Name: a method for microinjection of patiria minata zygotes
Uploaded: 2014-09-01T15:00:00
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Bewahren Sie alle Meerwasser oder künstlichem Meerwasser (SW), erwachsenen Tieren und Kulturen bei 15 ° C, so viel wie praktisch. Stellen Sie sicher, Eier und Zygoten sind in SW eingetaucht gehalten. Kommerziell hergestellte Meersalz mit destilliertem oder Umkehrosmose Wasser wiederhergestellt dient auch als Quelle der SW. Überprüfen Sie den Salzgehalt mit einem Hydrometer und stellen Salze oder Wasser, um ein optimales Niveau zu erreichen. Halten spezifische Gewicht Niveaus zwischen 1,0...

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	<li>Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fluorescence+in+thick+specimens,+with+an+application+to+cyclin+B-GFP+expression+in+starfish+oocytes.">Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes.</a> Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).</li><li>Terasaki, M., Runft, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-stage+dependence+for+1-methyladenine+induced+reinitiation+of+meiotic+maturation+in+starfish+oocytes.">Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes.</a> Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).</li><li>O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+multiple+Src+family+kinases+at+fertilization.">Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization.</a> J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).</li><li>McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+wnt+and+frizzled+genes+during+early+sea+star+development.">Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development.</a> Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).</li><li>Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+network+for+neurogenesis+in+a+sea+star+embryo+connects+broad+neural+specification+and+localized+patterning.">Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).</li><li>McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+embryonic+skeletogenic+mesenchyme+lineage+in+a+sea+cucumber+reveals+the+trajectory+of+change+for+the+evolution+of+novel+structures+in+echinoderms.">Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms.</a> EvoDevo. 3, 17 (2012).</li><li>Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+cluster+and+chordate-like+expression+of+ParaHox+genes+in+a+sea+star.">Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star.</a> BMC Biol. 11, 68 (2013).</li><li>Morino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+activation+of+VEGF+signaling+and+the+evolution+of+the+skeleton+in+echinoderm+pluteus+larvae.">Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae.</a> Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).</li><li>Hart, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+the+sea+star+egg+receptor+for+sperm+bindin.">Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin.</a> Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).</li><li>McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergence+genetics+analysis+reveals+historical+population+genetic+processes+leading+to+contrasting+phylogeographic+patterns+in+co-distributed+species.">Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species.</a> Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).</li><li>Keever, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discordant+distribution+of+populations+and+genetic+variation+in+a+sea+star+with+high+dispersal+potential.">Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential.</a> Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).</li><li>Lambert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. , (2000).</li><li>Dor&#233;e, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+control+of+meiosis:+specificity+of+the+1-methyladenine+receptors+in+starfish+oocytes.">Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).</li><li>Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+gene+regulatory+network+architecture+across+500+million+years+of+echinoderm+evolution.">Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).</li><li>Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+the+evolutionary+act:+precise+cis-regulatory+basis+of+difference+in+the+organization+of+gene+networks+of+sea+stars+and+sea+urchins.">Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins.</a> Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).</li><li>McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+gene+regulatory+network+subcircuit+drives+different+developmental+fates+in+the+vegetal+pole+of+highly+divergent+echinoderm+embryos.">A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos.</a> Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).</li><li>Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+and+handling+echinoderm+oocytes.">Obtaining and handling echinoderm oocytes.</a> Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).</li><li>Sweet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastomere+isolation+and+transplantation.">Blastomere isolation and transplantation.</a> Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).</li><li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs.">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).</li><li>Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantropic+retroviruses+as+a+transduction+tool+for+sea+urchin+embryos.">Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).</li></ol>

Es gibt zwei wichtige Schritte, die schwierig für unerfahrene Anwender dieser Technik sind aber unerlässlich für die erfolgreiche Schaffung morphanten Embryonen. Die erste ist die Auswahl gesunder Eizellen, die reifen und richtig düngen wird. Der Prozentsatz der normalen Entwicklung in einer Kultur hängt von der Jahreszeit, der Gesundheit des Tieres, und die Anzahl der Male, die Oozyten wurden aus einem einzigen Individuum geerntet. Eizellen sind in der Regel von besserer Qualität von April bis Oktober. Es ist wic...

Das Sea Star, Patiria miniata, (allgemein als die Fledermaus Stern) ist als eine interessante und vielseitige Modellsystem Schwellen für eine Vielzahl von Mobil 1-3, Entwicklungs 4,5, Evolutions 6 bis 8 und 9 bis 11 ökologische Studien. Erwachsene P. miniata entlang der Pazifikküste von Sitka, Alaska nach Baja, Kalifornien 12 verteilt sind und leicht in Meerwasseraquarien gehalten. Eizellen sind erhältlich jährig und jedes Weibchen kann Zehntausende von Eiern zu vergießen. Eizellen sind leicht gereift und außen 13 befruchtet. Die daraus resultierenden Embryonen sind durchsichtig erlaubt eine einfache Beobachtung; entwickeln sie synchron und erfordern nur Meerwasser für die Entwicklung. Gesamte Genom Montage und mehrere Transkriptomen sind auch für P. verfügbar miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). Solche Vorteile machen sie ideal für eine Reihe von Forschungsund Lehrzwecke. In den letzten Jahren P. miniata hat sich zu einem Modellsystem für die Entwicklungs genregulatorischen Netzwerkanalysen 14-16. Ziel solcher Untersuchungen ist die gesamte Komplement regulatorischen Gene zu identifizieren und zu bestimmen, die das Netz ihre Wechselwirkungen. Ein großer Teil dieser Arbeit bringt störenden Genexpression durch Einführung von Antisense-Oligonukleotide oder in vitro synthetisierten mRNA. Zusätzlich sind cis-regulatorischen Analysen verwendet werden, um die Funktion von regulatorischen DNA 15 charakterisieren. Diese Analysen erfordern Einführung Störungs Reagenzien und / oder DNA-Reporterkonstrukte in Embryonen. Ferner sind die nachgeschalteten Effekte dieser Störungen zu charakterisieren, muß man viele Embryonen zu Veränderungen in der Genexpression potentieller Ziele zu untersuchen. Verfahren zur Mikroinjektion von vielen Hunderten von Zygoten sind von zentraler Bedeutung für diese Arbeit. Stachelhäuter, darunter P. miniata </em&gt;, erfordern viele Monate bis zur Geschlechtsreife zu erreichen. Aus diesem Grund ist es im allgemeinen nicht praktisch, zu entwickeln und aufrechtzuerhalten transgenen Linien dieser Tiere für Experimente. Daher kann die Zucht von transgenen Erwachsene nicht effizient geändert Embryonen erstellen. Stattdessen müssen Störung auftreten, de novo durch Mikroinjektion. Mikroinjektion bietet die Möglichkeit, Embryonen mit Reagenzien, die nicht zellgängig sind zu ändern. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren, um DNA, mRNA, Zell Tracer und Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden in Hunderten von befruchteten Eiern in einer 2-3 h durch Mikroinjektion sitzt einzuführen. Dies erzeugt genügend Material für eine Vielzahl von stromabwärts Experimente, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, qPCR beschränkt, in-situ-Hybridisierung, RNA-Seq und Western Blotting.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1-Methyladenine</td>
			<td style="width:147px;">Acros Organics (Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:119px;">AC20131-1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">190 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0185-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">100 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0105-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Capillary tubing</td>
			<td style="width:147px;">FHC, Inc</td>
			<td style="width:119px;">30-30-0</td>
			<td style="width:167px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Model P-97 Needle Puller</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:216px;">Dextran, Rhodamine Green</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7163</td>
			<td style="width:167px;">If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td style="width:147px;">Doctors Foster and Smith</td>
			<td style="width:119px;">CD-116528</td>
			<td style="width:167px;">Also available in many pet stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

Stachelhäuter haben lange für die Untersuchung von Gen-Regulation und Evolution von Entwicklungsprozessen ein beliebtes Modellsystem für die Untersuchung der Fortpflanzung und Entwicklung, und in jüngerer Zeit. Das Sea Star, Patiria miniata, gewinnt Prävalenz als Modellsystem für diese Art von Studien, die bisher fast ausschließlich in den Seeigel, Strongylocentrotus purpuratus und Lytechinus variegatus durchgeführt wurden. Ein Vorteil dieser Modellsysteme ist die Leichtigkeit der Herstellung von modifizierten Embryonen, bei denen ein bestimmtes Gen ist nach oben oder unten reguliert, Markierung einer Gruppe von Zellen, oder Einführen eines Reportergens. Eine einzelne Mikroinjektionsverfahren ist in der Lage eine Vielzahl von solchen modifizierten Embryonen. Hier stellen wir ein Verfahren zur Gewinnung von Gameten aus P. miniata, Herstellung Zygoten, und die Einführung von störenden Reagenzien über die Mikroinjektion. Gesunde morphanten Embryonen werden anschließend für die quantitative und qualitative Studien von GE isoliertne Funktion. Die Verfügbarkeit von Genom und Transkriptom Daten für diesen Organismus die Arten von Untersuchungen, die durchgeführt werden und die Leichtigkeit der Ausführung von ihnen erhöht.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Reagenzien in Embryonen vor. Wir zeigen die Wirksamkeit des Protokolls durch die Injektion eines DNA-Reporterkonstrukt, das die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) antreibt. Injizierten Embryonen exprimieren GFP in klonalen Patches (4A-B), da die DNA enthält im frühen Spaltung. Viele Reagenzien, die wünschenswert, in Embryonen einzuführen sind, sind in hohen Mengen und zu suboptimalen Chargen von Embryonen toxisch. Toxizität manifestiert durch Ver...

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A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methoden, die morphanten Embryonen sind unerlässlich, um Entwicklungsmechanismen und Gen-regulatorische Netzwerke zu studieren. Das Sea Star Patiria miniata ist ein aufstrebendes Modellsystem für diese Studien. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Erhalt von Gameten erzeugende Kulturen von Embryonen und schnelle Mikroinjektion von Zygoten von dieser Spezies.

Ein Verfahren zur Mikroinjektion von<em&gt; Patiria Minata</em&gt; Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Mikroinjektion von A. aegypti Embryonen, um transgene Moskitos erhalten

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Forschung

Biologie

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

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The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

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High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

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Mikroinjektion von Medaka Embryonen für die Verwendung als Modell Genetic Organism

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Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

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Durchflusszytometrie-basierte Reinigung von<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

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Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Einzellige Mikroinjektions für Zellkommunikationsanalyse

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