Name: highly efficient transfection of human thp-1 macrophages by nucleofection
Uploaded: 2014-09-02T15:00:00
Duration: 7 min 54 s
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THP-1 मैक्रोफेज की 1 Predifferentiation <ol><li> सीओ 2 में 10% (v / v) भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) और 1% (v / v) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / एल glutamin (पीएसजी) के साथ पूरक RPMI 1640 मध्यम में THP-1 कोशिकाओं खेती (5% 37 डिग्री सेल्सियस) इनक्यूबेटर. </li><li> अभिकर्मक पहले, कोशिकाओं को विभाजित और पहले के रूप में ताजा RPMI मध्यम को हस्तांतरण. 24 घंटे के लिए कोशिकाओं खेती. </li><li> बीज 1.0-1.5 एक्स 10 एक 75 सेमी ² टिशू कल्चर फ्लास्क में 7 कोशिकाओं या 2.5 x 10 7 RPMI 1640 मध्यम में एक 150 सेमी ² टिशू कल्चर फ्लास्क में कोशिकाओं और 10% (v / v) एफसीएस, 1% (v जोड़ने / 48 घंटे के लिए वी) पी एस जी, 1% (v / v) सोडियम पाइरूवेट, 1% (v / v) अनावश्यक अमीनो एसिड, 10 एनजी / एमएल पीएमए, और 50 माइक्रोन β-mercaptoethanol. </li></ol> Nucleofection की 2. तैयारी <ol><li> 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में Accutase मैं और सभी मीडिया रखें. </li><li> कुप्पी से महाप्राण संस्कृति मध्यम और 6 मिलीग्राम (75 सेमी ² कुप्पी) या 12 मिलीलीटर (150 सेमी ² कुप्पी) के साथ की जगहAccutase मैं और कोशिकाओं की पूरी टुकड़ी के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं. कोशिकाओं एक दौर उपस्थिति है कि यह सुनिश्चित करने के लिए Accutase मैं उपचार के बाद सेल आकारिकी का निरीक्षण करें. कुछ कोशिकाओं को अभी भी संलग्न होना दिखाई देते हैं, तो ध्यान से एक micropipette साथ फ्लास्क कुल्ला या धीरे टुकड़ी को पूरा करने के लिए यह नल. इस सेल जीवन शक्ति पर नकारात्मक प्रभाव पड़ेगा ही, सेल स्क्रेपर्स का प्रयोग न करें. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण. </li><li> Accutase मैं उपचार के दौरान, निम्नलिखित मीडिया को तैयार: <ol><li> अभिकर्मक मध्यम तैयार: पूरक सेल संस्कृति के माध्यम 1% (v / v) पी एस जी के साथ, 1% (v / v) अनावश्यक अमीनो एसिड, 1% (v / v) सोडियम पाइरूवेट, और 5% (v / v) मानव सीरम (प्लास्मिड डीएनए के लिए) मानव सीरम (siRNA के लिए) या 20% (v / v); दो 12 अच्छी तरह प्लेटों के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली या 4 मिलीग्राम / नमूना के लिए या तो 3 मिलीग्राम / नमूना के अंतिम मात्रा तैयार करते हैं. </li><li> खेती मध्यम तैयार: पूरक संस्कृति मध्यम 1% (v / v) पी एस जी के साथ, 1% (v / v) अनावश्यक अमीनो एसिड की, 1% (v / v) सोडियम पाइरूवेट, और 5% (v / v) हूआदमी (siRNA के लिए) सीरम या 20% (प्लाज्मिड के लिए) (वी / वी) मानव सीरम, 2.5 एनजी / एमएल पीएमए, और 50 माइक्रोन β-mercaptoethanol; दो 12 अच्छी तरह प्लेटों के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली या 4 मिलीग्राम / नमूना के लिए या तो 3 मिलीग्राम / नमूना के अंतिम मात्रा तैयार करते हैं. </li></ol></li><li> कमरे के तापमान पर 300 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सेल निलंबन. </li><li> RPMI मध्यम 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गरम के 1 मिलीलीटर में महाप्राण Accutase मैं और resuspend कोशिकाओं; सेल नंबर निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं गिनती. नोट: तेजी से स्वचालित सेल गिनती प्रक्रियाओं उपयोग किया जाता है, 2.4 कदम और 2.5 हटाया जा सकता है और कोशिकाओं टुकड़ी Accutase मैं करने के लिए लंबे समय तक निवेश से परहेज है बशर्ते कि तुरंत बाद गिना जा सकता है. </li><li> प्रत्येक अभिकर्मक नमूना के लिए 2.0-2.5 एक्स 10 6 कोशिकाओं से युक्त ट्यूब में aliquots तैयार करते हैं. </li></ol> THP-1 मैक्रोफेज की 3 nucleofection <ol><li> अपकेंद्रित्र कमरे के तापमान पर 250 XG पर 10 मिनट के लिए सभी aliquots. </li><li> Nuclease मुक्त में प्लास्मिड डीएनए या siRNA पतलापानी या एक उपयुक्त बफर. संभव के रूप में छोटे रूप में प्लास्मिड डीएनए या siRNA के लिए आवश्यक मात्रा रखें. </li><li> प्रत्येक अभिकर्मक के लिए प्लास्मिड डीएनए की 1 siRNA के ग्राम या 0.5 माइक्रोग्राम के साथ या तो एक Nucleofector क्युवेट तैयार करें. </li><li> एक समय में एक अभिकर्मक प्रदर्शन करना. सेल विभाज्य से सतह पर तैरनेवाला Aspirate. </li><li> डीएनए / siRNA और Nucleofector समाधान के 100 μl की कुल मात्रा उपज Nucleofector समाधान में pelleted कोशिकाओं Resuspend. एक न्यूनतम करने के लिए शुद्ध Nucleofector समाधान के लिए जोखिम के समय रखें और 15 मिनट से अधिक नहीं है कि जोखिम समय किया जाता है. </li><li> कोमल दोहन द्वारा Nucleofector क्युवेट में resuspended कोशिकाओं और डीएनए / siRNA मिलाएं. </li><li> Nucleofector 2B डिवाइस में कार्यक्रम वाई -001 प्रदर्शन से Transfect कोशिकाओं. </li><li> डिस्पोजेबल प्लास्टिक पाश्चर pipettes का उपयोग कर एक प्रतिक्रिया शीशी में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं स्थानांतरण. </li><li> तुरंत तैयार अभिकर्मक माध्यम के 500 μl जोड़ें. </li><li> दोहराएँ 3.4 प्रत्येक अभिकर्मक नमूना के लिए 3.9 करने के लिए कदम. </li></ol><ol><li> ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए 6 अच्छी तरह से या 12 अच्छी तरह से या तो प्लेटों की तैयारी. पिपेट 2.5 6 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में अभिकर्मक मध्यम (1 अच्छी तरह / अभिकर्मक) की मिलीलीटर या एक 12 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में अभिकर्मक मध्यम से 1.75 मिलीलीटर (2 कुओं / अभिकर्मक). </li><li> एक micropipette के साथ अच्छी तरह से सेल निलंबन मिलाएं. </li><li> तैयार कुओं में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं हस्तांतरण (या तो एक अच्छी तरह से एक 12 अच्छी तरह से थाली में एक 6 अच्छी तरह से थाली या दो में). </li><li> एक humidified इनक्यूबेटर (5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस) में 4 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं. </li><li> Microscopically कोशिकाओं की reattachment की जाँच करें. नोट: कोशिकाओं के अधिकांश फिर से पक्षपाती होना चाहिए. कभी कभी, 1 घंटा से ऊष्मायन अवधि का विस्तार अपर्याप्त reattachment के मामले में पक्षपाती कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है. </li><li> ध्यान से एक micropipette साथ अभिकर्मक मध्यम aspirate और खेती मध्यम के बराबर राशि के साथ बदलें. एक समय में महाप्राण केवल एक अच्छी तरह से. </li> &lt;ली&gt; प्लाज्मिड या siRNA (24-72 घंटा) की अधिक से अधिक प्रभाव के लिए आवश्यक समय अवधि के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. ऊष्मायन अवधि 48 घंटे से अधिक है, 48 घंटे के बाद मध्यम जगह. </li><li> प्रभावोत्पादक साथ अतिरिक्त उपचार के लिए (जैसे., साइटोकिन्स, एगोनिस्ट, गरम और अवरोधकों) पीएमए बिना सीरम मुक्त मध्यम और β-mercaptoethanol का उपयोग करें. समय प्लाज्मिड या siRNA के अधिक से अधिक प्रभाव के समय के साथ प्रेरक के ऊष्मायन अवधि के अंत और मध्यम और तदनुसार प्रेरक के अलावा के परिवर्तन की योजना है. अब से 24 घंटे के लिए सीरम मुक्त शर्तों के तहत कोशिकाओं को बनाए रखने मत करो. </li></ol>

<ol>
	<li>Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+diversity+in+renal+injury+and+repair.">Macrophage diversity in renal injury and repair.</a> J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+developing+cationic+vectors+for+non-viral+systemic+gene+therapy+against+cancer.">Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer.</a> Biomaterials. (24-25), 3477-3496 (2008).</li><li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells.">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).</li><li>Mae&#223;, M. B., Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protocol+for+efficient+nonviral+transfection+of+premature+THP-1+macrophages.">Improved protocol for efficient nonviral transfection of premature THP-1 macrophages.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (5), (2011).</li><li>Ma, W., Liu, Y., Ellison, N., Shen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+C-X-C+chemokine+receptor+type+7+(CXCR7)+switches+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+and+phagocytic+activity+in+macrophages+linked+to+atherosclerosis.">Induction of C-X-C chemokine receptor type 7 (CXCR7) switches stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling and phagocytic activity in macrophages linked to atherosclerosis.</a> J Biol Chem. 288 (22), 15481-15494 (2013).</li><li>Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+localization+of+ABCG1+does+not+require+LXR+activation.">Cell surface localization of ABCG1 does not require LXR activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (11), 143-144 (2006).</li><li>Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S., Nitschke, Y., Severs, N. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activators.">Development of novel adenosine monophosphate-activated protein kinase activators.</a> J Med Chem. 53 (6), 2552-2561 (2010).</li><li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli.">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli.">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> J Immunol Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li><li>Angosto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+inflammasome+functions+in+vertebrates:+Inflammasome+and+caspase-1+trigger+fish+macrophage+cell+death+but+are+dispensable+for+the+processing+of+IL-1b.">Evolution of inflammasome functions in vertebrates: Inflammasome and caspase-1 trigger fish macrophage cell death but are dispensable for the processing of IL-1b.</a> Innate Immun. 18 (6), 815-824 (2012).</li><li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes.">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nat Rev Immunol. 13 (6), 397-411 (2013).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li></ol>

इस वीडियो लेख के लिए प्रकाशन लागत Lonza समूह लिमिटेड द्वारा प्रायोजित कर रहे हैं

मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के सेलुलर घटकों के अलावा, मैक्रोफेज सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए बहुत महत्व के हैं. उनके कार्यों विविध रहे हैं; वे रोगजनकों और परिगलित सामग्री की phagocytosis में शामिल कर रहे हैं, वे ऊतक homeostasis में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और विनियमित करने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1 आर्केस्ट्रा साइटोकिन्स की एक बड़ी संख्या का उत्पादन और छिपाना. इसलिए मैक्रोफेज अभिन्न कई शारीरिक प्रक्रियाओं और pathophysiological शर्तों में शामिल हैं. कारण उनके कार्यों की विविधता के लिए, मैक्रोफेज एक बहुत ही विषम और बहुमुखी सेल प्रकार के होते हैं. यह अलग polarizations द्वारा हासिल की है; बाहरी उत्तेजनाओं मैक्रोफेज के आधार पर अलग phenotypes 2 में विकसित कर सकते हैं. प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर मैक्रोफेज &#39;परिवर्तनशीलता और प्रभाव के लिए उन्हें एक बहुत ही दिलचस्प शोध विषय बना. इन विट्रो मॉडल में उनके जटिल चयापचय और विनियामक कार्यों, उचित बृहतभक्षककोशिका स्पष्ट करने के लिए आदेश में अनुरोध कर रहे हैंuired सही ढंग से मैक्रोफेज विविधता और परिवर्तनशीलता को प्रतिबिंबित करता है. सेलुलर जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के क्रम में प्लास्मिड डीएनए वैक्टर या छोटे दखल RNAs (siRNAs) के साथ कोशिकाओं के अभिकर्मक जीन विनियमन और जीन समारोह दोनों की जांच के लिए कोशिका जीव विज्ञान में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और शक्तिशाली उपकरण बन गया है. वर्तमान में कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए उपलब्ध विभिन्न उपकरणों का एक बड़ा चयन है. ये उपकरण कोशिकाओं 3 के वायरल वैक्टर, (जैसे जीन बंदूकों के रूप में) यांत्रिक विधियों, (न्यूक्लिक एसिड के साथ परिसरों फार्म कर सकते हैं कि पॉलिमर या लिपिड पर भरोसा है) रासायनिक दृष्टिकोण के आवेदन, और electroporation शामिल हैं. इन तरीकों के सभी के अपने फायदे और नुकसान है और एक विशेष सेल प्रकार और आवेदन के लिए इस व्यापक सरणी से सबसे उपयुक्त का चयन एक कठिन और समय लेने वाली प्रक्रिया हो सकती है. मैक्रोफेज के रूप में लगभग सभी अच्छी तरह से स्थापित transfe transfect के लिए बेहद मुश्किल हो जाता हैction दृष्टिकोण काफी मैक्रोफेज &#39;व्यवहार्यता को कम करने या उनके व्यवहार, यानी भेदभाव के साथ और विशेष ध्रुवीकरण में हस्तक्षेप. इसलिए, हम यहाँ डीएनए की कम मात्रा की आवश्यकता होती है एक अनुकूलित electroporation के दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है जो electroporation आधारित Nucleofector प्रौद्योगिकी का उपयोग करते हुए मानव THP-1 मैक्रोफेज transfect करने के लिए एक कुशल, गैर वायरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. Nucleofection ऐसे monocytes और मैक्रोफेज के रूप में संवेदनशील कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है. इस प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित संस्करणों 4,5 का एक रूपांतर है. संक्षेप में, phorbol 12 myristate 13-एसीटेट (पीएमए) पूर्व siRNA या प्लाज्मिड डीएनए के साथ अभिकर्मक के लिए समय से पहले मैक्रोफेज में 48 घंटे के लिए मानव THP-1 monocytes अंतर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अभिकर्मक के लिए predifferentiated मैक्रोफेज Accutase मैं उपचार द्वारा enzymatically अलग कर रहे हैं. अभिकर्मक कोशिकाओं की electroporation के लिए एक Nucleofector 2B डिवाइस का उपयोग किया जाता है. अभिकर्मक के बाद, अलगआवश्यक रूप entiation एक और 24 से 48 घंटे के लिए जारी रखा है. अंत में, परिपक्व ट्रांसफ़ेक्ट मैक्रोफेज कार्यात्मक अध्ययन के लिए यौगिकों के विभिन्न प्रकार के साथ incubated हैं. यह दृष्टिकोण इस तरह के मानव THP-1 monocytes और मैक्रोफेज के रूप में सेल लाइनों के अभिकर्मक के लिए अनुमति देता है और सफलतापूर्वक पिछले 6-10 में लागू किया गया है. सबसे रासायनिक अभिकर्मक दृष्टिकोण के विपरीत, समय से पहले मैक्रोफेज का उपयोग हमारे संशोधित nucleofection प्रक्रिया वायरल वैक्टर का उपयोग करें या अज्ञात दुष्प्रभाव के साथ आगे वाहक यौगिकों को जोड़ने की आवश्यकता के बिना, अछूता सेल व्यवहार्यता के साथ संयोजन में उच्च अभिकर्मक क्षमता अर्जित करता है. इसके अलावा, मैक्रोफेज इस प्रकार अभिकर्मक 11 निम्नलिखित बेरोक कार्यात्मक जांच की अनुमति उनके पूर्ण भेदभाव के लिए संभावित रूप में अच्छी तरह से ध्रुवीकरण बरकरार रहती है. इसके अलावा, nucleofection के बाद लागू सेल संस्कृति के माध्यम जोरदार कार्यात्मक अध्ययन के बाद ट्रॅन को प्रभावित करती हैsfection; विशेष रूप से, ध्रुवीकरण के लिए मैक्रोफेज &#39;क्षमता लागू संस्कृति के माध्यम के आधार पर प्रभावित किया जा सकता है. सेल संस्कृति मीडिया की यहाँ चार अलग अलग प्रकार (IMDM, एक्स विवो 20, LGM3 और माउस टी सेल Nucleofector मध्यम) इंटरल्यूकिन का उपयोग कर निष्क्रिय परिस्थितियों में परीक्षण किया गया (आईएल) 10 THP-1 मैक्रोफेज का उपयोग करना, हम IL10 को सेल जवाबदेही है कि मनाया माउस टी सेल Nucleofector मध्यम अन्य उपरोक्त संस्कृति मीडिया की तुलना में प्रयोग किया जाता है जब मजबूत. इन परिणामों के इन काफी प्रयोगात्मक परिणामों में सुधार हो सकता है के रूप में सभी सेल संस्कृति शर्तों का उचित अनुकूलन सफल अभिकर्मक und बाद कार्यात्मक अध्ययन के लिए आवश्यक है कि प्रदर्शित करता है. मैक्रोफेज विभिन्न मानव रोगों में शामिल कर रहे हैं, अधिक से अधिक शोध बृहतभक्षककोशिका व्यवहार के रूप में अच्छी तरह से मैक्रोफेज द्वारा नियंत्रित मैक्रोफेज या बदले में प्रभावित करने नियामक तंत्र elucidating पर ध्यान केंद्रित किया है. इसलिए, इस प्रोटोकॉल में प्रासंगिक हैकई अलग अलग क्षेत्रों में शोध.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Accutase I</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">A6964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Amino acids, nonessential</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">M11-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal calf serum (FCS gold)</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Human Monocyte Nucleofector Kit</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">VPA-1007</td>
			<td>Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Human serum off the clot</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">C11-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Isove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3)</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">CC-3211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Mouse T Cell Nucleofector Medium</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">VZB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nucleofector 2b</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">AAD-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100&#215;)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640)</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">siRNA / plasmid</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">THP-1 human leukemia monocytes</td>
			<td style="width:145px;">CLS</td>
			<td style="width:145px;">300356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue culture flasks (75 cm&#178;; 150 cm&#178;)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP90076/TPP90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue culture plates (6-well; 12-well)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP92406/TPP92012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tubes (1.5 ml)</td>
			<td style="width:145px;">StarLab</td>
			<td style="width:145px;">S 1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">X-Vivo 20 with Gentamycin</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">BE04-448Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of human thp-1 macrophages by nucleofection

मैक्रोफेज, सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रमुख खिलाड़ी के रूप में, ऊतक homeostasis या विभिन्न विकृतियों के साथ काम कर अनुसंधान के फोकस पर हैं. SiRNA और प्लास्मिड डीएनए के साथ अभिकर्मक उनके कार्य के अध्ययन के लिए एक कुशल उपकरण है, लेकिन मैक्रोफेज की अभिकर्मक एक छोटी सी बात नहीं है. यूकेरियोटिक कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए कई अलग अलग दृष्टिकोण उपलब्ध हैं, केवल कुछ मैक्रोफेज के विश्वसनीय और कुशल अभिकर्मक, लेकिन कम सेल जीवन शक्ति और अक्सर मनाया जाता है भेदभाव या ध्रुवीकरण के लिए कम क्षमता की तरह गंभीर रूप से बदल सेल व्यवहार अनुमति देते हैं. इसलिए एक अभिकर्मक प्रोटोकॉल इस प्रकार सामान्य कोशिका व्यवहार के संदर्भ में siRNA के प्रभाव या प्लाज्मिड की जांच की अनुमति गंभीर दुष्प्रभाव के कारण के बिना मैक्रोफेज में siRNA और प्लास्मिड डीएनए स्थानांतरित करने में सक्षम है कि आवश्यक है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल मज़बूती से और कुशलता से मानव THP-1 मैक्रोफेज और मो transfecting के लिए एक तरीका प्रदान करता हैउच्च सेल जीवन शक्ति, उच्च अभिकर्मक दक्षता, और सेल व्यवहार पर कम से कम प्रभाव के साथ nocytes. यह दृष्टिकोण nucleofection पर आधारित है और प्रोटोकॉल अभिकर्मक के बाद सेल सक्रियण के लिए अधिकतम क्षमता बनाए रखने के लिए अनुकूलित किया गया है. प्रोटोकॉल निलंबन में सेना की टुकड़ी के साथ ही कोशिकाओं के बाद पक्षपाती कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है, और मध्यम नमूना संख्या के लिए छोटे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, प्रस्तुत विधि बृहतभक्षककोशिका भेदभाव और ध्रुवीकरण के दौरान जीन विनियामक प्रभाव की जांच के लिए उपयोगी है. इसके अलावा एक विकल्प रासायनिक विधि की तुलना में इस प्रोटोकॉल के अनुसार ट्रांसफ़ेक्ट मैक्रोफेज निस्र्पक नतीजे पेश से, सेल व्यवहार पर अभिकर्मक के बाद सेल संस्कृति के माध्यम चयन का प्रभाव भी चर्चा की है. प्रस्तुत आंकड़ों विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग के लिए चयन मान्य के महत्व को इंगित करते हैं.

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Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

इस प्रोटोकॉल उच्च सेल जीवन शक्ति और भेदभाव और ध्रुवीकरण के लिए पूर्ण बृहतभक्षककोशिका क्षमता को बनाए रखते हुए उच्च अभिकर्मक दक्षता के साथ electroporation द्वारा siRNA या प्लाज्मिड डीएनए के साथ मानव THP-1 मैक्रोफेज transfect करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय विधि प्रस्तुत करता है.

Nucleofection द्वारा मानव THP-1 मैक्रोफेज की अत्यधिक कुशल अभिकर्मक

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Research

JoVE Journal

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