Name: in vitro synthesis of modified mrna for induction of protein expression in human cells
Uploaded: 2014-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل الصناديق الاجتماعية الأوروبية في بادن-فورتمبيرغ، ألمانيا.

1. تكبير البلازميدات المحتوية المطلوبة الترميز تسلسل الحمض النووي (CDS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الدافئ المتوسطة SOC، والتي يتم تضمينها في عدة التحول، إلى درجة حرارة الغرفة و لوحات أجار LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين إلى 37 درجة مئوية...

<ol>
	<li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR-mRNA+delivery:+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+&amp;#34;gene+therapy&amp;#34;.">CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis &amp;#34;gene therapy&amp;#34;.</a> The journal of gene medicine. , (2013).</li><li>Benteyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+an+Optimized+Wilms&amp;#34;+Tumor+1+(WT1)+mRNA+Construct+for+Enhanced+WT1+Expression+and+Improved+Immunogenicity+In+Vitro+and+In+Vivo.">Design of an Optimized Wilms&amp;#34; Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo.</a> Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134 (2013).</li><li>Petsch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+in+vitro+synthesized,+specific+mRNA+vaccines+against+influenza+A+virus+infection.">Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection.</a> Nature. 30, 1210-1216 (2012).</li><li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA.">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature protocols. 8, 568-582 (2013).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA.">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).</li><li>Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+fibroblasts+to+pluripotent+stem+cells+using+mRNA+of+four+transcription+factors.">Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors.</a> Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).</li><li>Anderson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+enhances+translation+by+diminishing+PKR+activation.">Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation.</a> Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).</li><li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors:+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA.">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23, 165-175 (2005).</li><li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability.">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).</li><li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA:+implication+for+therapeutic+RNA+development.">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current opinion in drug discovery &amp; development. 10, 523-532 (2007).</li><li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1.">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+gene+therapy+for+X-linked+severe+combined+immunodeficiency.">Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency.</a> The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).</li><li>Avci-Adali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+conditions+for+successful+transfection+of+human+endothelial+cells+with+in+vitro+synthesized+and+modified+mRNA+for+induction+of+protein+expression.">Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression.</a> Journal of biological engineering. 8, 8 (2014).</li></ol>

العلاج مرنا لديها امكانات هائلة في مجال الطب التجديدي والعلاج من الأمراض والتلقيح. في هذا الفيديو، ونحن لشرح إنتاج، مرنا استقرت تعديل لتحريض التعبير البروتين في الخلايا. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن أن تتولد مرنا المطلوبة الأخرى. توليف في المختبر المعدلة مرن?...

في الخلايا، ونسخ من الرنا المرسال (مرنا) وترجمة التالية مرنا في البروتينات المطلوبة ضمان الأداء السليم للخلايا. اضطرابات وراثية وراثية أو مكتسبة يمكن أن يؤدي إلى تخليق كافية ومختلة من البروتينات ويسبب أمراضا خطيرة. وبالتالي، فإن النهج العلاجي الجديد للحث على إنتاج البروتينات الناقصة أو المعيبة هو تسليم خارجي من تأليفي تعديل مرنا في الخلايا، والتي رموز للبروتين المطلوب. وبالتالي، يتم تشغيلها الخلايا لتخليق البروتينات الوظيفية، والتي عادة لا يمكن أن تنتج أو أن بطبيعة الحال لا تحتاج إليها. باستخدام هذا النهج، والاضطرابات الوراثية يمكن تصحيحها عن طريق إدخال مرنا أن رموز لمعيب أو مفقود البروتين 1. ويمكن أيضا العلاج مرنا استخدامها في التطعيم لsynthetize المستضدات البروتينية، والتي يتم التعبير عنها من قبل خلايا الورم أو مسببات الأمراض. وبالتالي، مضيفة نظام المناعة يمكن تنشيط فعال للقضاء على الخلايا السرطانية أو منع infections 2،3. وعلاوة على ذلك، في السنوات الأخيرة، وقد استخدم بنجاح مرنا لتوليد الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs). لهذا الغرض، و transfected الخلايا الليفية مع من mRNAs للحث على التعبير عن برمجة عوامل 4-6 وتحويلها في iPSCs مع إمكانات هائلة في مجال الطب التجديدي. في السابق، كان مرتبطا استخدام مرنا التقليدي مع انخفاض واستقرار قوي المناعية. وبالتالي، والتطبيقات السريرية للمن mRNAs التقليدية كانت محدودة. ومع ذلك، فإن استبدال سيتيدين ويوريدين بنسبة 5-methylcytidine وسودويوريدين داخل جزيء الرنا المرسال بواسطة Kariko وزملاؤه جعل جزيئات مرنا مستقرة في السوائل البيولوجية وخفضت بشكل كبير تنشيط جهاز المناعة 7-10، والذي يسمح الآن انطباق السريري من mRNAs المعدلة. استخدام من mRNAs تعديل المنتجة صناعيا، ونصوص الجين المطلوب يمكن تسليمها مؤقتا في الجسم الحي 11أو في المختبر للحث على البروتين التعبير. تتم ترجمة مرنا قدم تحت الظروف الفسيولوجية من قبل الأجهزة الخلوية الترجمة. نظرا لعدم الاندماج في جينوم الخلية المضيفة مقارنة الفيروسية ناقلات العلاج الجيني، يتم منع خطر تكون الورم 12،13. وبالتالي، فإن العلاج باستخدام مرنا الاصطناعية تعديل تتحسن قبول السريرية في المستقبل. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لإنتاج المعدلة ومرنا (الشكل 1)، ترنسفكأيشن من الخلايا مع مرنا وتقييم تعبير البروتين في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1058">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:172px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:435px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cell culture</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:157px;">PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>M11-004</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS without calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.04% Trypsin / 0.03% EDTA&#160;</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-41020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TNS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-41120</td>
			<td style="width:435px;">Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK-293 cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Consumables</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates, 12-well&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Cell culture flask (75 cm2)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.589</td>
			<td>Safe-Lock, Biopur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 ml conical tubes&#160;</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:295px;">PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;">10 &#181;l: 022491202,&#160;&#160;&#160; 100 &#181;l: 022491237, 1000 &#181;l: 022491253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryovial</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>122279-128</td>
			<td>Cryo.s&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid amplification and purification</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA 3.3_eGFP Plasmid&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Addgene</td>
			<td>26822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">One Shot Top10 chemically component Escherichia coli&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C4040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile water (Ampuwa)</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>1636071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">LB medium (Luria/Miller)&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td>Dissolve 25 g l-1 in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">LB agar (Luria/Miller)&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X969.1</td>
			<td>Dissolve 40 g l-1 in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin Ready Made Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>100 mg/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mRNA production</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStar HiFidelity Polymerase Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>202602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript T7 Kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Methylcytidine-5&#180;-triphosphate&#160;</td>
			<td>Trilink</td>
			<td>N1014</td>
			<td>5-Methyl-CTP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pseudouridine-5&#180;-triphosphate&#160;</td>
			<td>Trilink</td>
			<td>N1019</td>
			<td>Pseudo-UTP</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:295px;">3&#180;-O-Me-m7G(5&#180;)ppp(5`)G RNA cap structure analog&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1411L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RiboLock RNase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>40 U/&#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TURBO DNase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>2 U/&#181;l (from MEGAscript T7 Kit)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antarctic phosphatase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>MO289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy mini kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseZap solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfection</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Cationic lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Opti-MEM I Reduced Serum Media&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11058-021</td>
			<td style="width:435px;">Improved Minimal Essential Medium (MEM) with&#160; reduced Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel electrophoresis</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelred Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>10,000x in water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">peqGOLD Range Mix DNA-Ladder&#160;</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>25-2210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5-10 kb RNA Ladder&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15623-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x TBE buffer</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow cytometry analyses</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellFIX (1x)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340181</td>
			<td>10x concentrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Primer for insert amplification and&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; poly (T) tail PCR</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward Primer (HPLC-grade) 10 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Ella Biotech</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td>5&#180;-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3&#180;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Reverse Primer (HPLC-grade) 10 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Ella Biotech</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td>5&#180;- T120-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3&#180;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cell incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td>CO2 (5%) and O2 (20%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CASY cell counter&#160;</td>
			<td>Sch&#228;rfe System</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Sterile workbench&#160;</td>
			<td style="width:157px;">BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacterial incubator&#160;</td>
			<td>Incutec</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ScanDrop spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Analytic Jena</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermocycler&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex</td>
			<td>peqlab</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel apparatus for electrophoresis&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel documentation system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACScan System&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phase-contrast microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro synthesis of modified mrna for induction of protein expression in human cells

توصيل خارجي من الترميز رسول الاصطناعية RNA (مرنا) لتحريض تخليق البروتين في الخلايا المطلوبة لديه إمكانات هائلة في مجالات الطب التجديدي، بيولوجيا الخلية الأساسية، والعلاج من الأمراض، وإعادة برمجة الخلايا. هنا، نحن تصف خطوة بخطوة بروتوكول لجيل من تعديل مرنا التي تقل إمكانية تنشيط جهاز المناعة وزيادة الاستقرار، ومراقبة الجودة لإنتاج الرنا المرسال، ترنسفكأيشن من الخلايا مع مرنا والتحقق من التعبير البروتين الناجم عن التدفق الخلوي. تصل إلى 3 أيام بعد ترنسفكأيشن واحد مع EGFP مرنا، وتنتج خلايا HEK293 transfected EGFP. في هذه المقالة الفيديو، ووصف تركيب EGFP مرنا على سبيل المثال. ومع ذلك، يمكن تطبيق الإجراء لإنتاج الرنا المرسال المطلوبة الأخرى. باستخدام الاصطناعية تعديل مرنا، والخلايا يمكن أن يتسبب في التعبير عن عابر البروتينات المطلوبة، التي عادة لا تعبر.

باستخدام pcDNA 3.3 بلازميد يحتوي على CDS من EGFP، تأسست توليف تعديل EGFP مرنا (الشكل 1). بعد إدراج التضخيم من قبل PCR وبولي T-المخلفات، تم الكشف عن الفرقة واضحة حيث يبلغ طوله حوالي 1100 سنة مضت (الشكل 2). زيادة الوقت IVT تضاف العائد من مرنا (الشكل 3). بعد IVT، تم ا...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells at JoVE.com

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

في المختبر توليف التعديل مرنا للتحريض التعبير البروتين في الخلايا البشرية

في هذه المقالة الفيديو، ونحن تصف التوليف في المختبر مرنا تعديل لتحريض التعبير البروتين في الخلايا.

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

تنقية م. magneticum سلالة AMB - 1 بروتين المرتبطين Magnetosome MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...