Name: gdna enrichment by a transposase-based technology for ngs analysis of the whole sequence of brca1, brca2, and 9 genes involved in dna damage repair
Uploaded: 2014-10-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair at JoVE.co

We thank the Ligue contre le Cancer de C&#244;te d&#8217;Or and the Centre Georges-Fran&#231;ois Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.

GDNA 1. आकलन (जीनोमिक डीएनए) यील्ड <ol><li> हौसले से पुस्तकालय की तैयारी से पहले gDNA निकाले यों. (GDNA उपज आकलन के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर उपयोग कर से बचने) बरकरार gDNA यों fluorometric उपज आकलन विधि का प्रयोग करें. (260/280 एनएम) अन?...

<ol>
	<li>Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+responsible+for+familial+breast+cancer.">Genes responsible for familial breast cancer.</a> Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).</li><li>Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+breast+cancer+risk+and+BRCA1/2+carrier+probability.">Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability.</a> Breast Dis. 27, 5-20 (2007).</li><li>Cox, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+variants+of+the+BRCA1+wild-type+allele+modify+the+risk+of+breast+cancer+in+BRCA1+mutation+carriers.">Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers.</a> Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).</li><li>Maia, A. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fifteen+novel+germline+variants+in+the+BRCA1+3'UTR+reveals+a+variant+in+a+breast+cancer+case+that+introduces+a+functional+miR-103+target+site.">Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site.</a> Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).</li><li>Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1+and+BRCA2:+different+roles+in+a+common+pathway+of+genome+protection.">BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.</a> Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).</li><li>Ma, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+evidence+for+the+contribution+of+the+genetic+variations+of+BRCA1-interacting+protein+1+(BRIP1)+to+the+genetic+susceptibility+of+cervical+cancer.">First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer.</a> Gene. 524 (2), 208-213 (2013).</li><li>Haanp&#228;&#228;, M., Pylk&#228;s, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+need+for+routine+clinical+testing+of+PALB2+c.1592delT+mutation+in+BRCA+negative+Northern+Finnish+breast+cancer+families.">Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families.</a> BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).</li><li>Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PALB2+and+breast+cancer:+ready+for+clinical+translation.">PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation.</a> Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).</li><li>Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+and+implementation+issues+in+using+next-generation+sequencing+of+cancers+in+clinical+practice.">Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice.</a> Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).</li><li>Hernan, I., Borr&#224;s, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Ma&#241;&#233;, B., Llort, G., Ag&#250;ndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+genomic+variations+in+BRCA1+and+BRCA2+genes+by+long-range+PCR+and+next-generation+sequencing.">Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing.</a> J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).</li><li>Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+three+methods+for+fragmentation+of+long-range+PCR+products+for+next+generation+sequencing.">Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing.</a> Plos One. 6, e28240 (2011).</li><li>de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borr&#224;s, E., Ma&#241;&#233;, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+mutations+that+cause+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa+in+candidate+genes+by+long-range+PCR+amplification+and+next-generation+sequencing.">Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing.</a> Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Breast+Cancer+Linkage+Consortium.+Cancer+Risks+in+BRCA2+Mutation+Carriers.">The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers.</a> J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).</li><li>Levy-Lahad, E., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+risks+among+BRCA1+and+BRCA2+mutation+carriers.">Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers.</a> Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).</li><li>Risch, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+BRCA1+and+BRCA2+mutation+frequencies+and+cancer+penetrances:+a+kin-cohort+study+in+Ontario,+Canada.">Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada.</a> J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).</li><li>Slater, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PALB2+mutations+in+European+familial+pancreatic+cancer+families.">PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families.</a> Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).</li><li>Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA+and+pancreatic+cancer.">BRCA and pancreatic cancer.</a> J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).</li></ol>

NGS उपकरणों और प्रौद्योगिकियों के व्यापक उपयोग के कैंसर और आनुवंशिक विकारों के अध्ययन में नए अवसर प्रदान किया है. पूरे जीनोम अनुक्रमण या शाही सेना अनुक्रमण के अलावा, कई रोगियों में चयनित gDNA दृश्यों की एक...

2010 में, (अनिवार्य रूप से महिलाओं) लगभग 15 लाख लोगों को दुनिया भर में स्तन कैंसर विकसित की है. यह इन मामलों में से 5 से 10% वंशानुगत थे कि अनुमान है. वंशानुगत स्तन और डिम्बग्रंथि के कैंसर 1 में शामिल के रूप में लगभग 20 साल पहले, बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 की पहचान की गई. लगभग 15 साल पहले के बाद से, बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 कोडिंग क्षेत्रों स्तन और अंडाशय कैंसर को आनुवंशिक गड़बड़ी का निर्धारण करने के लिए अनुक्रम निर्धारण किया गया है. बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 में बदलाव इन क्षेत्रों का विश्लेषण प्रभावी जांच के लिए पर्याप्त नहीं है, सुझाव है कि चयनित परिवारों को 2 से 10 से 20% में पता चला रहे हैं. हाल ही में, बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 के गैर कोडन दृश्यों (प्रमोटर, इंट्रोन्स, 3&#39;UTR) के विश्लेषण के नए परिवर्तन / विविधताओं स्तन कैंसर 3-6 के एक उच्च जोखिम से जोड़ा जा सकता है कि प्रकाश डाला. बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 प्रोटीन (मुताबिक़ पुनर्संयोजन मरम्मत में शामिल रहे हैंकई भागीदारों 7 से पूरा हो गया है, जो HHR),. बीआरसीए 1 या बीआरसीए 2 में परिवर्तन डीएनए की मरम्मत में दोष उत्पन्न करते हैं, अन्य भागीदारों को भी स्तन कैंसर के खतरे को प्रभावित कर सकता है. इस परिकल्पना BRIP1 8 के बाद से मान्य किया गया है प्रकट होता है और PALB2 9 क्रमशः, ग्रीवा और स्तन कैंसर पर एक सिद्ध प्रभाव पड़ता है. इसके अलावा, दो अन्य &quot;मध्यम जोखिम&quot; स्तन कैंसर का खतरा जीन, एटीएम और CHEK2, भी नियमित तौर पर 10 अध्ययन किया जा सकता है. इन अध्ययनों से पर के बाद, हम एक साथ अपेक्षाकृत एक बहुत आसान और उपयोग कर 24 रोगियों में 11 जीन (एटीएम, BARD1, बीआरसीए 1, बीआरसीए 2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80, और TP53) का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करने का फैसला एक मध्यम throughput डिवाइस पर संवर्धन और अनुक्रमण साथ Transposase प्रौद्योगिकी पर आधारित तेज प्रोटोकॉल,. धन्यवादइस तकनीक के लिए, हम 2,500 बीपी के एक intronic क्षेत्र में शामिल नहीं किया गया था, जिसके लिए RAP80, (: 176,381,588-176,390,180 Chr5) के अलावा, 3&#39;-UTR के अंत करने के प्रमोटर के शुरू से ही पूरा जीन अनुक्रम. यह 2734 जांच के साथ अध्ययन के बारे में 1000300 बीपी के कुल का प्रतिनिधित्व करता है. आमतौर पर, बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 exonic दृश्यों कम से कम 20 रोगियों के लिए 1.5 महीने की जरूरत है जो सेंगर अनुक्रमण, से विश्लेषण कर रहे हैं. वर्तमान प्रोटोकॉल (चित्रा 1) के साथ, एक ही समय में, 75 से अधिक रोगियों के लिए 11 पूर्ण जीन विश्लेषण किया जा सकता है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1001</td>
			<td>Sequencing/medium throughput device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera Enrichment kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-123-1208</td>
			<td>Transposase based technology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 cycle cartridge</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>15033624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Magnetic purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Alpaqua</td>
			<td>A32782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDI 96-well plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>AB0859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal A</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>MSA-5001</td>
			<td>This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Provided with the sequencing device 
			Experiment Manager software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new&#62; 
			Manufacturer website tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gdna enrichment by a transposase-based technology for ngs analysis of the whole sequence of brca1, brca2, and 9 genes involved in dna damage repair

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के व्यापक उपयोग कैंसर अनुसंधान और निदान के लिए नए रास्ते खोल दिए हैं. NGS विशाल कैंसर पर नया डेटा की मात्रा, और विशेष रूप से कैंसर जेनेटिक्स लाएगा. वर्तमान ज्ञान और भविष्य की खोजों यह आवश्यक कैंसर को एक आनुवंशिक गड़बड़ी में शामिल किया जा सकता है कि जीन की एक बड़ी संख्या का अध्ययन करने के लिए कर देगा. इस संबंध में, हम डीएनए की क्षति की मरम्मत में शामिल 11 पूर्ण जीन अध्ययन करने के लिए एक Nextera डिजाइन विकसित की है. इस प्रोटोकॉल को सुरक्षित रूप से एक साथ 24 रोगियों में 11 जीन (एटीएम, BARD1, बीआरसीए 1, बीआरसीए 2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, और TP53) प्रमोटर से 3&#39;-UTR के लिए अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था. Transposase प्रौद्योगिकी और gDNA संवर्धन पर आधारित यह प्रोटोकॉल, बहुसंकेतन नमूने के लिए आनुवंशिक निदान धन्यवाद के लिए समय के मामले में एक महान लाभ देता है. इस प्रोटोकॉल को सुरक्षित रूप से रक्त gDNA के साथ प्रयोग किया जा सकता है.

उदाहरणार्थ क्यूसी परिणाम लक्ष्य जीन के दृश्यों का निर्धारण करने के लिए इस पद्धति की क्षमता gDNA (2A चित्रा) की गुणवत्ता और tagmentation कदम की गुणवत्ता पर आधारित है. Tagmentation (चित्रा 2B, ऊपरी पैनल) प...

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gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

के पूरे दृश्य की NGS विश्लेषण के लिए एक Transposase आधारित प्रौद्योगिकी द्वारा gDNA संवर्धन<em&gt; बीआरसीए 1</em&gt;,<em&gt; बीआरसीए 2</emडीएनए क्षति की मरम्मत में शामिल&gt;, और 9 जीन

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Research

JoVE Journal

Biology

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

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Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

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The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

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