविक समय इमेजिंग प्राथमिक न्यूरॉन्स में BDNF डॉट लेबल

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

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The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

मस्तिष्क स्लाइस में और प्राथमिक सेल संस्कृति में पिरामिड न्यूरॉन्स की बैलिस्टिक लेबलिंग

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

माइक्रोफ्लूइडिक चैम्बर्स सिस्टम का उपयोग करके मोटर न्यूरॉन संस्कृतियों में ऑर्गेनेल्स का एक्सोनल परिवहन

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...