Name: a method for microinjection of patiria minata zygotes
Uploaded: 2014-09-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية وIOS IOS 0844948 1024811

إبقاء كل مياه البحر أو مياه البحر الاصطناعي (SW)، والحيوانات الكبار، والثقافات في 15 ° C بقدر ما هو عملي. يتم الاحتفاظ ضمان البيض وبيضات ملقحة مغمورة في SW. أملاح البحر مستعدة تجاريا تشكيلها مع المقطر أو المياه بالتناضح العكسي يخدم كذ...

<ol>
	<li>Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fluorescence+in+thick+specimens,+with+an+application+to+cyclin+B-GFP+expression+in+starfish+oocytes.">Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes.</a> Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).</li><li>Terasaki, M., Runft, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-stage+dependence+for+1-methyladenine+induced+reinitiation+of+meiotic+maturation+in+starfish+oocytes.">Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes.</a> Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).</li><li>O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+multiple+Src+family+kinases+at+fertilization.">Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization.</a> J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).</li><li>McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+wnt+and+frizzled+genes+during+early+sea+star+development.">Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development.</a> Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).</li><li>Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+network+for+neurogenesis+in+a+sea+star+embryo+connects+broad+neural+specification+and+localized+patterning.">Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).</li><li>McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+embryonic+skeletogenic+mesenchyme+lineage+in+a+sea+cucumber+reveals+the+trajectory+of+change+for+the+evolution+of+novel+structures+in+echinoderms.">Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms.</a> EvoDevo. 3, 17 (2012).</li><li>Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+cluster+and+chordate-like+expression+of+ParaHox+genes+in+a+sea+star.">Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star.</a> BMC Biol. 11, 68 (2013).</li><li>Morino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+activation+of+VEGF+signaling+and+the+evolution+of+the+skeleton+in+echinoderm+pluteus+larvae.">Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae.</a> Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).</li><li>Hart, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+the+sea+star+egg+receptor+for+sperm+bindin.">Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin.</a> Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).</li><li>McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergence+genetics+analysis+reveals+historical+population+genetic+processes+leading+to+contrasting+phylogeographic+patterns+in+co-distributed+species.">Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species.</a> Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).</li><li>Keever, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discordant+distribution+of+populations+and+genetic+variation+in+a+sea+star+with+high+dispersal+potential.">Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential.</a> Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).</li><li>Lambert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. , (2000).</li><li>Dor&#233;e, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+control+of+meiosis:+specificity+of+the+1-methyladenine+receptors+in+starfish+oocytes.">Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).</li><li>Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+gene+regulatory+network+architecture+across+500+million+years+of+echinoderm+evolution.">Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).</li><li>Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+the+evolutionary+act:+precise+cis-regulatory+basis+of+difference+in+the+organization+of+gene+networks+of+sea+stars+and+sea+urchins.">Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins.</a> Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).</li><li>McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+gene+regulatory+network+subcircuit+drives+different+developmental+fates+in+the+vegetal+pole+of+highly+divergent+echinoderm+embryos.">A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos.</a> Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).</li><li>Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+and+handling+echinoderm+oocytes.">Obtaining and handling echinoderm oocytes.</a> Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).</li><li>Sweet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastomere+isolation+and+transplantation.">Blastomere isolation and transplantation.</a> Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).</li><li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs.">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).</li><li>Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantropic+retroviruses+as+a+transduction+tool+for+sea+urchin+embryos.">Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).</li></ol>

هناك نوعان من الخطوات الحاسمة التي من الصعب بالنسبة للمستخدمين المبتدئين لهذه التقنية ولكن لا غنى عنها لخلق أجنة morphant بنجاح. الأول هو اختيار البويضات السليمة التي من شأنها أن تنضج وتسميد بشكل صحيح. نسبة التطور الطبيعي في ثقافة تعتمد على الموسم، وصحة الحيوان، وعدد ال...

نجم البحر، Patiria miniata، (المعروف باسم نجم الخفافيش) في الظهور كنظام نموذج للاهتمام وتنوعا لمجموعة متنوعة من الخلايا 1- 3، 4،5 التنموية، التطورية 6- 8، والدراسات البيئية 9- 11. الكبار P. وتوزع miniata على طول ساحل المحيط الهادئ من سيتكا، ألاسكا إلى باجا كاليفورنيا 12 ويتم الاحتفاظ بسهولة في الأحواض المائية البحرية. البويضات التي يمكن الحصول عليها على مدار السنة وكل أنثى يمكن إلقاء عشرات الآلاف من البيض. ونضجت بسهولة البويضات المخصبة وخارجيا 13. الأجنة الناتجة شفافة مما يسمح للمراقبة سهلة؛ أن تتطور بشكل متزامن، وتحتاج إلى مياه البحر الوحيد للتنمية. التجمع الجينوم كله وtranscriptomes متعددة متاحة للP. أيضا miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). هذه المزايا تجعل يجعلها مثالية لمجموعة واسعة من البحوثوأغراض التدريس. في السنوات الأخيرة، P. أصبح miniata نظام نموذجي لشبكة تنظيمية الجينات التنموي يحلل 14- 16. والهدف من هذه الدراسات هو تحديد مجاملة كاملة من الجينات التنظيمية وتحديد شبكة من تفاعلاتها. الكثير من هذا العمل ينطوي على التعبير الجيني من خلال إقلاق إدخال أليغنوكليوتيد] العقاقير أو في المختبر توليفها من mRNAs. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام التحليلات التنظيمية رابطة الدول المستقلة لتوصيف وظيفة الحمض النووي التنظيمي 15. هذه التحليلات تتطلب إدخال الكواشف اضطراب و / أو مراسل الحمض النووي يبني في الأجنة. وعلاوة على ذلك، لوصف آثار المصب من هذه الاضطرابات، لا بد من مقايسة العديد من الأجنة لإجراء تغييرات في التعبير الجيني من الأهداف المحتملة. تقنيات Microinjection من عدة مئات من بيضات ملقحة هي المركزية لهذا العمل. شوكيات الجلد، بما في ذلك P. miniata </م&gt;، يتطلب عدة أشهر لتصل إلى مرحلة النضج الجنسي. وبسبب هذا، فهو عموما ليس العملي لتطوير وصيانة خطوط المعدلة وراثيا من هذه الحيوانات للتجريب. لذا، تربية البالغين المعدلة وراثيا لا يمكن بكفاءة خلق الأجنة تعديل. بدلا من ذلك، يجب أن يحدث الاضطراب من جديد من خلال حقن مكروي. يقدم حقن مكروي فرصة لتعديل الأجنة مع الكواشف التي ليست خلية منفذة. يصف بروتوكول التالية طريقة لإدخال DNA، مرنا، استشفاف خلية، وأليغنوكليوتيد] morpholino العقاقير إلى مئات من البويضات المخصبة في واحدة 2-3 ساعة يجلس من خلال حقن مكروي. هذا وتنتج مادة كافية لمجموعة متنوعة من التجارب المصب بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، QPCR، الموقع التهجين، RNA تسلسل، والنشاف الغربي في.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1-Methyladenine</td>
			<td style="width:147px;">Acros Organics (Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:119px;">AC20131-1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">190 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0185-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">100 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0105-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Capillary tubing</td>
			<td style="width:147px;">FHC, Inc</td>
			<td style="width:119px;">30-30-0</td>
			<td style="width:167px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Model P-97 Needle Puller</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:216px;">Dextran, Rhodamine Green</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7163</td>
			<td style="width:167px;">If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td style="width:147px;">Doctors Foster and Smith</td>
			<td style="width:119px;">CD-116528</td>
			<td style="width:167px;">Also available in many pet stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

كانت شوكيات الجلد لفترة طويلة نظام نموذجي المفضل للدراسات الاستنساخ والتنمية، ومؤخرا لدراسة تنظيم الجينات وتطور العمليات التنموية. نجم البحر، Patiria miniata، تكتسب انتشار كنظام نموذج لهذه الأنواع من الدراسات التي أجريت سابقا على وجه الحصر تقريبا في قنافذ البحر، Strongylocentrotus purpuratus وLytechinus variegatus. ميزة هذه الأنظمة النموذج هو سهولة إنتاج أجنة تعديل فيها هو جين معين صعودا أو downregulated، ووضع العلامات مجموعة من الخلايا، أو إدخال الجين المراسل. وهناك طريقة حقن مكروي واحد قادر على خلق مجموعة واسعة من هذه الأجنة تعديل. هنا، فإننا نقدم وسيلة للحصول على الأمشاج من P. miniata، وإنتاج بيضات ملقحة، وإدخال الكواشف مشوشة عبر حقن مكروي. يتم عزل الأجنة morphant صحية في وقت لاحق للدراسات الكمية والنوعية للجنرال الكتريكوظيفة الشرق الأدنى. توافر الجينوم وTranscriptome على البيانات لهذا الكائن الحي ازدادت أنواع الدراسات التي يتم تنفيذها وسهولة تنفيذها.

الهدف من هذا البروتوكول هو تقديم الكواشف إلى الأجنة. نحن إثبات فعالية البروتوكول عن طريق حقن مراسل بناء الحمض النووي الذي يدفع التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP). حقن الأجنة تعبر عن GFP في بقع نسيلي (الشكل 4A-B) والحمض النووي خلال الانقسام يتضمن المبكر. العد?...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes at JoVE.com

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

الأساليب التي تنتج أجنة morphant ضرورية لدراسة آليات تنموية والشبكات التنظيمية الجينات. نجم البحر Patiria miniata هو نظام نموذجي الناشئة عن هذه الدراسات. هنا نقدم بروتوكول للحصول على الأمشاج، وتنتج ثقافات الأجنة، وحقن مكروي السريع للبيضات ملقحة من هذا النوع.

منهج في Microinjection من<em&gt; Patiria minata</em&gt; بيضات ملقحة

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Microinjection الجنين بعوض ألف الحصول على البعوض المعدلة وراثيا

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

طريقة لثقافة الفرخ المبكر فيفو السابقين الأجنة (الثقافة الجديدة)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

استخدام Rotorod كأسلوب للتحليل النوعي من المشي في الجرذ

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Microinjection الجنين الميداكا لاستخدامها بوصفها كائنا النموذجي الوراثية

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

تدفق الخلوي على أساس تنقية<em&gt; S. خميرة</em&gt; بيضات ملقحة

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

حقن مكروي وحيدة الخلية لتحليل الاتصالات خلية

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

عالية الإنتاجية إبر دقيقة جدا لقنفذ البحر بيضات ملقحة

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

في فيفو حقن مكروي و Electroporation ماوس الخصية

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...