Name: a method for microinjection of patiria minata zygotes
Uploaded: 2014-09-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation IOS 0844948 og IOS 1024811

Hold alle sjøvann eller kunstig sjøvann (SW), voksne dyr og kulturer ved 15 ° C så mye som praktisk mulig. Sørg for egg og zygotes holdes nedsenket i SV. Kommersielt forberedt sjøsalt rekonstituert med destillert eller omvendt osmose vann fungerer godt som en kilde til SW. Kontroller saltinnhold ved hjelp av et hydrometer og justere salter eller vann for å oppnå optimale nivåer. Hold Spesifikk vekt nivåer mellom 1,020 til 1,025. Hold alle glass og plasticware atskilt fra alle andre...

<ol>
	<li>Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fluorescence+in+thick+specimens,+with+an+application+to+cyclin+B-GFP+expression+in+starfish+oocytes.">Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes.</a> Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).</li><li>Terasaki, M., Runft, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-stage+dependence+for+1-methyladenine+induced+reinitiation+of+meiotic+maturation+in+starfish+oocytes.">Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes.</a> Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).</li><li>O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+multiple+Src+family+kinases+at+fertilization.">Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization.</a> J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).</li><li>McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+wnt+and+frizzled+genes+during+early+sea+star+development.">Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development.</a> Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).</li><li>Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+network+for+neurogenesis+in+a+sea+star+embryo+connects+broad+neural+specification+and+localized+patterning.">Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).</li><li>McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+embryonic+skeletogenic+mesenchyme+lineage+in+a+sea+cucumber+reveals+the+trajectory+of+change+for+the+evolution+of+novel+structures+in+echinoderms.">Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms.</a> EvoDevo. 3, 17 (2012).</li><li>Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+cluster+and+chordate-like+expression+of+ParaHox+genes+in+a+sea+star.">Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star.</a> BMC Biol. 11, 68 (2013).</li><li>Morino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+activation+of+VEGF+signaling+and+the+evolution+of+the+skeleton+in+echinoderm+pluteus+larvae.">Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae.</a> Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).</li><li>Hart, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+the+sea+star+egg+receptor+for+sperm+bindin.">Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin.</a> Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).</li><li>McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergence+genetics+analysis+reveals+historical+population+genetic+processes+leading+to+contrasting+phylogeographic+patterns+in+co-distributed+species.">Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species.</a> Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).</li><li>Keever, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discordant+distribution+of+populations+and+genetic+variation+in+a+sea+star+with+high+dispersal+potential.">Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential.</a> Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).</li><li>Lambert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. , (2000).</li><li>Dor&#233;e, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+control+of+meiosis:+specificity+of+the+1-methyladenine+receptors+in+starfish+oocytes.">Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).</li><li>Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+gene+regulatory+network+architecture+across+500+million+years+of+echinoderm+evolution.">Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).</li><li>Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+the+evolutionary+act:+precise+cis-regulatory+basis+of+difference+in+the+organization+of+gene+networks+of+sea+stars+and+sea+urchins.">Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins.</a> Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).</li><li>McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+gene+regulatory+network+subcircuit+drives+different+developmental+fates+in+the+vegetal+pole+of+highly+divergent+echinoderm+embryos.">A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos.</a> Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).</li><li>Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+and+handling+echinoderm+oocytes.">Obtaining and handling echinoderm oocytes.</a> Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).</li><li>Sweet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastomere+isolation+and+transplantation.">Blastomere isolation and transplantation.</a> Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).</li><li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs.">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).</li><li>Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantropic+retroviruses+as+a+transduction+tool+for+sea+urchin+embryos.">Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).</li></ol>

Det er to viktige skritt som er vanskelig for uerfarne brukere av denne teknikken, men er avgjørende for å lykkes med å skape morphant embryoer. Den første er å velge sunne ubefruktede egg som vil modnes og gjødsle riktig. Prosentandelen av normal utvikling i en kultur avhenger av årstid, helsen til dyret, og det antall ganger som oocytter er blitt høstet fra et enkelt individ. Ubefruktede egg har en tendens til å være av bedre kvalitet fra april til oktober. Det er viktig å se nøye på oocyttene før fortse...

The sea star, Patiria miniata, (kjent som balltre stjerne) fremstår som en interessant og allsidig modellsystem for en rekke cellulære 1- 3, utviklings 4,5, evolusjonær 6- 8, og økologiske studier 9- 11. Voksen P. miniata er fordelt langs Stillehavskysten fra Sitka, Alaska til Baja, California 12 og er lett vedlikeholdt i marine akvarier. Ubefruktede egg er oppnåelig året og hver hunn kan kaste titusener av egg. Ubefruktede egg er lett modnet og befruktet eksternt 13. De resulterende embryoene er gjennomsiktige slik at for enkel observasjon; de utvikler seg synkront, og krever kun sjøvann for utvikling. Hele genomet montering og flere transcriptomes er også tilgjengelig for P. miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). Slike fordeler gjør dem ideelle for en rekke forskningog undervisningsformål. I de senere årene, P. miniata har blitt et modellsystem for utviklings genet regulatoriske nettverk analyserer 14- 16. Formålet med slike studier er å identifisere hele kompliment av regulatoriske gener og bestemme nettverk av deres vekselvirkninger. Mye av dette arbeidet innebærer perturbing genuttrykk gjennom innføring av antisense oligonukleotider eller in vitro syntetisert mRNA. I tillegg er cis-regulatoriske analysene brukt til å karakterisere funksjonen av regulatoriske DNA 15.. Disse analysene krever innføring av perturbasjons-reagenser og / eller reporter DNA konstruerer i embryoer. Videre, for å karakterisere de nedstrøms virkningen av disse forstyrrelser må man analysere mange embryoer for endringer i genekspresjon av potensielle mål. Teknikker for mikroinjeksjon av mange hundre zygotes er sentrale for dette arbeidet. Pigghuder, inkludert P. miniata </em&gt;, krever mange måneder å nå seksuell modenhet. På grunn av dette, er det generelt ikke praktisk å utvikle og opprettholde transgene linjer i disse dyr for eksperimentering. Derfor oppdrett av transgene voksne kan ikke effektivt create endret embryoer. I stedet må perturbation oppstå de novo gjennom mikroinjeksjon. Mikroinjeksjon tilbyr en mulighet til å modifisere embryoer med reagenser som ikke er cellepermeable. Den følgende protokoll beskriver en fremgangsmåte for å introdusere DNA, mRNA, celle tracere, og morfolino antisens oligonukleotider inn i hundrevis av befruktede egg i en 2-3 timers sitter gjennom mikroinjeksjon. Dette gir tilstrekkelig materiale for en rekke nedstrøms eksperimenter, inkludert, men ikke begrenset til, qPCR, in situ hybridisering, RNA-Seq, og western blotting.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1-Methyladenine</td>
			<td style="width:147px;">Acros Organics (Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:119px;">AC20131-1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">190 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0185-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">100 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0105-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Capillary tubing</td>
			<td style="width:147px;">FHC, Inc</td>
			<td style="width:119px;">30-30-0</td>
			<td style="width:167px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Model P-97 Needle Puller</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:216px;">Dextran, Rhodamine Green</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7163</td>
			<td style="width:167px;">If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td style="width:147px;">Doctors Foster and Smith</td>
			<td style="width:119px;">CD-116528</td>
			<td style="width:167px;">Also available in many pet stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

Pigghuder har lenge vært en favoritt modellsystem for studier av reproduksjon og utvikling, og mer nylig for studiet av genregulering og utviklingen av utviklingsprosesser. The sea star, Patiria miniata, er å få utbredelsen som modellsystem for disse typer studier som tidligere ble utført nesten utelukkende i kråkeboller, Strongylocentrotus purpuratus og Lytechinus variegatus. En fordel av disse modellsystemer er den enkle fremstilling av modifiserte embryoer hvor et bestemt gen er opp eller nedregulert, merking av en gruppe av celler, eller ved å introdusere et reporter gen. En enkelt mikroinjeksjon fremgangsmåte er i stand til å skape et bredt utvalg av slike modifiserte embryoer. Her presenterer vi en metode for innhenting av kjønnsceller fra P. miniata, produsere zygotes, og innføre forstyrrende reagenser via mikroinjeksjon. Sunn morphant embryoer senere blir isolert for kvantitative og kvalitative studier av gene funksjonen. Tilgjengeligheten av genomet og transkriptom data for denne organismen har økt de typer studier som er utført og den enkle utfører dem.

Målet med denne protokollen er å innføre reagenser inn embryoer. Vi viser effektiviteten av protokollen ved å injisere en reporter DNA konstrukt som driver ekspresjonen av grønt fluorescerende protein (GFP). Injisert embryoer uttrykker GFP i klonale patcher (Figur 4A-B) som DNA inkorporerer under tidlig cleavage. Mange reagenser som er ønskelig å innføre i embryoer er giftige i høye mengder og til suboptimale grupper av embryoer. Toksisitet manifesterer ved å forsinke utvikling, arrestere utvi...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes at JoVE.com

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Metoder som produserer morphant embryoer er avgjørende for å studere utviklingsmessige mekanismer og gen regulatoriske nettverk. The sea star Patiria miniata er en ny modellsystem for disse studiene. Her presenterer vi en protokoll for å oppnå kjønnsceller, produsere kulturer av embryoer, og rask mikroinjeksjon av zygotes fra denne arten.

En metode for Mikroinjeksjon av<em&gt; Patiria minata</em&gt; zygoter

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flowcytometri-basert Rensing av<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygoter

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Encellede Mikroinjeksjon for Cell Communication analyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Høy gjennomstrømning Microinjections av Sea Urchin zygoter

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

I Vivo Mikroinjeksjon og Electroporation mus Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...