Name: real time measurements of membrane protein:receptor interactions using surface plasmon resonance (spr)
Uploaded: 2014-11-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR at JoVE.com

Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.

1. A amostra de proteína e tampão de preparação de <ol><li> Preparação da amostra: purificar as proteínas de interesse e certificar-se de todos os agregados são removidos, através da injecção da proteína antes da experiência, numa coluna de filtração em gel ou por ultracentrifugação (geralmente de 10 minutos a 100.000 xg é suficiente). Nota: Embora desejáveis, preparações de proteínas altamente puras não são uma obrigação. SPR tem sido usado com sucesso com purificações menos-que-per...

<ol>
	<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+surface+plasmon+resonance+biosensor+analysis.">Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. H. i. g. h. e. r. -. t. h. r. o. u. g. h. p. u. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).</li><li>Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+label-free+bio-sensing+of+molecular+interactions+by+surface+plasmon+resonance:+a+laboratory+medicine+perspective.">Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective.</a> The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).</li><li>Kyo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+MafG+interaction+with+Maf+recognition+element+arrays+by+surface+plasmon+resonance+imaging+technique.">Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique.</a> Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).</li><li>Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+studies+of+RNA&#8211;protein+interactions+using+surface+plasmon+resonance.">Kinetic studies of RNA&#8211;protein interactions using surface plasmon resonance.</a> Methods. 26, 95-104 (2002).</li><li>Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+molybdate/tungstate+ABC+transporters+that+interact+very+differently+with+their+substrate+binding+proteins.">Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).</li><li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation.">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li><li>Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Detection+of+Proteins+in+Crude+Cell+Lysate+with+Antibody+Arrays+by+a+Surface+Plasmon+Resonance+Imaging+Technique.">Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique.</a> Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).</li><li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+protein+kinase+activities+of+cell+lysates+using+peptide+microarrays+based+on+surface+plasmon+resonance+imaging.">Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging.</a> Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).</li><li>Mol, N., Fischer, M. E., Mol, N. J., Fischer, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. 1, 1-14 (2010).</li><li>Van Der Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface plasmon resonance. Protein&#8211; ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , 137-170 (2001).</li><li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation.">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li></ol>

SPR é um método altamente sensível para estudar interações moleculares, e muitas vezes é a única abordagem que permite o monitoramento em tempo real das interações transitórios (mas importantes). Um exemplo é a interacção transiente aqui apresentada, que não poderia ser detectado por qualquer outro método (ensaios de pull-down, ensaios de lipossomas de sedimentação 6). Além disso, enquanto que outros métodos são limitados ao equilíbrio medições (seja qualitativo ou quantitativo), SPR é...

Interacções proteína-proteína (PPI); a formação e dissociação de complexos de proteínas, são eventos chave em muitos processos biológicos (por exemplo, a replicação, transcrição, tradução, sinalização, comunicação célula-célula). Estudos semi-quantitativa da PPI são muitas vezes realizados experimentos usando imuno-precipitação pull-down ou. No entanto, estas técnicas (e semelhantes) estão limitados na gama de afinidades que pode ser medida (micromolar baixa e maior afinidade), devido aos passos de lavagem que são inerentes a tais técnicas. Tais técnicas &quot;ponto final&quot; não é possível identificar interações afinidade transitórios ou baixos que muitas vezes são de grandes consequências biológicas. Além disso, a resolução temporal de tais abordagens é extremamente limitada, geralmente ordens de grandeza mais lento do que as taxas de reacção. SPR supera essas deficiências devido à sua sensibilidade e resolução temporal superior a 1,2. SPR é um método livre de marcador, e como talinteracção molecular pode ser medida (desde que as mudanças de massa pode ser detectado). Em adição a PPI, que tem sido extensamente usado para a caracterização da proteína-ligando, proteína-fármaco (ou molécula pequena), de ADN-proteína, e interacções proteína-RNA 3-5. Os resultados são registados e representados graficamente em tempo real, que permite a modificação rápida das condições experimentais e desenho experimental flexível. O princípio por trás física instrumentos baseados SPR é a utilização de um sistema óptico que mede uma alteração do índice de refracção na superfície do sensor sobre a massa muda 2. Um dos parceiros de interacção ligando (daqui em diante) é imobilizada num chip de matriz de polímero e a segunda molécula (a seguir analito) é feito fluir através da superfície. Ligação do analito ao ligando altera a massa na superfície do chip. Essa mudança de massa é direta e proporcionalmente relacionada a mudanças no índice de refração da superfície. Os resultados são representados graficamente em tempo real eapresentadas como unidades de resposta (RU) como uma função do tempo. Uma tal trama é denominado um sensogram (por exemplo, Figura 1). Desde SPR segue o curso completo do tempo de interacção, pré-equilíbrio constantes de velocidade são derivados, em adição ao equilíbrio afinidades. Tal como pormenorizado abaixo, o comportamento de pré-equilíbrio de um dado sistema mantém muita informação, e fornece uma perspectiva muito diferente do que o equilíbrio sozinho. Uma vez que o sistema é calibrado, as experiências são muito rápidos e exigem apenas pequenas quantidades de material de proteína (microgramas de quantidades de nanogramas). A recolha de informação cinética completa de um dado sistema pode ser conseguida em dia. A elevada sensibilidade da SPR proporciona medições que não são possíveis usando qualquer outra técnica de 6. No entanto, essa alta sensibilidade é uma &quot;faca de dois gumes&quot;, pois pode ser uma importante fonte de dados falsos positivos. Qualquer fator que afeta o índice de reflexão é gravado e plotados no sensogram. Como tal, apcontroles ade- deve ser usado para eliminar falsos positivos, e apoio de abordagens complementares é altamente recomendado. A Figura 1 ilustra a progressão de uma experiência de SPR utilizando um chip sensor revestido-NTA. O sensogram no painel A mostra a injecção dos iões de níquel sobre a matriz de NTA (dados unsubtracted), e painéis BD exibir os dados depois de subtrair o sinal obtido a partir da célula de controlo negativo. Setas vermelhas e azuis mostram início de injeção e final, respectivamente. A imobilização do ligando para o chip altera gradualmente até que a massa de injecção é terminada. O patamar estável observada após o término da injecção do ligando reflecte a associação estável do ligando à superfície (Figura 1B, ciclo 2). Uma vez que uma linha de base estável é conseguido um tampão é injectado sobre o ligando e a célula de referência (Figura 1B, ciclo 3) .Este injecção serve como um &quot;controlo em branco&quot;, e serásubtraída durante a análise. Após a injecção, pequenas alterações são registadas, reflectindo um fluxo de massa através do chip. Em seguida, num ciclo separado (Figura 1B, ciclo 4), o analito é injectado; o aumento gradual no RU representa associação da substância ao ligando. Os sítios de ligação tornar-se gradualmente ocupada até que o equilíbrio seja atingido. Assim que termina a injeção, um declínio nos RUs reflete dissociação do complexo. A partir de tais sensograms constantes da taxa de pré-equilíbrio e equilíbrio podem ser derivadas (ver mais adiante). A Figura 1 representa uma interacção transiente entre o ligando e o analito. Quando a interação é mais estável, a queda no nível de RU é mais lento, refletindo uma menor k d. Relata-se um experimento SPR teve como objetivo caracterizar a interação entre um transportador de membrana (detergente solubilizado) e seu parceiro funcional proteína 6,7, ligando o seu substrato cognato. O mod escolhidosistema el é um transportador de ATP cassete de ligação (ABC), ModBC-A da Archeaglobus fulgidus. Este sistema foi escolhido por seus resultados altamente reprodutíveis, alta relação sinal-ruído, e clássica &quot;on / off&quot; taxas. Além disso, os transportadores homólogos ABC estão disponíveis para servir como controlos negativos importantes. O transportador, ModBC (ligante A) é extraído a partir da membrana usando detergentes, purificada e imobilizada sobre o chip. Seu parceiro interagindo solúvel, moda, está a analisar. Como um ligando de controlo negativo, um transportador ABC RbsBC diferente é usado (&quot;ligando B&quot;).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sensor Chip NTA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">14100532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BIAevaluation</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Biacore T200 Software&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Nickel chloride</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium tungstate dihydrate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T2629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Lab LTD.</td>
			<td style="width:119px;">19030591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Trizma base</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:209px;">Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:209px;">n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:107px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Sodium dodecyl sulfate solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Kimwipes KIMTECH</td>
			<td style="width:107px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:107px;">GADOT</td>
			<td style="width:119px;">7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon (NY) Membrane Filter</td>
			<td style="width:107px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">25007--47------N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">ModBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">RbsBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">ModA Substrate Binding Protein</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time measurements of membrane protein:receptor interactions using surface plasmon resonance (spr)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

No sistema aqui descrito, um chip NiNTA é usado para imobilizar o transportador de membrana marcada com His 6,7. Sendo um homo-dímero, cada transportador é duplamente marcado, melhorando a sua ligação ao chip NiNTA. Após o carregamento de níquel, ligando A (o transportador de interesse) é imobilizada em Fc = 2, até ~ 3500 RU (ciclo de protocolo 2, Figura 2A tarja preta). Em seguida, utilizando o mesmo caudal e da duração da injecção, ligando B (do ligando de controlo) injecta-se ...

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Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Superfície Plasmon Resonance (SPR) é um método livre de marcador para a detecção de interacções biomoleculares em tempo real. Nisto, um protocolo para uma proteína de membrana: interação experimento receptor é descrita, ao discutir os prós e contras da técnica.

Medições em tempo real de proteína de membrana: Receptor Interações Usando Superfície Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Research

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