Name: a method for microinjection of patiria minata zygotes
Uploaded: 2014-09-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע IOS 0844948 וIOS 1024811

שמור את כל מי הים או מי ים מלאכותי (SW), גורים ובוגרים, ותרבויות ב15 ° C עד כמה שהוא מעשי. ביצים וzygotes להבטיח שמתקיימים שקועים בSW. מלחי ים מסחרי מוכנים מחדש עם מים אוסמוזה מזוקקים או הפוכים משמש גם כמקור של SW. בדוק מליחות באמצעות הידרומט...

<ol>
	<li>Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fluorescence+in+thick+specimens,+with+an+application+to+cyclin+B-GFP+expression+in+starfish+oocytes.">Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes.</a> Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).</li><li>Terasaki, M., Runft, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-stage+dependence+for+1-methyladenine+induced+reinitiation+of+meiotic+maturation+in+starfish+oocytes.">Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes.</a> Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).</li><li>O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+multiple+Src+family+kinases+at+fertilization.">Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization.</a> J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).</li><li>McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+wnt+and+frizzled+genes+during+early+sea+star+development.">Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development.</a> Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).</li><li>Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+network+for+neurogenesis+in+a+sea+star+embryo+connects+broad+neural+specification+and+localized+patterning.">Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).</li><li>McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+embryonic+skeletogenic+mesenchyme+lineage+in+a+sea+cucumber+reveals+the+trajectory+of+change+for+the+evolution+of+novel+structures+in+echinoderms.">Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms.</a> EvoDevo. 3, 17 (2012).</li><li>Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+cluster+and+chordate-like+expression+of+ParaHox+genes+in+a+sea+star.">Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star.</a> BMC Biol. 11, 68 (2013).</li><li>Morino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+activation+of+VEGF+signaling+and+the+evolution+of+the+skeleton+in+echinoderm+pluteus+larvae.">Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae.</a> Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).</li><li>Hart, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+the+sea+star+egg+receptor+for+sperm+bindin.">Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin.</a> Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).</li><li>McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergence+genetics+analysis+reveals+historical+population+genetic+processes+leading+to+contrasting+phylogeographic+patterns+in+co-distributed+species.">Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species.</a> Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).</li><li>Keever, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discordant+distribution+of+populations+and+genetic+variation+in+a+sea+star+with+high+dispersal+potential.">Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential.</a> Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).</li><li>Lambert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. , (2000).</li><li>Dor&#233;e, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+control+of+meiosis:+specificity+of+the+1-methyladenine+receptors+in+starfish+oocytes.">Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).</li><li>Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+gene+regulatory+network+architecture+across+500+million+years+of+echinoderm+evolution.">Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).</li><li>Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+the+evolutionary+act:+precise+cis-regulatory+basis+of+difference+in+the+organization+of+gene+networks+of+sea+stars+and+sea+urchins.">Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins.</a> Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).</li><li>McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+gene+regulatory+network+subcircuit+drives+different+developmental+fates+in+the+vegetal+pole+of+highly+divergent+echinoderm+embryos.">A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos.</a> Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).</li><li>Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+and+handling+echinoderm+oocytes.">Obtaining and handling echinoderm oocytes.</a> Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).</li><li>Sweet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastomere+isolation+and+transplantation.">Blastomere isolation and transplantation.</a> Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).</li><li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs.">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).</li><li>Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantropic+retroviruses+as+a+transduction+tool+for+sea+urchin+embryos.">Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).</li></ol>

ישנם שני שלבים קריטיים שקשה עבור משתמשים מתחילים בטכניקה זו, אך הם חיוניים ליצירת הצלחת עוברי morphant. הוא הבחירה הראשונה ביציות בריאים שתבשלנה ולדשן כראוי. אחוז של התפתחות נורמלית בתרבות תלויה בעונה, על בריאותם של בעלי החיים, ואת מספר פעמים שביציות כבר נקצרו מאדם אחד. ב...

כוכב הים, Patiria miniata, (הידוע בכינויו כוכב העטלף) מסתמן כמערכת מודל מעניינת ותכליתית עבור מגוון רחב של 1 סלולארי 3, התפתחותיות 4,5, אבולוציוני 6 8, ומחקרים אקולוגיים 9- 11. פ למבוגרים miniata מופצים לאורך חוף האוקיינוס ​​השקט מסיטקה, אלסקה לאחה, 12 קליפורניה ונשמר בקלות באקווריום ימי. ביציות הן ימות השנה ברת השגה וכל נקבה יכולה לשפוך עשרות אלפי ביצים. ביציות הבשילו בקלות ומופרה חיצוני 13. העוברים וכתוצאה מכך הם שקופים ומאפשרים להתבוננות קלה; הם מפתחים באופן סינכרוני, ודורשים מים ים רק לפיתוח. הרכבה הגנום כולו וtranscriptomes מרובה זמינות גם עבור P. miniata <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">(Echinobase.org).</a> יתרונות כגון להפוך אותם אידיאליים עבור מגוון רחב של מחקרומטרות הוראה. בשנים האחרונות, פ &#39; miniata הפך מערכת מודל לרשת רגולציה גן התפתחותי מנתחת 14- 16. מטרת מחקרים מסוג זה היא לזהות את כל המחמאה של גני רגולטורים ולקבוע את הרשת של יחסי הגומלין שלהם. חלק ניכר מהעבודה כרוכה בביטוי גנים מדאיג דרך כניסתה של oligonucleotides antisense או בmRNAs מבחנה מסונתזת. בנוסף, ניתוחי רגולציה cis משמשים כדי לאפיין את הפונקציה של DNA הרגולציה 15. ניתוחים אלה דורשים הקדמה של חומרים כימיים ההפרעות ו / או כתב הבונה DNA לעוברי. יתר על כן, כדי לאפיין את ההשפעות במורד הזרם של הפרעות אלה, יש assay עוברים רבים לשינויים בביטוי הגנים של מטרות פוטנציאליות. טכניקות לmicroinjection של מאות רבות של zygotes הן מרכזיות לעבודה זו. Echinoderms, כולל P. miniata </em&gt;, דורש חודשים רבים כדי להגיע לבגרות מינית. בגלל זה, זה בדרך כלל לא מעשי לפתח ולשמר קווים מהונדסים של בעלי חיים אלה לניסויים. לכן, גידול של מבוגרים מהונדסים לא יכול ביעילות ליצור הותאם עוברים. במקום זאת, צריכה להתרחש ההפרעות דה נובו באמצעות microinjection. Microinjection מציע הזדמנות לשנות עוברים עם ריאגנטים שאינם תא חדיר. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה להציג את DNA, mRNA, קליעים נותבים תא, וoligonucleotides antisense morpholino למאות ביצים מופרות בשעה אחת 2-3 יושבת דרך microinjection. זה מייצר חומר מספיק עבור מגוון רחב של ניסויים במורד הזרם כולל, אך לא מוגבל ל, qPCR, הכלאה באתר, RNA-Seq, ומערבי סופג.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1-Methyladenine</td>
			<td style="width:147px;">Acros Organics (Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:119px;">AC20131-1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">190 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0185-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">100 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0105-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Capillary tubing</td>
			<td style="width:147px;">FHC, Inc</td>
			<td style="width:119px;">30-30-0</td>
			<td style="width:167px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Model P-97 Needle Puller</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:216px;">Dextran, Rhodamine Green</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7163</td>
			<td style="width:167px;">If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td style="width:147px;">Doctors Foster and Smith</td>
			<td style="width:119px;">CD-116528</td>
			<td style="width:167px;">Also available in many pet stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

Echinoderms כבר זמן רב מערכת מודל מועדף למחקרים של רבייה והתפתחות, ולאחרונה לחקר ויסות הגנים והאבולוציה של תהליכים התפתחותיים. כוכב הים, Patiria miniata, הוא צובר שכיחות כמערכת מודל למחקרים מסוג שבוצעו באופן כמעט בלעדי בעבר בקיפודי הים, purpuratus Strongylocentrotus וvariegatus Lytechinus. יתרון של מערכות מודל אלה הוא הקלות של יצירת עוברים שונה שבגן מסוים הוא למעלה או downregulated, תיוג קבוצה של תאים, או החדרת גן כתב. שיטת microinjection בודדת מסוגלת לייצר מגוון רחב של עוברים שונה כגון. כאן, אנו מציגים שיטה לקבלת תאי רבייה מפ miniata, הפקת zygotes, והחדרת חומרים כימיים מדאיגים באמצעות microinjection. עוברי morphant בריאים מבודדים לאחר מכן למחקרים כמותיים ואיכותיים של geפונקצית ne. הזמינות של נתוני הגנום וtranscriptome לאורגניזם זה הגדילה את סוגי מחקרים שמבוצעים ואת הקלות של ביצועם.

המטרה של פרוטוקול זה היא להציג את חומרים כימיים לעוברי. אנו מדגימים את היעילות של הפרוטוקול על ידי הזרקה לבנות כתב DNA שמניע את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). עובר מוזרק להביע GFP בתיקונים משובטים (איור 4A-B) כDNA משלב במהלך המחשוף מוקדם. ריאגנטים רבים הנמצאי...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes at JoVE.com

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

שיטות המייצרות עוברי morphant חיוניות ללמוד מנגנוני התפתחות ורשתות רגולציה גן. כוכב הים Patiria miniata הוא מערכת מודל מתעורר ללימודים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת תאי רבייה, בהפקת תרבויות של עוברים, וmicroinjection המהיר של zygotes ממין זה.

שיטה לMicroinjection של<em&gt; Minata Patiria</em&gt; Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Microinjection עוברים א aegypti לקבל יתושים טראנסגנטי

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

השימוש Rotorod כשיטה לניתוח איכותי של הליכה עכברוש

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

טיהור הזרימה Cytometry מבוסס<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; זיגוטות

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Microinjection מתא בודד לניתוח תקשורת נייד

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...