Name: real time measurements of membrane protein:receptor interactions using surface plasmon resonance (spr)
Uploaded: 2014-11-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR at JoVE.com

Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.

1. Protein Utvalg og Buffer Forberedelse <ol><li> Prøvepreparering: rense proteinene av interesse, og sørge for at alle aggregater er fjernet, ved injisering av proteinet før forsøket på en gel-filtreringskolonne eller ved ultrasentrifugering (vanligvis 10 minutter ved 100 000 xg er tilstrekkelig). MERK: Selv om ønskelig, svært rene proteinpreparater er ikke et must. SPR har blitt brukt med mindre enn perfekt renselser og selv med total ekstrakt 8,9. </li><li> Buffer forberedelse: <ol><li> For...

<ol>
	<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+surface+plasmon+resonance+biosensor+analysis.">Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. H. i. g. h. e. r. -. t. h. r. o. u. g. h. p. u. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).</li><li>Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+label-free+bio-sensing+of+molecular+interactions+by+surface+plasmon+resonance:+a+laboratory+medicine+perspective.">Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective.</a> The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).</li><li>Kyo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+MafG+interaction+with+Maf+recognition+element+arrays+by+surface+plasmon+resonance+imaging+technique.">Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique.</a> Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).</li><li>Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+studies+of+RNA&#8211;protein+interactions+using+surface+plasmon+resonance.">Kinetic studies of RNA&#8211;protein interactions using surface plasmon resonance.</a> Methods. 26, 95-104 (2002).</li><li>Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+molybdate/tungstate+ABC+transporters+that+interact+very+differently+with+their+substrate+binding+proteins.">Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).</li><li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation.">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li><li>Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Detection+of+Proteins+in+Crude+Cell+Lysate+with+Antibody+Arrays+by+a+Surface+Plasmon+Resonance+Imaging+Technique.">Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique.</a> Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).</li><li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+protein+kinase+activities+of+cell+lysates+using+peptide+microarrays+based+on+surface+plasmon+resonance+imaging.">Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging.</a> Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).</li><li>Mol, N., Fischer, M. E., Mol, N. J., Fischer, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. 1, 1-14 (2010).</li><li>Van Der Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface plasmon resonance. Protein&#8211; ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , 137-170 (2001).</li><li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation.">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li></ol>

SPR er en svært følsom metode for å studere molekylære interaksjoner, og er ofte den eneste tilnærming som gir sanntids overvåking av forbigående (men viktige) interaksjoner. Et eksempel er transient interaksjon presentert heri, som ikke kunne påvises ved hvilken som helst annen metode (pull-down-analyser, liposomer sedimente assays 6). Videre, mens andre fremgangsmåter er begrenset til likevekt målinger (enten kvantitativt eller kvalitativt), er SPR et av de få teknikker som måler også pre-likev...

Protein-protein interaksjoner (PPI); dannelse og dissosiasjon av proteinkomplekser, er sentrale hendelser i mange biologiske prosesser (f.eks, replikering, transkripsjon, oversettelse, signalisering, celle-celle kommunikasjon). Semi-kvantitative studier av PPI blir ofte utført ved hjelp av rullegardin eller immunutfellingen eksperimenter. Imidlertid er disse (og liknende) teknikker er begrenset i området fra affiniteter som kan måles (lavt mikromolområde og høyere affinitet) på grunn av vasketrinnene som er iboende i slike teknikker. Slike &quot;end-point&quot; teknikker kan ikke identifisere forbigående eller lav affinitet interaksjoner som ofte er av stor biologiske konsekvenser. I tillegg er den tidsmessige oppløsningen av slike metoder ytterst begrenset, vanligvis flere størrelsesordener langsommere enn utbredelsen av reaksjonen. SPR overvinner disse mangler på grunn av sin økt følsomhet og overlegen tidsmessig oppløsning 1,2. SPR er en etikett-fri metode, og som sådanmolekylær interaksjon kan måles (så lenge masse endringene kan bli detektert). I tillegg til PPI, har det vært mye brukt for å karakterisere protein-ligand, protein-medikament (eller lite molekyl), protein-DNA og protein-RNA interaksjoner 3-5. Resultatene er registrert og plottet i sann tid, noe som muliggjør hurtig endring av eksperimentelle betingelser og eksperimentelle fleksibel utforming. Den fysiske prinsippet bak SPR baserte instrumenter er utnyttelsen av et optisk system som måler en endring av brytningsindeksen på sensoroverflaten når massen endres 2. En av de samvirkende partnere (heretter ligand) immobilisert på en polymer matrise chip og andre molekyl (heretter analytt) føres over overflaten. Analytt å bindes til liganden forandrer massen på chip overflaten. Denne masseendring er direkte og proporsjonalt relatert til endringer i brytningsindeksen til overflaten. Resultatene er plottet i sanntid ogpresenteres som respons heter (RU), som en funksjon av tid. Et slikt plott er betegnet en sensogram (f.eks, figur 1). Siden SPR følger hele tidsforløpet av interaksjonen, blir pre-likevektskinetiske hastighetskonstanter avledet, i tillegg til likevekt affiniteter. Som beskrevet nedenfor, har den pre-likevekt oppførselen til et gitt system mye informasjon, og gir et helt annet perspektiv enn likevekt alene. Når systemet er kalibrert forsøk er meget rask og krever bare små mengder av proteinmaterialet (mikrogram til nanogram mengder). Oppsamling av det komplette bevegelsesinformasjon for et gitt system kan oppnås i løpet av dager. Den høye følsomheten SPR gir målinger som ikke er mulig å bruke noen annen teknikk 6. Dette er imidlertid høy følsomhet en &quot;tveegget sverd&quot; siden det kan være en viktig kilde for falske positive data. Annen faktor som påvirker reflekterende indeksen er registrert og plottet på sensogram. Som sådan, apsikts kontroller må brukes til å eliminere falske positiver, og støtte fra komplementære tilnærminger er svært oppmerksom. Figur 1 illustrerer utviklingen av en SPR eksperiment ved bruk av en NTA-belagt sensor chip. Den sensogram i panel A viser injeksjon av nikkelioner over NTA matrisen (unsubtracted data), og paneler BD vise dataene etter å subtrahere det signal som utledes fra den negative kontrollcellen. Rød og blå pilene viser injeksjon start og slutt, henholdsvis. Immobilisering av liganden på brikken gradvis forandrer massen før injeksjonen er avsluttet. Den stabile platå observert etter avslutning av ligand s injeksjon reflekterer stabil assosiasjon av liganden til overflaten (figur 1B, syklus 2). Når en stabil grunnlinje er oppnådd en buffer blir injisert i løpet av liganden og referansecellen (figur 1B, syklus 3) .Dette injeksjon tjener som en &quot;blindprøve&quot; og vil blitrekkes under analysen. Ved injeksjon, er mindre endringer registreres, noe som reflekterer en strømning av massen gjennom brikken. Så i en egen syklus (figur 1B, syklus 4), blir analytten injisert; den gradvise økning i RU representerer analytten tilknytning til liganden. Bindingssetene blir gradvis opptatt inntil likevekt er nådd. Så snart injeksjonen ender, en nedgang i jernbaneforetak reflekterer kompleksets dissosiasjon. Fra slike sensograms pre-likevekt og likevekts hastighetskonstanter kan avledes (se senere). Figur 1 viser en transient interaksjon mellom liganden og analytten. Når samspillet er mer stabil, er nedgangen i RU nivå tregere, noe som reflekterer en lavere k d. Heri, beskriver vi en SPR eksperiment som tar sikte på å karakterisere interaksjonen mellom en membran transportør (vaskemiddel oppløst) og dens funksjonelle partner, dens beslektede substrat bindende protein 6,7. Den valgte model-systemet er en ATP bindende kassett (ABC) transporter, ModBC-A av Archeaglobus fulgidus. Dette systemet ble valgt for sin svært reproduserbare resultater, høy signal til støyforhold, og klassisk &#39;on / off &quot;priser. I tillegg homologer ABC transportører er tilgjengelige for å tjene som viktige negative kontroller. Transportøren, ModBC (ligand A) ekstraheres fra membranen ved hjelp av vaskemiddel, renset og immobilisert på chipen. Sin løselig samspill partner, Moda, er analytten. Som en negativ kontroll-ligand, er en annen ABC-transportør RbsBC brukt (&quot;ligand B&quot;).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sensor Chip NTA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">14100532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BIAevaluation</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Biacore T200 Software&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Nickel chloride</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium tungstate dihydrate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T2629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Lab LTD.</td>
			<td style="width:119px;">19030591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Trizma base</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:209px;">Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:209px;">n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:107px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Sodium dodecyl sulfate solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Kimwipes KIMTECH</td>
			<td style="width:107px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:107px;">GADOT</td>
			<td style="width:119px;">7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon (NY) Membrane Filter</td>
			<td style="width:107px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">25007--47------N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">ModBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">RbsBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">ModA Substrate Binding Protein</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time measurements of membrane protein:receptor interactions using surface plasmon resonance (spr)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

I det system som her er beskrevet, er en NiNTA brikke brukes for å immobilisere His-tagget membran transportør 6,7. Å være en homo-dimer er hver transporter dobbelt merket, forbedre sin binding til NiNTA chip. Etter nikkel lasting, ligand A (den transportør av interesse) er immobilisert på Fc = 2, opp til ~ 3500 RU (protokoll syklus 2, Figur 2A black label). Deretter, ved bruk av samme injeksjonsstrøm og varighet, ligand B (kontroll-ligand) blir injisert på Fc = 1, først nådde bare ...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR at JoVE.com

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Overflate-plasmonresonans (SPR) er en etikett-fri fremgangsmåte for detektering av bio-molekylære vekselvirkninger i sanntid. Heri, en protokoll for en membran protein: er reseptorinteraksjon eksperiment beskrevet, mens de diskuterer fordeler og ulemper med teknikken.

Real Time Målinger av Membrane Protein: Receptor Interaksjoner Bruke Surface plasmonresonans (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Real-time overvåkning av Ligand-reseptor interaksjoner med Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Grådighet-basert Ekstracellulær Interaction Screening (AVEXIS) for Scalable Detection of Low-affinitet ekstracellulære Receptor-ligand interaksjoner

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Real-time analyser av Retinol Transport av membranen Receptor av Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Gransker Protein-protein interaksjoner i levende celler ved hjelp Bioluminesens Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics med variabel vinkel epifluorescens Mikros

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Skanning elektronmikroskopi (SEM) Protokoller for Problema Plant, eggsporesopper, og Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

FLIM-FRET Målinger av protein-protein interaksjoner i levende bakterier.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...