Name: confocal time lapse imaging as an efficient method for the cytocompatibility evaluation of dental composites
Uploaded: 2014-11-09T14:00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites at JoVE.com

Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.

Protokollet består av tre huvudsteg: det första steget innefattar framställning av kompositextraktet i odlingsmedium; Det andra gäller primära Human Gingivala fibroblaster (HGF) cellodlings, kont av celler med de sammansatta extrakt och cellfärgning; det tredje steget består av konfokal avbildning och den fluorescerande signalanalys. För tandkötts vävnader tar varefter protokollet godkänts i enlighet med fransk lagstiftning, informerat samtycke och lokal etisk kommitté. 1. Komposit extrakt Framställning Använd Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) som eluerings-medium. Säkerställa att förhållandet mellan ytan av exemplaren och volymen av extraktionsmediet är på den lägsta nivån av ISO 10993/12 krav. Proceduren nyligen beskrivna 11 och beskrivs kortfattat nedan: <ol><li> Form sfäriska prover av den ohärdade dentalkomposit med en skräddarsydd grepper. Hållaren Storleken är 2 mm i radie, vilket är i överensstämmelse med allmänt råd härdningsdjup i den orala klinisk behandling. </li><li> Förbered brunnar, var och en innehållande 1 ml odlingsmedium (DMEM), med en blandning av penicillin / streptomycin 5% och 1% av amfotericin men utan fetalt bovint serum (FBS). </li><li> Cure prov inom brunnen innehåller DMEM-medium med en LED-ljus lampa med en 1,070 mW cm -2 intensitet (λ = 465-475 nm) under 40 sekunder. Kontrollera att avståndet mellan härdningsspetsen och proverna är inom området av 0,5 mm. Använd detta härdningsläget för att simulera den temporära kontakten mellan tanden och den ohärdade dentalkomposit. I kliniska situationen, inträffar kontakt när reparativ kompositen placeras i munhålan. </li><li> Inkubera prover (kompositer prover i DMEM-medium) vid 37 ° C under fuktig atmosfär av 5% CO2 i luft. Inkubera DMEM medium (utan samlingsprover) för kontrollceller i samma förhållanden. </li></ol> 2. HGF Cell Culture, Composite Extrakt Test och celler Färgning <ol><li> Tillväxt och underhåll av cellkulturer Isolera humana gingivala fibroblaster från friska gingivala vävnad biopsier av patienter som tas vid rutin ortodontiska extraktioner. <ol><li> Odla humana gingivala fibroblaster i DMEM i närvaro av 10% FBS, 5% penicillin / streptomycin och 1% Amfotericin B. Upprätt celler vid 37 ° C i inkubator i en fuktad atmosfär av 5% CO2 i luft. </li><li> Förändrad medium var 3 dagar, och passageceller var 5 dagar. Efter att ha nått konfluens, skörd celler genom trypsinering. </li><li> Centrifugera cellerna vid 90 xg under 5 min och återsuspendera dem i odlingsmediet. Räkna cell med en spira handhållen automatiserad cellräknare. </li><li> Seed cellsuspension vid en celldensitet av 2,5 x 10 4 celler / ml i en kammare glidsystem. Tillåta inkubation av cellerna över natt vid 37 ° C i en 5% atmosfär. </li></ol></li><li> Tillsats av komposit extrakten till cellerna i kultur <ol><li> Byt media två brunnar i kammaren slide med 1 ml av de testade komposit extrakt (efter 24 h inkubering). </li><li> Behåll de två återstående brunnarna (kontrollceller) i samma förhållanden. </li><li> Inkubera kammaren sliden som innehåller de fyra brunnarna vid 37 ° C i inkubator under en fuktad atmosfär av 5% CO2 i luft. </li></ol></li><li> Fluorescerande färgning Använd Live / Dead cytotoxicitet fläcken för eukaryota celler enligt tillverkarens instruktioner. OBS: satsen ger en snabb tvåfärgad fluorescerande analys för att bestämma lönsamheten av celler i en population baserad på plasmamembranet integritet och esterasaktivitet. Fläcken skilja live från skadade celler genom att samtidigt märka med grönt fluorescerande Calcein-AM för att indikera intracellulär esterasaktiviteten och röda fluorescerande Ethidium homodimer-1 (EthD-1) för att indikera förlust av membrane integritet. <ol><li> Bered en arbetslösning av de två fläck reagens innehållande 2 pM av kalcein AM och 4 pM EthD-1 (slutlig koncentration rapporteras vara lämplig för fibroblast-färgning). Lägg fläcken till de odlade adherenta celler i närvaro eller frånvaro av de utvalda sammansatta extrakt. </li><li> Observera direkt och snabbt de färgade cellpopulationer på minst 15 minuter efter färgning och genom time-lapse avbildning. Centrifugera inte och inte fixe de färgade cellerna. </li></ol></li></ol> 3. Confocal Time Lapse Imaging och signalanalys Det system som används är utrustad med en fyra diodlaserenheterna och en multi-färgade bilder för upp till fyra fluorescerande färgämnena för varje prov. Systemet kan utföra en kartläggning bild (10x förstoring) som ger en översikt över det prov som man kan flytta för att observera ett område av intresse (600X förstoring). <ol><li> Time lapse avbildning <ol><li> Placera specimens (kammarglid innehåller de färgade prover) på det mörka rummet i konfokala integrerade inkubator (37 ° C, 5% CO 2 och fuktig atmosfär). </li><li> Välj motsvarande lasrar. Använd de två laserkällor 473 nm (15 mW) och 559 nm (18 mW) för att excitera Calcein och EthD-1. </li><li> Använd en två sekventiella läge för att få bilder via linjesekvenser utan överhörning i avbildning med de två använda fluorescerande färgämnen. </li><li> Använd en detektor med en nyutvecklad spektrum för att automatiskt ställa villkor i enlighet med fluorescens färg i skanningsenheten. </li><li> Optimera bandbredderna för den detekterade fluorescensen för varje kanal till maximum. Spela in alla förvärv sekventiellt för att undvika potentiell kors prata. </li><li> Välj de mest lämpliga avbildningsförhållanden, baserat på fluorescerande färg valet med förvärv programvara. </li><li> Skaffa en kartbild som skapas automatiskt från centrum i ett spiralmönster,med området av intresse är lätt ut för närmare granskning. </li><li> Välj observationsläget. Välj upp till fem typer av observationslägen inklusive tidsförlopp, Z-stack, och multi-område som behövs. Använd en kombination av Z-stack och time-lapse lägen i föreliggande studie och fyll snabbt bild fånga, </li><li> Ändra och byta fluorescerande färg. Alternativt överlagra den fluorescerande och ljusbilder kontrast med varandra. Följ live-bild med den valda punkten på den nedre vänstra kartbilden. </li><li> Bestäm avbildningsområdet med hjälp av utformningen och zooma funktioner. Eventuellt växla mellan skärmarna för varje typ av fluorescens färgämne. OBS: Mikroskopet används i detta protokoll har samma funktion som en hög vanlig konfokal i en kompakt design. Mikroskopet är utrustat med inverterade vatten nedsänkning mål som är optimalt lämpade för stabil tidsförlopp avbildning av levande celler med en förenklad inbyggd inkubator. </li&gt; </ol></li><li> Signalanalys och kvantifiering <ol><li> Använd bildbehandlingsprogram för att kvantifiera fluorescenssignalen. Skaffa fem kartbilder med 10X objektivet för både testade provet och cellkontroll. </li><li> Erhållen 1,024 × 1,024 pixel vanliga bilder, med en um pixelstorlek 0,231 um × 0,231. Lagra bilder som Olympus Bildformat (OIF) för signalanalys. Detta format kan lagra olika parameterinställningar och bilder tillsammans. Använd olika analysverktyg (mätning av intensitetsprofilen, intensitetsförhållandet mellan de två använda kanaler). </li><li> Förvara maximala projektionsbilder som 12 bitar / pixel TIFF-filer. </li><li> Förforma statistiska analyser med hjälp av R commander programvaran. Analysera skillnader med användning av en-vägs variansanalys (ANOVA) med en repetitionstestet. Rapportera resultat som medelvärde standardavvikelse (± SD) och statistisk signifikans vid p &lt;0,05. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests, they have nothing to disclose.

Biokompatibilitet material beteende är det mest förutsättningen parameter som skall utvärderas innan medicinsk användning. Internationella standarder omfattar medicintekniska produkter ISO 10993 33 och specifikt dentala material ISO 7405 34. Frånvaron av de toxiska effekter på de omgivande cellerna är nyckeln normen i biokompatibilitet utvärdering av sådana material. Det är därför cytotoxicitet testning har sådan betydelse i bedömningen av dentala material biokompatibilitet 35-37. ISO föreslog provningsmetoder skulle kunna baseras på metabolisk aktivitet eller membranintegritet. Valda endpoints bör följa särskilda villkor för rankning biverkningar som orsakas av ett testmaterial för att minimera tiden och kostnaden för analyserna bedömnings. Den nuvarande metoden för undersökningen (3D konfokala tid förfaller imaging) är membranintegritet baserad. Utvärderings cytotoxicitet via denna endpoint verkar vara en värdefull markör för cell biocompatibility med utprovade material och det är också ISO-godkänd endpoint. In vitro-tester är utformade för att avgöra hur ett materialprov påverkar en särskild celltyp. Den kolorimetriska MTT-analysen som ursprungligen beskrivits av Mossman (1983) som en användbar metod för mätning av cytotoxicitet in vitro och cellproliferation. MTT Testet är baserat på omvandlingen av tetrazoliumsaltet i formazankristaller av aktiva celler, som bestämmer mitokondriell aktivitet. Detta kan översättas med livskraft hastighet 38. Gupta och medarbetare rapporterade att MTT-testet är den mest använda metoden för att mäta cytotoxicitet hos komposithartser. Bärnstens dehydrogenas och alkaliskt fosfatas svar har också använts för samma ändamål 39. Emellertid kan de öde celler inte att följas upp, eftersom MTT-analysen kräver att döda cellerna vid varje mätningstidpunkt. För att mer noggrant övervaka beteendet hos de färgade cellerna i den aktuella studien, direkt observation av levande celler utfördes, tack vare tid förfaller CLSM avbildning i kombination med en kort protokoll färgning, automatiserad bildanalys och fluorescerande signal kvantifiering. Dentala kompositer kommer i nära kontakt med orala vävnader, speciellt gingivala och pulpal celler. Fibroblaster skulle bli föremål för komponenter som frigörs från dessa reparativ kompositer 40-41. Vidare har flera studier rapporterat att immortaliserade celler och primära celler kan ha olika cellulära svar som kommer i kontakt med biomaterial. Primära celler befanns vara lämpligare att bedöma biomaterial effekter 42. Detta förklarar användningen av primära humana gingivala fibroblastceller som cellmodell för cytotoxicitet bedömning av den testade dentalkomposit i den aktuella studien. Toxiciteten potentialen av de frigjorda ämnen från dentalkomposit har i stor utsträckning studerats 43-44. För att bedöma tHan cytotoxisk potential material, kunde två kontaktmodellceller utföras. I direkt kontakt modellsystem materialet direkt placeras med målcellema medan i indirekt kontakt systemet målceller är i kontakt med eluerar från biologiska medier. I kliniska tillämpningar och för återställande procedurer, är dental komposit placeras i indirekt kontakt med tandköttsvävnad. Av denna anledning har den nuvarande försöksprotokollet fokuserat på indirekt kontakt systemet med humana gingivala fibroblaster (celler i närvaro av de testade komposit extrakt). Som tidigare rapporterats av Dahl och medarbetare, var cytotoxicitet svar rankad som svår (&lt;30%), måttlig (30-60%), lätt (60-90%) eller icke-cytotoxiska (&gt; 90%) baserat på aktiviteten i förhållande till värden som erhålls för kontrollerna 45. Därför, enligt denna rangordning och mot bakgrund av de erhållna resultaten (tabell 1), komposit ELS extra låg krympning kan rankas som very något cytotoxiska och visade jämförbar beteende för att styra celler under hela intervallperioden. Genom att använda exakt samma undersökningsmetod, kan resultaten av denna studie kan jämföras med dem i en nyligen publicerad studie. Den ELS extra låg krympning komposit uppvisade bättre biokompatibilitet jämfört med de två tidigare testats kompositer används för samma kliniska program som är den direkta restaurering 11. Ytterligare studier är fortfarande nödvändigt att fastställa mer komplett jämförelse. När man beslutar vilka cytotoxicitetsanalys bli godkänt för en viss endpoint bedömning, är det viktigt att förstå fördelarna och begränsningarna i varje analys. Det huvudsakliga syftet med konfokal avbildning är att uppnå en 3-D-arkitektur av celler och organ. Tekniken är i stånd att avslöja inte bara ett prov yta, utan också dess subsurface. Protokollet beskrivs här betonar användningen av 3D CLSM time lapse konfokala avbildning, som sensitiv metod för att bedöma biokompatibilitet beteendet hos en dental komposit in vitro. Men för att undvika de begränsningar som uppstår i detta arbete, Vibrations arbetsstationer kunde användas för att möjliggöra mer stabila och längre tidsförlopp avbildning; bordsskivan kan isolera använt konfokala systemet från de skadliga effekter som vibrationer i labbet kan orsaka. Dessutom material som skall användas i munhålan bör helst vara ofarliga för tandkötts vävnader och bör inte innehålla några ämnen som kan orsaka systemisk toxicitet. I enlighet med den metod som används och de resultat som erhållits från den aktuella studien kan man dra slutsatsen att den testade komposit (ELS extra låg krympning) inte cytotoxisk under nuvarande experimentella förhållanden. Som CLSM metoden lyhört kan ge initial hastighet på levande celler, kan andra möjligheter förutses att bedöma flera endpoints. Framför allt eftersom det har nyligen rapporterat att sammansatta monomerer påverkar celler thrgrundlig reaktiva syreradikaler (ROS) 46- 48, behövs ytterligare undersökningar för att bedöma korrelationer om någon mellan cytotoxicitet signalerings nätverk och ROS produktion. Den framtida protokollet skulle kunna utformas för att samtidigt utvärdera ROS produktion (H 2 O 2 och / eller O 2 - färgning) och cytotoxicitet ratio (Live / dead färgning) med intervall CLSM avbildning.

En av de viktigaste standarderna som anges i ISO-rekommendationer för att definiera biokompatibilitet är frånvaron av väsentlig toxicitet för cellerna. Hartsbaserade dentala kompositer kan släppa komponenter från hartsmatrisen, vilket kan vara en början på grund av partiell polymerisation, och / eller senare på grund av nedbrytningsprocesser under tiden 1-4. Dessa frigjorda komponenter kommer i kontakt med orala vävnader och kan ha olika nackdelar som urtikariella och slemhinnereaktioner 5, utveckling av allergi och överkänslighetsreaktioner hos patienter 6, ändringar av gingivala fibroblaster morfologi och minskning på typ I kollagen 7, immunosuppression eller immunstimulering på mitogen driven proliferation av renade T-lymfocyter och mjältceller 8 och DNA-skada i primära humana gingivala fibroblaster, vilket understryker deras genotoxiska potential 9. Många parametrar kan påverka dentala komposit giftighet, t.ex. skuggan av composite, ljushärdande, den kemiska sammansättningen av hartset monomer, fyllmedlet och graden av omvandling 10- 13. Sedan in vitro toxisk potential material kan förutsäga in vivo-situationer och kan jämföras med kliniska situationer genom att studera några relevanta endpoints. Cytotoxiciteten av dentala kompositer och deras komponenter har i stor utsträckning utvärderats med hjälp av cellodlingssystem 14- 16. Dessa in vitro-system har utvecklats för att bedöma dental kompositer biokompatibilitet i tid av: celltillväxt och cell apoptos använder THP-1monocytes liknande celler 17, cytotoxicitet i humana gingivala fibroblaster 18, keratinocyter inflammatorisk potential i HaCaT liknande celler 2, cellfunktionalitet odontoblast- som MDPC-23 celler 19, minskning av de totala RNA-nivåer, och betydande ökning av induktion av apoptos på människors gingival keratinocyter 20 ochDNA-skador på gingivala och massa fibroblastceller 21. Olika metoder föreslås för att undersöka biokompatibilitet dentala kompositer. Kolorimetriska analyser, som omfattar specifika färgämnen och ljusmätningar adsorption, är fortfarande den mest använda på grund av sin relativa enkelhet och låga kostnader 22- 26. Mikroskopi analys av ljus kontrast förbrukar ofta mer tid och medför högre kostnader. Dessa mikroskopitekniker Dock har några viktiga fördelar. Observationen av cellstrukturen ger utökad information om erfarna toxiska effekter, vilket ger mer relevanta och känsliga uppgifter. Framför allt har införandet av konfokalmikroskopi 27 tillåtet för observation av biologiska strukturer med förbättrad axiell upplösning jämfört med traditionella breda fält imaging fluorescensmikroskop. Därför har konfokal avbildning blivit ett kraftfullt utredningsverktyg inom olika områden avmedicinska och vetenskapliga undersökningar. I motsats till elektroniska mikroskopitekniker erbjuder scanning konfokalmikroskopi förmågan att visualisera olika komponenter i celler genom inkorporering av specifika fluorescerande markörer. De flesta av dessa särskilda spårämnen är stabila i en vattenmiljö, förnuftigt mätbara, billig och giftfri 28, vilket gör att deras användning i klinisk och laboratorieforskningsstudier. Dessutom är det inte nödvändigt för time lapse konfokal avbildning preparat torkning och fixering krävs för konventionell elektronisk mikroskopi analys är således tidsberoende förvärv också möjlig på prover. Jämfört med två-dimensionell avbildning, möjliggör en förlaga subsurface visualisering och den tre-dimensionella strukturen rekonstruktion från de olika erhållna djupbilder principen konfokal avbildning; vilket resulterar i, mer precisa och mer konstruktionsdetaljer 29, 30. Denna video Studien är ett exempel på användningen av tredimensionella tidsluckor Confocal Laser Scanning Microscopy (3D-CLSM) i kombination med Live / Dead fluorescerande märkning och signal kvantifiering som en innovativ metod. Tekniken presenteras i detta papper har fördelen att den möjliggör känslig utvärdering och tidsförlopp avbildning av levande celler utan att ändra bedömd cellstruktur. Inga förberedelsesteg krävs innan konfokal analys. Tidigare har samma färgning som används för att bedöma lönsamheten av odlade poröst ben kärnor 31 men utan konfokal time-lapse efter. Likaså samma tidsförlopp konfokala förfarande användes för att bedöma erytromycin tids kill aktivitet i bakterier av aktivt slam enligt deras Gram typ 32 att använda ett särskilt bakterier Live / dead färgning. Dessa metoder har nyligen anpassats och använts för att jämföra toxiciteten hos dentala kompositer baserade på metakrylatmonomerer 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Olympus Fluoview FV10i&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O2/Co2 Incubator</td>
			<td style="width:71px;">Pnasonic</td>
			<td style="width:119px;">MCO 5M</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Live/Dead&#174; Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MP 03224</td>
			<td>Stain&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ELS extra low shrinkage&#174;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Saremco&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Dental composite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D 6046</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1426</td>
			<td>harvesting cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chamber slide system&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">14220040X</td>
			<td>Culture chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">P11-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">P11-001</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">A11-101</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">00110230TP1</td>
			<td>Cell counting&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal time lapse imaging as an efficient method for the cytocompatibility evaluation of dental composites

Det är allmänt accepterat att in vitro-cellmaterial interaktion är ett användbart kriterium för utvärderingen av dentalmaterial biokompatibilitet. Syftet med denna studie var att använda 3D CLSM time lapse konfokala imaging att bedöma biokompatibilitet dentala kompositer in vitro. Denna metod ger en noggrann och känslig indikering av viabla cellhastighet i kontakt med dentala kompositextrakt. Den ELS extra låg krympning, ett tand komposit som används för direkt restaurering, har tagits som exempel. In vitro bedömning utfördes på odlade primära humana gingivala fibroblastceller med Live / Dead färgning. Bilder erhölls med FV10i konfokala biologiska inverterade systemet och analyseras med FV10-ASW 3.1 Software. Bildanalys visade en mycket svag cytotoxicitet i närvaro av den testade komposit efter 5 timmars tid förfaller. En liten minskning av cellviabilitet visades i kontakt med den testade komposit extrakten compared med kontrollceller. Resultaten fram användningen av 3D CLSM tidsförlopp avbildning som en känslig metod för att kvalitativt och kvantitativt utvärdera biokompatibilitet beteende dentala kompositer.

Figur 1 visar en översikt över de Live / Dead färgade celler i erhållna kartläggning bilder (10X objektiv) för både styrning och celler som utsätts för de testade komposit extrakt (ELS extra låg krympning). Den tredimensionella strukturen av cellerna kunde visualiseras vid förstoringen 600X. Visualisering av celler som samlats in i reglerkammaren och av celler som samlats i kammaren i närvaro av de testade komposit extrakten presenteras i figur 2. Den maximala projektions (objektiv 60X) visar vad som händer med utvalda cellpopulationer vid början av tiden förflutit (vid 15 min) och vid slutet av den tid som förflutit perioden (vid 5 h). Femtio sju högar av bilder (xyzt mod scan, 39 bilder per stackar, voxel-djup 1,00 um) erhölls under denna period. En liten minskning av det grönt fluorescerande signalen och mycket liten variation i den röda fluorescerande erhölls i utsatta celler. Ingen signifikant variation observerades för kontrollceller. Sammansatta extrakt exponerade celler antas liknande spindel morfologi med kontrollceller; morfologi ändrades inte i dessa experimentella betingelser (trots den gröna signalen minskar och den röda signalökning i närvaro av den testade komposit). Bildanalys utfördes på fem utvalda olika bildstaplar motsvarar olika cellpopulationer från de erhållna bilderna för den provade kompositen jämfört med negativa kontrollceller för både grön och röd signal. Intensitetsprofilen av färgade celler illustreras i figur 3; det gröna och röda signal evolutionen av cellerna i kontakt med den testade kompositen var jämförbara med de för kontrollceller. Calcein och EthD-1 fluorescensemissionsintensitet mättes på kontrollceller och komposit exponerade celler. Mätningen gjordes vid en timmes intervall för upp till fem timmar. Den grön / röd fluorescens-förhållande (baserat på integrerade intensiteten hos den gröna 495-515 nm och röda 620-650 nm signaler) Beräknades under time-lapse perioden. De lönsamhets nyckeltal för styrning och exponerade celler till ELS extra låg krympnings utdrag visas i T abell 1. I närvaro av den testade komposit, var andelen levande celler visat sig minska något från 100% till 93,9% efter 1 timme av kontakt. Signifikant skillnad sågs mellan de testade komposit och den negativa kontrollen (celler utan några sammansatta utdrag) efter 5 timmar av den angivna tidsförlopp perioden. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig1highres.jpg" /> Figur 1: Översikt av kartläggning bilden visade färgade celler vid mål 10X, (A) kontrollceller och (B) celler i närvaro av sammansatta extrakt (ELS extra låg krympning) i början av intervalltiden (t = 15 min). Grönområden är levande celler och röda områden är skadade celler. I dettaexperimentförhållanden, ingen variation (både grön och röd fluorescens) observerades för kompositer exponerade celler jämfört med negativa kontrollceller. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig2highres.jpg" /> Figur 2: CLSM bilder med objektiv 60X av en cellpopulation från (A) styrkammaren och (B) sammansatta extrakt kammare i början och slutet av exponeringstidsförlopp perioden (I: 15 min och II: 5 h, respektive ). Grönområden är levande celler och röda områden är skadade celler. Panelen av bilderna visade liten förändring i intensitetssignalen (liten minskning i den gröna signalen och mycket liten ökning av den röda). Inga cell morfologi förändringar observerades i närvaro av sammansatta extrakt; exponera celler behållit sin spolformad och fibroblastisk morfologi som kontrollceller. Figur 3: Linje profil celler som kan observeras i tidsförlopp mikroskopi (A) Styr celler (B) Sammansatta extrakt exponerade celler, (I) på 15 min och (II) vid 5 h.. Ingen synlig variation i det gröna signalutvecklingen i närvaro av testade komposit oavsett tidskontakt. Dock var liten ökning av den röda signalen observeras i närvaro av kompositen efter 5 timmar av kontakt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Kontakttid (timmar) </td><td colspan="5"> Cellviabilitet (%) </td></tr><tr><td> Ett </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Kontrollceller </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 &lt;/ Td&gt; <td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> ELS extra låg krympning ® </td><td> 93,9 ± 7 </td><td> 91,3 ± 5 * </td><td> 89,5 ± 3 * </td><td> 87,6 ± 2 * </td><td> 87,7 ± 3 * </td></tr></tbody></table> Tabell 1:. Takt levande HGF celler evolution efter 1, 2, 3, 4 och 5 timmar av kontakt med komposit extrakten Cellviabilitet analyserades genom färgning med användning av Live / Dead cytotoxicitet kit. Data visar medelvärden ± SD fem bilder stackar analys. Värden är signifikant skilda från kontrollceller vid p &lt;0,05.

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites at JoVE.com

Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

Den mest studerade aspekten av biokompatibilitet dentala kompositer är deras cytotoxicitet 3D CLSM time lapse avbildning i kombination med fluorescerande signal kvantifiering möjliggör känslig utvärdering av cell öde över tiden. Med hjälp av denna metod kan vara ett effektivt verktyg för att bedöma cytocompatibility av dentala kompositer.

Confocal Time Lapse Imaging som en effektiv metod för Cytocompatibility utvärdering av Dental Composites

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Utvärdering av nanopartiklar Upptag i tumörer i realtid med hjälp Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse avbildning av primära preneoplastiska bröstepitelialceller celler från genetiskt modifierade musmodeller av bröstcancer

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

Den<em&gt; In ovo</em&gt; Chick korioallantoinmembranet (CAM) analys som en effektiv xenotransplantatmodell för Hepatocellulär cancer

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Utvärdering av effektiviteten hos de<em&gt; H. pylori</em&gt; Protein HP-NAP som ett terapeutiskt verktyg för behandling av cancer i urinblåsan i en Orthotopic musmodell

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

En förbättrad metod för Rapid Intubation av luftstrupen hos möss

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

Utökad Time-lapse Intravital avbildning av realtid flercelliga Dynamics i tumörens mikro

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

En anestesi, kirurgi och skördmetod för utvärdering av transpedikulära skruvar med användning av en<em&gt; In vivo</em&gt; Porcin Lumbar Spine Model

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

Andra harmoniska Generation signaler i kanin sklera som ett verktyg för utvärdering av terapeutiska vävnad Cross-linking (TXL) för närsynthet

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats

Subclavia ven punktering som en alternativ metod för blod provtagning hos råttor

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful ...

Cardiac Magnetic Resonance for the Evaluation of Suspected Cardiac Thrombus: Conventional and Emerging Techniques

Hjärtmagnetisk resonans för utvärdering av misstänkt Hjärttromb: konventionell och framväxande teknik

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The ...