Name: in vitro synthesis of modified mrna for induction of protein expression in human cells
Uploaded: 2014-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells at JoVE.com

פרויקט זה מומן על ידי קרנות החברתיות האירופיות באדן-וירטמברג, גרמניה.

1. הגדלת של פלסמידים המכילים נדרש קידוד רצפי DNA (CDS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני טרום חם SOC, הנכלל בערכת השינוי, לטמפרטורת חדר והצלחות אגר LB המכילים 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין עד 37 מעלות צלזיוס. לאזן את האמבטיה במים עד 42 מעלות צלזיוס. </li><l...

<ol>
	<li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR-mRNA+delivery:+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+&amp;#34;gene+therapy&amp;#34;.">CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis &amp;#34;gene therapy&amp;#34;.</a> The journal of gene medicine. , (2013).</li><li>Benteyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+an+Optimized+Wilms&amp;#34;+Tumor+1+(WT1)+mRNA+Construct+for+Enhanced+WT1+Expression+and+Improved+Immunogenicity+In+Vitro+and+In+Vivo.">Design of an Optimized Wilms&amp;#34; Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo.</a> Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134 (2013).</li><li>Petsch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+in+vitro+synthesized,+specific+mRNA+vaccines+against+influenza+A+virus+infection.">Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection.</a> Nature. 30, 1210-1216 (2012).</li><li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA.">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature protocols. 8, 568-582 (2013).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA.">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).</li><li>Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+fibroblasts+to+pluripotent+stem+cells+using+mRNA+of+four+transcription+factors.">Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors.</a> Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).</li><li>Anderson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+enhances+translation+by+diminishing+PKR+activation.">Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation.</a> Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).</li><li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors:+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA.">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23, 165-175 (2005).</li><li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability.">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).</li><li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA:+implication+for+therapeutic+RNA+development.">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current opinion in drug discovery &amp; development. 10, 523-532 (2007).</li><li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1.">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+gene+therapy+for+X-linked+severe+combined+immunodeficiency.">Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency.</a> The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).</li><li>Avci-Adali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+conditions+for+successful+transfection+of+human+endothelial+cells+with+in+vitro+synthesized+and+modified+mRNA+for+induction+of+protein+expression.">Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression.</a> Journal of biological engineering. 8, 8 (2014).</li></ol>

יש טיפול mRNA פוטנציאל עצום בתחום של רפואת רגנרטיבית, טיפול במחלות וחיסונים. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הייצור של ה- mRNA התייצב, שונה לזירוז של ביטוי חלבון בתאים. שימוש בפרוטוקול זה, יכול להיות שנוצר mRNA הרצוי אחר. הסינתזה במבחנה של mRNA שונה מאפשרת transfection של תאים עם mRN...

בתאים, השעתוק של RNA שליח (mRNA) והתרגום הבא של ה- mRNA לחלבונים רצויים להבטיח את התפקוד התקין של תאים. הפרעות גנטיות תורשתיות או נרכשות יכולות להוביל לסינתזה מספיקה ולא מתפקדת של חלבונים וגורמות למחלות קשות. כך, גישה טיפולית חדשה ללעורר את הייצור של חלבונים חסרים או פגומים הוא המשלוח אקסוגני של סינטטי שונה mRNA לתאים, שקודים לחלבון הרצוי. וכך, תאים מופעלים לסנתז חלבונים פונקציונליים, שבו הם בדרך כלל לא יכולים לייצר או באופן טבעי לא צריכים. שימוש בגישה זו, ניתן לתקן הפרעות גנטיות על ידי הקדמה של mRNA שמקודד לחלבון הפגום או חסר 1. גם טיפול mRNA יכול לשמש לחיסון לאנטיגנים synthetize חלבון, אשר באים לידי ביטוי על ידי תאי גידול או פתוגנים. ובכך, מערכת חיסונית מארח יכולה להיות מופעלת כדי לחסל ביעילות תאים סרטניים או למנוע infections 2,3. יתר על כן, בשנים האחרונות, mRNA היה בהצלחה המשמש לייצור תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs). לצורך כך, fibroblasts היה transfected עם mRNAs לגרום הביטוי של תכנות מחדש גורמי 4-6 ולהמיר אותם בiPSCs עם פוטנציאל עצום ברפואת רגנרטיבית. בעבר, השימוש בmRNA הקונבנציונלי היה קשור ביציבות נמוכה וחיסוני חזקים. כך, יישומים קליניים של mRNAs הקונבנציונלי היו מוגבלים. עם זאת, החלפת cytidine וuridine על ידי 5-methylcytidine וpseudouridine בתוך מולקולת mRNA על ידי Kariko ועמיתים שניתנו מולקולות mRNA יציבים בנוזלים ביולוגיים והפחתה דרמטית בהפעלת מערכת חיסונית 7-10, אשר כעת מאפשרת יישום הקליני של mRNAs שונה. באמצעות מיוצר באופן סינטטי mRNAs שונה, תמלילי גן רצויים יכולים להיות מועברים באופן זמני בvivo 11או במבחנה כדי לגרום לביטוי חלבון. MRNA הציג מתורגם בתנאים פיסיולוגיים על ידי מכונות תרגום הסלולריות. בשל חוסר האינטגרציה לתוך הגנום של התא הפונדקאי לעומת וקטורי ריפוי גנטי נגיפיים, הסיכון של oncogenesis נמנע 12,13. כך, טיפול באמצעות mRNA הסינתטי שונה יקבל קבלה קלינית טובה יותר בעתיד. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לייצור של ה- mRNA שונה, transfection של תאים עם mRNA וההערכה של ביטוי חלבון בתאי transfected (איור 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1058">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:172px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:435px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cell culture</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:157px;">PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>M11-004</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS without calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.04% Trypsin / 0.03% EDTA&#160;</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-41020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TNS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-41120</td>
			<td style="width:435px;">Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK-293 cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Consumables</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates, 12-well&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Cell culture flask (75 cm2)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.589</td>
			<td>Safe-Lock, Biopur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 ml conical tubes&#160;</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:295px;">PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;">10 &#181;l: 022491202,&#160;&#160;&#160; 100 &#181;l: 022491237, 1000 &#181;l: 022491253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryovial</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>122279-128</td>
			<td>Cryo.s&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid amplification and purification</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA 3.3_eGFP Plasmid&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Addgene</td>
			<td>26822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">One Shot Top10 chemically component Escherichia coli&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C4040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile water (Ampuwa)</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>1636071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">LB medium (Luria/Miller)&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td>Dissolve 25 g l-1 in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">LB agar (Luria/Miller)&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X969.1</td>
			<td>Dissolve 40 g l-1 in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin Ready Made Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>100 mg/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mRNA production</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStar HiFidelity Polymerase Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>202602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript T7 Kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Methylcytidine-5&#180;-triphosphate&#160;</td>
			<td>Trilink</td>
			<td>N1014</td>
			<td>5-Methyl-CTP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pseudouridine-5&#180;-triphosphate&#160;</td>
			<td>Trilink</td>
			<td>N1019</td>
			<td>Pseudo-UTP</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:295px;">3&#180;-O-Me-m7G(5&#180;)ppp(5`)G RNA cap structure analog&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1411L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RiboLock RNase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>40 U/&#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TURBO DNase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>2 U/&#181;l (from MEGAscript T7 Kit)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antarctic phosphatase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>MO289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy mini kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseZap solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfection</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Cationic lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Opti-MEM I Reduced Serum Media&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11058-021</td>
			<td style="width:435px;">Improved Minimal Essential Medium (MEM) with&#160; reduced Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel electrophoresis</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelred Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>10,000x in water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">peqGOLD Range Mix DNA-Ladder&#160;</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>25-2210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5-10 kb RNA Ladder&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15623-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x TBE buffer</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow cytometry analyses</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellFIX (1x)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340181</td>
			<td>10x concentrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Primer for insert amplification and&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; poly (T) tail PCR</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward Primer (HPLC-grade) 10 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Ella Biotech</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td>5&#180;-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3&#180;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Reverse Primer (HPLC-grade) 10 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Ella Biotech</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td>5&#180;- T120-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3&#180;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cell incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td>CO2 (5%) and O2 (20%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CASY cell counter&#160;</td>
			<td>Sch&#228;rfe System</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Sterile workbench&#160;</td>
			<td style="width:157px;">BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacterial incubator&#160;</td>
			<td>Incutec</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ScanDrop spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Analytic Jena</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermocycler&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex</td>
			<td>peqlab</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel apparatus for electrophoresis&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel documentation system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACScan System&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phase-contrast microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro synthesis of modified mrna for induction of protein expression in human cells

המשלוח אקסוגני של קידוד RNA שליח סינטטי (mRNA) לזירוז סינתזה של חלבונים בתאים רצויים יש פוטנציאל עצום בתחומים של רפואת רגנרטיבית, ביולוגיה של תא בסיסי, טיפול במחלות, ותכנות מחדש של תאים. כאן, אנו מתארים צעד אחר צעד פרוטוקול לדור של mRNA שונה עם פוטנציאל מופחת חיסוני הפעלה ויציבות מוגברת, בקרת איכות של ה- mRNA מיוצר, transfection של תאים עם mRNA ואימות של ביטוי חלבון הנגרם על ידי זרימת cytometry. עד 3 ימים לאחר transfection יחיד עם eGFP mRNA, HEK293 תאי transfected לייצר eGFP. במאמר זה וידאו, הסינתזה של eGFP mRNA מתוארת כדוגמא. עם זאת, ההליך יכול להיות מיושם לייצור של ה- mRNA הרצוי האחר. שימוש בסינטטי שונה mRNA, יכולים להיגרם תאים לבטא את החלבונים הרצויים, שבו הם בדרך כלל לא מביעים זמניים.

באמצעות פלסמיד pcDNA 3.3 המכיל את ה- CDS של eGFP, הסינתזה של eGFP mRNA שונה הוקמה (איור 1). לאחר הגברה להוסיף על ידי PCR ופולי T-עוקב, להקה ברורה באורך של כ -1,100 נ&quot;ב הוא זוהה (איור 2). הגדלת זמן IVT Augmented התשואה של mRNA (איור 3). לאחר IVT, להקת mRNA ברורה באורך של כ -1,100 נ&q...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells at JoVE.com

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

במבחנת הסינתזה של mRNA השתנה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים אנושיים

במאמר זה וידאו, אנו מתארים את הסינתזה במבחנה של mRNA שונה לזירוז של ביטוי חלבון בתאים.

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...