Name: real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled bdnf in primary neurons
Uploaded: 2014-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit por sua assistência técnica. O estudo foi financiado pelo NIH concessão (PN2 EY016525) e pelo financiamento da Síndrome de Down Research Foundation e Tratamento eo Larry L. Fundação Hillblom.

Os procedimentos cirúrgicos e de animais são realizadas estritamente de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os experimentos que envolvem o uso de animais são aprovados por UCSD Animal Care Institucional e Comitê de Uso. 1. plasmídeo Clonagem, expressão e purificação do mono-biotinilado BDNF (mBtBDNF) NOTA: Construir pré-proBDNFavi e BirA cDNA em vetor pcDNA3.1 e co-expressar em células HEK293FT 10. Pu...

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	<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+dynein-microtubule+network+is+required+for+NGF+signaling+through+the+Rap1/MAPK+pathway.">A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway.</a> Traffic. 8, 1503-1520 (2007).</li><li>Wortzel, I., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ERK+Cascade:+Distinct+Functions+within+Various+Subcellular+Organelles.">The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles.</a> Genes &amp; cancer. 2, 195-209 (2011).</li><li>Huang, E. J., Reichardt, L. 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T., Yang, J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+producing+mono-biotinylated,+biologically+active+neurotrophic+factors:+an+essential+reagent+for+single+molecule+study+of+axonal+transport.">A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport.</a> Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).</li><li>Tani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+a+ligand-receptor+complex+on+the+growth+cones+as+an+essential+step+for+the+uptake+of+nerve+growth+factor+at+the+distal+end+of+the+axon:+a+single-molecule+analysis.">Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).</li><li>Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-induced+internalization+of+the+p75+neurotrophin+receptor:+a+slow+route+to+the+signaling+endosome.">Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).</li><li>Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+nerve+growth+factor+carboxyl+terminus+in+receptor+binding+and+conformational+stability.">The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability.</a> The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).</li><li>Zuccato, C., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+in+neurodegenerative+diseases.">Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases.</a> Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).</li><li>Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+over-expression+in+the+forebrain+ameliorates+Huntington's+disease+phenotypes+in+mice.">Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice.</a> Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).</li><li>Gauthier, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+controls+neurotrophic+support+and+survival+of+neurons+by+enhancing+BDNF+vesicular+transport+along+microtubules.">Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules.</a> Cell. 118, 127-138 (2004).</li><li>Her, L. S., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+of+striatal+neurons+to+axonal+transport+defects+induced+by+mutant+huntingtin.">Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).</li><li>Rong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+intracellular+trafficking+of+huntingtin-associated+protein-1+is+critical+for+TrkA+protein+levels+and+neurite+outgrowth.">Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).</li></ol>

Neste estudo, descrevemos o desenvolvimento de uma nova técnica para produzir biologicamente activo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) que podem ser utilizados para rastrear o transporte axonal de BDNF. Conjugando a proteína a estreptavidina quantum dot, e usando uma câmara de microfluidos, o método permite detectar o transporte axonal de BDNF nos neurónios primários com sensibilidade única molécula, em tempo real e com resolução espacial e temporal. As ferramentas aqui utilizadas fornecer um meio pelo qual a es...

Os neurônios são as células cujos processos longos e muitas vezes altamente elaborados são fundamentais para estabelecer e manter a estrutura ea função dos circuitos neurais altamente polarizada. O axônio desempenha um papel vital no que transportam cargas de e para as sinapses. As proteínas e organelas sintetizados no soma célula necessita de ser transportado por axónios para chegar ao terminal pré-sináptico para suportar a função neuronal. Do mesmo modo, os sinais recebidos pelo axónios distais devem ser transduzidas e transportado para o soma. Estes processos são essenciais para a sobrevivência neuronal, diferenciação e manutenção. Em que o transporte axonal em neurónios algumas deve ser conduzida através de distâncias mais do que 1000 vezes o diâmetro do corpo da célula, a possibilidade é facilmente imaginado que mesmo pequenos défices pode impactar significativamente a função neuronal e o circuito. Derivado de factor neurotrófico cerebral (BDNF), um membro da família da neurotrofina de factores de crescimento, está presente na maregiões do cérebro, incluindo ny hipocampo, córtex cerebral, e do prosencéfalo basal. BDNF desempenha um papel crucial na formação da memória e cognição, através do apoio da sobrevivência, diferenciação e função de neurónios que participam em circuitos cognitivos. BDNF se liga ao seu receptor, a tirosina-cinase TrkB, no terminal axonal em que activa as vias de sinalização mediadas por TrkB, incluindo a proteína quinase activada por mitógeno / regulada por sinal extracelular da proteína cinase (MAPK / ERK), fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) e fosfolipase C-gama (PLCy). As proteínas que participam nestas vias de sinalização são empacotados em vesículas de endocitose para formar o BDNF / TrkB sinalização endosome 1-6 que são, então, transportado retrogradamente à soma neuronal. A câmara de cultura de microfluidos é uma plataforma muito útil para estudar a biologia axonal, em condições normais, bem como na definição de lesões e doenças 7,8. Por axônios isolandodos corpos celulares, o dispositivo tem permitido um para estudar o transporte especificamente em axônios 8-10. As plataformas microfluídicos baseados PDMS com 450 mM barreiras microgroove utilizados neste estudo foram adquiridos comercialmente (ver tabela de materiais). Para examinar o transporte BDNF, desenvolvemos uma nova tecnologia para produzir monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Tiramos proveito do peptídeo biotina aceitante, AP (também conhecido como AviTag). É uma sequência de 15 aminoácidos que contém um resíduo de lisina, que pode ser especificamente ligado a uma biotina pela Escherichia coli enzima biotina ligase, BirA. Nós fundido a AviTag para o C-terminal do rato pré-proBDNF cDNA por PCR (Figura 1A). A construção foi clonada no vector de expressão de mamífero, pcDNA3.1 Myc-His vector. Nós também clonado o DNA bacteriano BirA na pcDNA3.1 Myc-His vector. Os dois plasmídeos foram co-transfectadas transientemente em células HEK293FT para expressar ambas as proteínas. BirA catalisou a ligadura da biotaem que especificamente a lisina residir no AviTag no C-terminal do BDNF a uma razão de 1: 1 para produzir monobiotinylated monómero BDNF. Biotinilado, BDNF madura com uma massa molecular de ~ 18 kDa foi recuperada e purificada a partir dos meios utilizando Ni-resina (Figura 1C). A biotinilação de FNDC estava completa, conforme avaliado pela incapacidade para detectar o BDNF não modificado por imunotransferência (Figura 1E). Estreptavidina conjugada pontos quânticos, QD 655, foram utilizados para marcar mBtBDNF fazer QD-BDNF. A presença do AviTag não interferir com a actividade do BDNF como o mBtBDNF foi capaz de activar TrkB fosforilada (Figura 1E) e estimular o crescimento de neurites (Figura 1F) até ao ponto de BDNF recombinante humano (rhBDNF). Acms mostrado que QD-BDNF colocalized com TrkB em axónios do hipocampo, indicando que QD-BDNF é bioactivo (Figura 1G). Para estudar o transporte de BDNF, QD-BDNF foi adicionado ao compartimento do axónio distaiculturas de microfluidos contendo rato E18 neurónios do hipocampo (Figura 2A). QD-BDNF transporte retrógrado dentro de axônios foi capturado por em tempo real imagens ao vivo da etiqueta fluorescente vermelha (apoiando vídeos S1, S2). Ao analisar o quimógrafo gerado, QD-BDNF foi observada a ser transportados retrogradamente a uma velocidade de deslocamento de cerca de 1,06 pM / seg (Figura 3A). GFP ou mCherry-BDNF com etiquetas ter sido usado para controlar o movimento axonal de BDNF. As principais desvantagens são que eles não são brilhantes o suficiente para os estudos de moléculas individuais. Além disso, a presença de ambos os movimentos anterógrada e retrógrada BDNF torna difícil avaliar se ou não o BDNF transportado retrogradamente era um complexo de neurotrofina / receptor. Neste vídeo, demonstramos as técnicas utilizadas para examinar o tráfico ao vivo do QD-BDNF em câmaras microfluídicos usando neurônios primários. O ultrabrightness e excelente fotoestabilidade de pontos quânticos makes-se possível realizar de seguimento a longo prazo de transporte BDNF. Estas técnicas podem ser explorados para reforçar estudos de função axonal em AD, HD, e outras desordens neurodegenerativas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="641">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:261px;">Name</td>
			<td style="width:205px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platinum pfx DNA polymerase&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11708021</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EcoRI&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>FD0274</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BamHI&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>FD0054</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293FT cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM-high glucose media</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-013-CV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">d-biotin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TurboFect&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>R0531</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6279</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ni-NTA resins</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S8820</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">silver staining kit&#160;</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant BDNF</td>
			<td>Genentech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microfluidic chambers</td>
			<td>Xona</td>
			<td>SND450</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24x40 mm No. 1 glass coverslips&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-060</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">poly-L-Lysine&#160;</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3438-100-01</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B27&#160;&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QD655-streptavidin conjugates</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;Q10121MP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Avi tag antibody</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>A00674</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">streptavidin-agarose beads&#160;</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>&#160;SA100-04</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6399</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRP-streptavidin&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-pTrkB antibody</td>
			<td colspan="2">a generous gift from Dr M. Chao of NYU</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-TrkB antibody</td>
			<td>BD Science</td>
			<td>610101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled bdnf in primary neurons

BDNF desempenha um papel importante em vários aspectos da sobrevivência neuronal, diferenciação e função. Défices funcionais e estruturais no axônios são cada vez mais vistos como uma característica precoce de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD) e a doença de Huntington (DH). Como ainda é pouco claro o mecanismo (s) pelo qual é induzida lesão axonal. Nós relataram o desenvolvimento de uma nova técnica para produzir biologicamente activo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) que pode ser utilizado para rastrear o transporte axonal de BDNF. Quantum dot marcado BDNF (QD-BDNF) foi produzido pela conjugação de ponto quântico 655 a mBtBDNF. Um dispositivo de microfluidos foi usada para isolar axónios de corpos celulares de neurónios. A adição de QD-BDNF ao compartimento axonal permitiu imagens ao vivo de transporte BDNF nos axônios. Nós demonstramos que QD-BDNF movido essencialmente exclusivamente retrogradamente, com muito poucas pausas, a uma velocidade de deslocamento de cerca de 1,06 pM / seg. Este sistema pode ser utilizado para me investigarcanismos de função axonal interrompido no AD ou HD, bem como outras doenças degenerativas.

Produção e Purificação de BDNF Mono-biotinilado Biologicamente Activo O vector de expressão de BDNF fundida com uma sequência de AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) foi criado de acordo com um protocolo previamente publicado 10. A massa molecular da proteína de fusão de comprimento completo foi previsto para ser ~ 32 kDa ( <a href="http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html" target="_blank">http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html</a> ) Monobiotinylated BDNF maduro com uma massa molecu...

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Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

O transporte axonal de BDNF, um factor neurotrófico, é crítico para a sobrevivência e função de várias populações neuronais. Algumas desordens degenerativas são marcadas pela ruptura da estrutura e função axonal. Nós demonstramos as técnicas utilizadas para examinar o tráfico ao vivo do QD-BDNF em câmaras microfluídicos usando neurônios primários.

Imagens em tempo real de axonal Transporte de Quantum Dot marcado BDNF na Primária Neurônios

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

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