Name: highly efficient transfection of human thp-1 macrophages by nucleofection
Uploaded: 2014-09-02T15:00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection at JoVE.com

Vi er takknemlige for Lonza Group Ltd for å sponse denne publikasjonen ved å dekke publiseringskostnadene. Vi takker Deutsche Infarktforschungshilfe, Wilhelm-Vaillant-Stiftung, Ernest-Solvay-Stiftung, og Thüringer Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur for økonomisk støtte til SL.

1. Predifferentiation av THP-1 Makrofager <ol><li> Dyrk THP-1-celler i RPMI-1640 medium supplert med 10% (v / v) føtalt kalveserum (FCS) og 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin / L-Glutamin (PSG) i en CO2 (5% ) inkubator ved 37 ° C. </li><li> Før transfeksjon, dele celler og overføre dem til frisk RPMI medium som før. Dyrke celler for 24 hr. </li><li> Seed 1,0 til 1,5 x 10 7 celler i en 75 cm² vevskultur-kolbe eller 2,5 x 10 7 celler i en 150-cm² vevskultur-kolbe i RPMI-1640 medium og tilsett 10% (v / v) FCS, 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) natrium-pyruvat, 1% (v / v) ikke-essensielle aminosyrer, 10 ng / ml PMA og 50 uM β-merkaptoetanol i 48 timer. </li></ol> 2. Utarbeidelse av nucleofection <ol><li> Plasser Accutase I og alle medier i vannbad ved 37 ° C. </li><li> Aspirer kulturmedium fra kolbe og erstatte med 6 ml (75 cm² flask) eller 12 ml (150 cm ² kolbe) avAccutase I og inkuberes i 30 min ved 37 ° C for fullstendig avløsning av cellene. Observer cellemorfologi etter behandling Accutase I for å sikre at cellene har en rund utseende. Hvis noen celler fortsatt synes å være festet, nøye skylle kolben med en mikropipette eller banke forsiktig på det å fullføre avløsning. Ikke bruk celle skrapere, da dette vil ha en negativ effekt på celle vitalitet. Overfør cellesuspensjonen til en 15 ml rør. </li><li> Under behandlingen Accutase jeg klar følgende medier: <ol><li> Forbered transfeksjon medium: supplement cellekulturmedium med 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) av ikke-essensielle aminosyrer, 1% (v / v) natrium-pyruvat, og 5% (volum / volum) humant serum (for siRNA) eller 20% (volum / volum) humant serum (for plasmid DNA); forberede et sluttvolum på enten 3 ml / utvalget for en 6-brønn plate eller 4 ml / utvalget for to 12-brønns plater. </li><li> Forbered dyrking medium: supplement kulturmedium med 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) av ikke-essensielle aminosyrer, 1% (v / v) natrium-pyruvat, og 5% (v / v) humenneske serum (for siRNA) eller 20% (volum / volum) humant serum (for plasmid), 2,5 ng / ml PMA og 50 uM β-mercaptoethanol; forberede et sluttvolum på enten 3 ml / utvalget for en 6-brønn plate eller 4 ml / utvalget for to 12-brønns plater. </li></ol></li><li> Sentrifuger cellesuspensjonen i 5 min ved 300 x g ved romtemperatur. </li><li> Aspirer Accutase I og resuspender cellene i 1 ml RPMI medium forvarmet til 37 ° C; telle celler til å bestemme celle nummer. MERK: Når hurtige automatiske celletellingsfremgangsmåter benyttes, trinn 2.4 og 2.5 kan utelates, og celler kan telles umiddelbart etter løsgjøring forutsatt at langvarig eksponering for Accutase I unngås. </li><li> For hver transfeksjon prøve forberede alikvotene i sentrifugerør inneholder 2,0-2,5 x 10 6 celler. </li></ol> 3. nucleofection av THP-1 Makrofager <ol><li> Sentrifuger alle alikvoter i 10 min ved 250 x g ved romtemperatur. </li><li> Fortynne plasmid DNA eller siRNA i nukleasefrittvann eller en egnet buffer. Oppbevar det nødvendige volum av plasmid-DNA eller siRNA så liten som mulig. </li><li> Tilbered en Nucleofector kyvette med enten 1 pg av siRNA eller 0,5 ug av plasmid-DNA for hver transfeksjon. </li><li> Utfør en transfeksjon om gangen. Aspirer supernatanten fra celle delmengde. </li><li> Resuspender pelleterte celler i Nucleofector løsning for å gi et totalt volum på 100 pl av DNA / siRNA og Nucleofector løsning. Hold tiden for eksponering for ren Nucleofector løsningen til et minimum og sikre at eksponeringstiden ikke overstiger 15 min. </li><li> Bland resuspenderte celler og DNA / siRNA i Nucleofector kyvetten ved forsiktig tapping. </li><li> Transfektere celler ved å utføre program Y-001 i Nucleofector 2b enhet. </li><li> Overfør transfekterte cellene inn i en reaksjonshetteglasset ved hjelp av disponibel plast Pasteur pipetter. </li><li> Umiddelbart legge 500 mL av forberedt transfeksjon medium. </li><li> Gjenta trinn 3.4 til 3.9 for hver transfeksjon prøve. </li></ol><ol><li> Forbered enten 6-brønn eller 12-brønners plater for transfekterte celler. Pipetter 2,5 ml av transfeksjon medium i hver brønn av en 6-brønns plate (1 brønn / transfeksjon) eller 1,75 ml av transfeksjon medium i hver brønn av en 12-brønns plate (2 brønner / transfeksjon). </li><li> Bland cellesuspensjoner grundig med en mikropipette. </li><li> Overfør de transfekterte celler til de klargjorte brønner (enten en brønn i en 6-brønn plate eller to i en 12 brønners plate). </li><li> Inkuber platene i 4 timer i en fuktet inkubator (5% CO2, 37 ° C). </li><li> Sjekk reattachment av celler i mikroskop. MERK: Et flertall av cellene skal være tilhenger igjen. Av og til, utvide inkubasjonstiden etter 1 time øker antallet adherente celler ved utilstrekkelig reattachment. </li><li> Aspirer nøye transfeksjon medium med en mikropipette og erstatte med lik mengde dyrking medium. Aspirer bare en brønn om gangen. </li> &lt;li&gt; Inkuber cellene for nødvendig tidsrom for maksimal effekt av plasmid eller siRNA (24-72 timer). Hvis inkubasjonsperioder overstige 48 timer, må du bytte medium etter 48 hr. </li><li> For ytterligere behandling med effektorer (f.eks., Cytokiner, agonister, antagonister og inhibitorer) bruker serumfritt medium uten PMA og β-mercaptoethanol. Tid slutten av inkubasjonstiden for effektor med tidspunktet for maksimal effekt av plasmidet eller siRNA og planlegge endring av medium og tilsetning av effektor deretter. Ikke vedlikeholde cellene under serumfrie forhold i mer enn 24 timer. </li></ol>

<ol>
	<li>Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+diversity+in+renal+injury+and+repair.">Macrophage diversity in renal injury and repair.</a> J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+developing+cationic+vectors+for+non-viral+systemic+gene+therapy+against+cancer.">Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer.</a> Biomaterials. (24-25), 3477-3496 (2008).</li><li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells.">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).</li><li>Mae&#223;, M. B., Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protocol+for+efficient+nonviral+transfection+of+premature+THP-1+macrophages.">Improved protocol for efficient nonviral transfection of premature THP-1 macrophages.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (5), (2011).</li><li>Ma, W., Liu, Y., Ellison, N., Shen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+C-X-C+chemokine+receptor+type+7+(CXCR7)+switches+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+and+phagocytic+activity+in+macrophages+linked+to+atherosclerosis.">Induction of C-X-C chemokine receptor type 7 (CXCR7) switches stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling and phagocytic activity in macrophages linked to atherosclerosis.</a> J Biol Chem. 288 (22), 15481-15494 (2013).</li><li>Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+localization+of+ABCG1+does+not+require+LXR+activation.">Cell surface localization of ABCG1 does not require LXR activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (11), 143-144 (2006).</li><li>Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S., Nitschke, Y., Severs, N. J., Hofnagel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP47,+a+lipid+cargo+protein+involved+in+macrophage+triglyceride+metabolism.">TIP47, a lipid cargo protein involved in macrophage triglyceride metabolism.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 767-773 (2009).</li><li>Robenek, H., Buers, I., Hofnagel, O., Lorkowski, S., Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+proteins+visualized+by+freeze-fracture+immuno-electron+microscopy:+A+new+tool+in+cellular+and+molecular+medicine.">GFP-tagged proteins visualized by freeze-fracture immuno-electron microscopy: A new tool in cellular and molecular medicine.</a> J Cell Mol Med. 13 (7), 1381-1390 (2009).</li><li>Guh, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activators.">Development of novel adenosine monophosphate-activated protein kinase activators.</a> J Med Chem. 53 (6), 2552-2561 (2010).</li><li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli.">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli.">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> J Immunol Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li><li>Angosto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+inflammasome+functions+in+vertebrates:+Inflammasome+and+caspase-1+trigger+fish+macrophage+cell+death+but+are+dispensable+for+the+processing+of+IL-1b.">Evolution of inflammasome functions in vertebrates: Inflammasome and caspase-1 trigger fish macrophage cell death but are dispensable for the processing of IL-1b.</a> Innate Immun. 18 (6), 815-824 (2012).</li><li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes.">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nat Rev Immunol. 13 (6), 397-411 (2013).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li></ol>

Publiseringskostnadene til denne video-artikkelen er sponset av Lonza Group Ltd

Den protokoll som er beskrevet her gir en pålitelig og effektiv måte å transfektere THP-1 makrofager som vanligvis er ganske vanskelig å transfektere. Transfeksjon kan oppnås med transfeksjon effektivitet på mer enn 90% for siRNA uten betydelig reduksjon av celle vitalitet. Effektivitet for plasmider kan være mindre på grunn av deres størrelse, men transfeksjon effektivitet på omkring 70% kan vanligvis oppnås. Effektiviteten av siRNA-mediert knockdown kan nå 80 til 90% avhengig av den anvendte siRNA. En stor fordel med denne protokollen er at den ikke forstyrrer celledifferensiering. Etter transfeksjon cellene fremdeles reagere normalt til differensieringsmiddel PMA (figur 1A til 1B og Figur 4) 12. I tillegg cellular polarisering av cytokin stimuli som IL10 eller LPS / IFNγ er upåvirket 12, men dette avhenger også sterkt av valgt for dyrking etter transfeksjon et mediums vist i figur 4. Det finnes flere alternativer innenfor prosedyre som kan endres for å tilpasse protokollen til bestemte krav. Som vist i figur 4 at cellene reagerer forskjellig på samme IL10 stimulus avhengig kulturmediet velges etter transfeksjon. Dette indikerer at det medium blandingen har sterk innflytelse på cellulære oppførselen. Ettersom effekten pålagt av mediet kan variere for forskjellige eksperimentelle stimuli, er det mulig at den optimale mediet kan endre seg, og derfor er det et behov for å bekrefte egnetheten av mediet for forskjellige eksperimenter uavhengig av hverandre. Men RPMI-1640-medium, som er standardmedium som brukes for dyrking av THP-1-celler, har vist seg å være dårlig egnet for dyrking etter transfeksjon som et betydelig tap i cellen vitalitet ble observert. Videre protokollen kan også bli brukt til THP-1 monocytter uten PMA-indusert differensiering av dette,åpenbart fjerner behovet for celleløsningen under fremgangsmåten, men alle de gjenværende trinn behøver ikke å justeres. THP-1 monocytter kan skilles etterpå om nødvendig. De mest kritiske deler av protokollen er det første løsgjøring og for det andre den tid som kreves for transfeksjon. Den løsgjøring må utføres så forsiktig som mulig, for å opprettholde høy cellelevedyktighet. Derfor anbefaler vi den forholdsvis mild enzymatisk avløsning ved Accutase jeg over ganske aggressive metoder som trypsinization. Ytterligere avløsning metoder slik som behandling med lidocain eller skraping ble funnet å være ganske skadelig og bør ikke brukes. I det tilfellet at 30 min behandling Accutase jeg ikke skulle være tilstrekkelig til å løsne alle cellene riktig dette er vanligvis en indikasjon på feil lagres eller utløpt Accutase I løsning eller i for mange fryse-tine-sykluser. Vi har oppnådd gode resultater ved lagring av små alikvoter av Accutase I ved -20 °C for å redusere antallet av fryse-tine-sykluser. Men når det er for lite avløsning enten erstatte Accutase jeg med frisk Accutase eller øke inkubasjonstid opptil 1 time. I tillegg milde tapping eller skylling av kolben eller plate kan bistå avløsning. Når det gjelder den nødvendige tid for transfeksjon eksponeringstiden av cellene til ren Nucleofector løsningen har fått stor betydning for celleoverlevelse og dermed bør være så kort som mulig. Den beste måten å oppnå dette på er å utføre hver transfeksjon om gangen (trinn 02.10 til 02.15) og ikke flere transfections parallelt. Hvis knockdown effektivitet er lav, dette vanligvis ikke er forårsaket av lav transfeksjon effektivitet, men dette kan enkelt verifiseres ved hjelp av flowcytometri eller fluorescens mikroskopi og fluorescensmerkede siRNA eller en GFP koding plasmid. Mostly årsaken er en ineffektiv siRNA eller plasmid DNA. Under disse forhold bør det tas i betraktning for å øke mengden av siRNA (opptil 2-3 ug) ellerplasmid DNA (opp til 1-2 ug) eller bruke et annet siRNA eller ekspresjonsvektor hvis tilgjengelig. Alternativt, kan tilfredsstillende resultater også oppnås ved hjelp av en dam av flere forskjellige sirnas rettet mot det samme mål. Videre kan tidsforløpet eksperimenter være nødvendig å nøyaktig bestemme perioden med maksimal effekt, som vanligvis er nådd etter 24 til 72 timer etter transfeksjon. Bortsett fra transfeksjon ved elektroporering Det er videre vel etablerte teknikker for transfeksjon i pattedyrceller. Ofte anvendte systemer er kjemiske transfeksjon midler som kan danne komplekser med lasten nukleinsyre og deretter letter transporten inn i cellene. De mest brukte reagenser er enten basert på forskjellige lipid art, eller kan velges fra en rekke kationiske polymerer tre. For begge nærmer seg en mangfoldig utvalg er kommersielt tilgjengelig. Disse transfeksjon reagenser har den fordel at de er vanligvisenkel å bruke, ikke krever mye tid, og arbeide med heftende celler i tillegg, og dermed fjerne behovet for løsrivelse. Dessverre, makrofager er ganske vanskelig å transfektere med disse metodene som de ikke sprer betydelig in vitro og har forsvarsmekanismer rettet mot fremmed DNA cytosoliske 13-15. Således kjemisk transfeksjon tilnærminger ofte resultere i en alvorlig reduksjon av cellenes levedyktighet. Imidlertid, som vist i figur 2 er det kjemiske transfeksjon midler som med hell kan overføre siRNA til makrofager, men som strømningscytometrisk (figur 2A), og fluorescerende mikroskopiske (figur 2B)-analyser indikerer at de ikke klarer å oppnå den samme homogen fordeling av siRNA i cellene som innhentet av nucleofection. Faktisk indikerer flowcytometrisk data som to forskjellige populasjoner av transfekterte celler oppstår, for det første en befolkning med tilsvarende fluorescens som cellene etter Nucleofectiden blir detektert, og for det andre er det en populasjon med mer intens fluorescens. Endelig bekreftelse er fortsatt nødvendig, men vi antar at den første populasjon er i fluorescens mikroskopi identisk med de celler som viser en homogen fordeling av fluorescerende siRNA i cytosol, mens den andre populasjonen sannsynlig svarer til cellene med meget sterke agglomerater. De flowcytometrisk data vist i Figur 2A viser at nucleofection resulterer i mindre siRNA per celle enn alternativet lipofection tilnærming. Men dataene i figur 3 viser at selv den forholdsvis lille mengde av siRNA innlemmet ved nucleofection allerede er tilstrekkelig for 80 til 90% knockdown av målgenet. Derfor er den ytterligere mengde siRNA inkorporert ved den andre populasjonen etter transfeksjon kjemisk er svært sannsynlig overskudd, og er således mer sannsynlig å forårsake uønskede bivirkninger enn for ytterligere økning knockdown effektivitet. Bortsett fra atdannelsen av intracellulære agglomerater er allerede uønsket i seg selv siden de siRNA-molekyler er sannsynlig ikke funksjonell eller i det minste mindre effektiv enn gratis siRNA-molekyler og kan føre utenfor mål effekter. Videre den sanne natur av disse agglomerater er ennå ikke klart. Det er mulig at disse lyspunkter representerer endosomes indikerer at siRNA ble internalisert av cellene, men senere slipp fra endosomes mislyktes og siRNA forblir fanget og derfor ineffektiv. Alternativt flekkene kan være agglomerater som er dannet intracellulært. Funksjonelle vurderinger av kjemiske transfeksjon venter derfor ingen definitive uttalelser om knockdown effektivitet kan gjøres ennå, likevel eksistensen av to atskilte populasjoner er allerede ugunstig da dette betyr at alle resultatene beskriver gjennomsnittet av begge bestander, betyr derfor ikke tilsvare en av populasjonene. Derfor nucleofection er den overlegne tilnærming. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Likevel er det også begrensninger i transfeksjon prosedyren skissert her. Siden cellene har til å være i suspensjon i nucleofection adherente celler trenger å tas av, som presenterer en ytterligere stressfaktor til cellene. Videre hele protokollen er ganske tidkrevende. Siden transfections ikke kan utføres samtidig, men må utføres hurtig for å unngå celleskade, er det antall prøver begrenset til omtrent 8 - 10 per eksperiment. Dermed er denne protokollen ikke egnet for høy gjennomstrømning screening prosjekter. For programmer med høy gjennomstrømning forskjellige Nucleofector systemer er tilgjengelig. For det første er det 4D-Nucleofector system som tilbyr en 16 godt stripe format. For enda større gjennomstrømming, er det 96 også Shuttle systemet og 384 også HT Nucleofector system. Men som disse nyere systemene fungerer med ledende polymer elektroder i stedet for aluminium og derfor elektriske forhold, det vil si programmer og konkurranserition av Nucleofector løsning, har endret seg tilsvarende, det må bestemmes om vår protokoll kan overføres til disse systemene. Men til tross for disse begrensninger protokollen som presenteres her ikke gi en pålitelig og effektiv transfeksjon av THP-1-celler som er overlegne i forhold til alle andre ikke-virale metoder. Denne protokollen muliggjør undersøkelse av effekten av endret genekspresjon i THP-1-celler, som i alle andre henseender skiller og polariserer normalt og dermed vise seg som små bivirkninger av transfeksjon som mulig.

Blant de cellulære komponenter av immunsystemet hos mennesker, makrofager er av stor betydning for den medfødte immunrespons. Deres oppgaver er mangfoldige; de er involvert i fagocytose av patogener og nekrotisk materiale, spiller de en viktig rolle i vev homeostase og produsere og utskille et stort antall cytokiner for å regulere og organisere immunrespons 1. Derfor makrofager er integrert involvert i mange fysiologiske prosesser og patofysiologiske forhold. På grunn av mangfoldet av sine oppgaver, makrofager er en svært heterogen og mangefasettert celletype. Dette oppnås ved forskjellige polarisasjoner; avhengig av ytre stimuli makrofager kan utvikle seg til ulike fenotyper to. Makrofager &#39;variabilitet og innvirkning på immunforsvaret gjør dem til en meget interessant forskning emnet. For å belyse deres komplekse metabolske og regulatoriske funksjoner, passende makrofag in vitro-modeller er required som et riktig bilde makrofag heterogenitet og variasjon. Transfeksjon av celler med plasmid DNA vektorer eller små interfererende RNA (sirnas) for å endre celle genuttrykk har blitt en mye brukt og kraftig verktøy i cellebiologi for å undersøke både genregulering og gen-funksjon. Foreløpig er det et stort utvalg av ulike verktøy for transfeksjon av eukaryote celler. Disse verktøyene inkluderer anvendelsen av virale vektorer, mekaniske metoder (for eksempel genet guns), kjemiske metoder (som er avhengige av polymerer eller lipider som kan danne komplekser med nukleinsyrer), og elektroporering av celler 3. Alle disse metodene har sine fordeler og ulemper, og velge den som passer best fra denne bredt utvalg for en bestemt celletype og søknad kan være en vanskelig og tidkrevende prosess. Makrofager er notorisk vanskelig å transfektere som nesten alle veletablert overfÃDette skjer tilnærminger drastisk redusere makrofager &#39;levedyktighet eller forstyrre deres oppførsel, dvs. differensiering og spesielt polarisasjon. Derfor presenteres her en effektiv, ikke-viral-protokollen for å transfektere humane THP-1 makrofager ved hjelp av elektroporering baserte Nucleofector teknologi, noe som representerer en optimalisert electroporation tilnærming krever reduserte mengder av DNA. Nucleofection er godt egnet for følsomme celler som monocytter og makrofager. Denne protokollen er en tilpasning av tidligere publiserte versjoner 4,5. I korte trekk, blir forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) som brukes til å skille humane THP-1 monocytter i 48 timer i premature makrofager før transfeksjon med siRNA eller plasmid DNA. For transfeksjon de predifferentiated makrofager er frittliggende enzymatisk ved behandling Accutase jeg. Den transfeksjon utføres ved hjelp av en Nucleofector 2b anordning for elektroporering av cellene. Etter transfeksjon, avvikerentiation blir fortsatt i ytterligere 24 til 48 timer etter behov. Endelig er modne transfekterte makrofager inkubert med forskjellige typer av forbindelser for funksjonelle studier. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for transfeksjon av cellelinjer så som humane THP-1 monocytter og makrofager, og har blitt brukt i det siste 6-10. I motsetning til de fleste kjemiske transfeksjon nærmer seg, den modifiserte nucleofection prosedyren ved hjelp av makrofager premature gir høye transfeksjon effektivitet i kombinasjon med usvekket celleviabilitet, uten behov for å bruke virale vektorer eller legge til ytterligere forbindelser med bærer ukjente bivirkninger. I tillegg, makrofagene beholder sin fulle potensialet for differensiering samt polarisasjon og dermed tillater uhindret funksjonelle undersøkelser etter transfeksjon 11. Videre er cellekulturmedium anvendes etter nucleofection påvirker sterkt funksjonelle studier følgende transfection; spesielt, kan makrofagene &#39;kapasitet for polarisering påvirkes avhengig av det anvendte kulturmediet. Her fire forskjellige typer cellekultur media (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 og mus T Cell Nucleofector medium) ble testet under deaktivering forhold ved hjelp av interleukin (IL) 10. Bruke THP-1 makrofager, observerte vi at cellenes respons på IL10 er sterkest når Mus T celle Nucleofector mediet brukes i forhold til det annet vekstmedium som er nevnt ovenfor. Disse resultater viser at passende optimalisering av alle cellekulturbetingelser er viktig for vellykket transfeksjon und følgende funksjonelle studier, da disse kan betydelig forbedre eksperimentelle resultater. Som makrofager er involvert i ulike menneskelige sykdommer, er mye forskning fokusert på å belyse makrofag atferd samt reguleringsmekanismer påvirker makrofager eller i sin tur kontrollert av makrofager. Derfor er denne protokollen av relevans imange forskjellige forskningsområdene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Accutase I</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">A6964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Amino acids, nonessential</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">M11-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal calf serum (FCS gold)</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Human Monocyte Nucleofector Kit</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">VPA-1007</td>
			<td>Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Human serum off the clot</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">C11-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Isove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3)</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">CC-3211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Mouse T Cell Nucleofector Medium</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">VZB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nucleofector 2b</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">AAD-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100&#215;)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640)</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">siRNA / plasmid</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">THP-1 human leukemia monocytes</td>
			<td style="width:145px;">CLS</td>
			<td style="width:145px;">300356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue culture flasks (75 cm&#178;; 150 cm&#178;)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP90076/TPP90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue culture plates (6-well; 12-well)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP92406/TPP92012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tubes (1.5 ml)</td>
			<td style="width:145px;">StarLab</td>
			<td style="width:145px;">S 1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">X-Vivo 20 with Gentamycin</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">BE04-448Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of human thp-1 macrophages by nucleofection

Makrofager, som sentrale aktører i det medfødte immunrespons, er i fokus for forskningen arbeider med vev homeostase eller ulike patologier. Transfeksjon med plasmid DNA siRNA og er et effektivt verktøy for å studere deres funksjon, men transfeksjon av makrofager ikke er en triviell sak. Selv om mange ulike tilnærminger for transfeksjon av eukaryote celler er tilgjengelig, bare få gi pålitelig og effektiv transfeksjon av makrofager, men redusert celle vitalitet og sterkt endret celle atferd som redusert evne for differensiering eller polarisering observeres ofte. Derfor kreves en transfeksjon protokoll som er i stand til å overføre siRNA og plasmid-DNA inn i makrofager uten å forårsake alvorlige bivirkninger og dermed tillater undersøkelse av effekten av siRNA eller plasmid i sammenheng med normal celleadferd. Protokollen som presenteres her tilveiebringer en fremgangsmåte for pålitelig og effektiv måte å transfektere humane THP-1 makrofager og monocytes med høy celle vitalitet, transfeksjon med høy effektivitet og minimale effekter på celle atferd. Denne tilnærmingen er basert på nucleofection og protokollen har blitt optimalisert for å opprettholde maksimal kapasitet for celleaktivering etter transfeksjon. Protokollen er tilstrekkelig for adherente celler etter løsgjøring, så vel som celler i suspensjon, og kan benyttes for små til middels eksempelnumrene. Således er fremgangsmåten presentert nyttig for å undersøke gen regulerende effekter i løpet av makrofag differensiering og polarisering. Bortsett fra å presentere resultater som karakteriserer transfekterte makrofager i henhold til denne protokollen i forhold til en alternativ kjemisk fremgangsmåte, er virkningen av cellekulturmedium utvalg etter transfeksjon av celle oppførsel også diskutert. De presenterte data indikerer viktigheten av å validere utvalg for ulike eksperimentelle innstillinger.

Ved hjelp av denne protokollen for transfeksjon av THP-1 makrofager med siRNA vi vanligvis oppnå transfeksjonsteknologier priser på over 90% uten signifikant reduksjon av celle vitalitet. Figur 1 viser representative data som karakteriserer tilstanden i cellene 24 timer etter transfeksjon med fluorescensmerkede siRNA versus en untransfected kontroll, noe som ikke ble behandlet med nucleofection reagenser og puls eller siRNA men fikk alle endringer av kulturmedier som transfekterte prøver. I figur 1A mobil morfologi er vist i henhold til flowcytometrisk måling. Mikroskopiske bilder er vist i figur 1B figurene 1C og 1D representerer de lave priser for apoptose (kontroll: 1,5%; nucleofection: 5,4%). Nekrose og (kontroll: 2,0%; nucleofection: 3,2%) indikerer upåvirket celle vitalitet. Nekrose og apoptose er litt høyere for den transfekterte prøven som THP-1 transfekterte makrofager er mervanskelig å løsne enn untransfected celler, og dermed sannsynligheten for celleskade under avløsning øker. Endelig transfeksjon effektivitet er presentert i figur 1E. Ettersom hele transfektert populasjonen er forskjøvet mot kontroll, indikerer dette at alle cellene er transfektert noe som bekreftes av fluorescerende mikroskopiske bilder (Figur 2B). Begge flowcytometrisk data samt fluorescens mikroskopiske bilder tyder på at alle cellene er konsekvent tilført med homogen fordeling av siRNA blant celler så vel som innenfor celler. Dette er i motsetning til mange kjemiske transfeksjonsteknologier reagenser, for sammenligning figurene 2A og 2B viser de respektive flowcytometrisk data og fluorescens mikroskopiske bilder for en kjemisk transfeksjon middel ved hjelp av en lipid basert tilnærming. Disse tallene viser at to distinkte populasjoner av transfekterte celler kan detekteres. Den første populasjon er lik de transfekterte celler Follofløyen nucleofection. De kjennetegnes ved lav samlet fluorescens og homogen fordeling av siRNA inne i cellene. Den andre populasjonen er preget av en mer intens fluorescens som stammer fra svært lyse intracellulære agglomerater av siRNA. Den cellulære morfologi forblir upåvirket både for transfeksjon tilnærminger som vist ved differensiell interferenskontrast i figur 2C. Transfections bruker plasmid DNA avkastning effektivt lignende resultater, for eksempler henvises det til Robenek et al. (2009) 9 eller Xie et al. (2006) 7. Valget av cellekulturmediet etter transfeksjon er av stor betydning; derfor forskjellige cellekulturmedier ble testet i sammenligning. De utvalgte medier er egnet for dyrking av THP-1 celler og ble valgt i henhold til anbefalinger fra Lonza som gjelder media for post-nucleofection dyrking. Figur 3 representerer siRNA mediated knockdown effektivitet ved hjelp av en siRNA rettet mot IL10RB (interleukin 10 reseptor β-kjeden) mRNA. For alle testede medier ekspresjonen av IL10RB ble betydelig redusert til omkring 10 til 20% av kontrollnivå (figur 3). Men de transfekterte celler forskjellig, avhengig av kulturmediet på deres potensial for polarisering. THP-1 makrofager transfektert med enten uspesifikk kontroll siRNA eller IL10RB-spesifikke siRNA ble dyrket på forskjellige medier etter transfeksjon og behandlet med IL10. Deretter uttrykk nivåer av IL10-indusert gen SOCS3 (suppressor av cytokin signale 3) på mRNA nivå ble målt med RT-qPCR. Forskjeller mellom kulturmedia forekomme med hensyn til graden av induksjon av SOCS3 mRNA ekspresjon (figur 4), induksjoner for hver av de testede medier Mus T celle Nucleofector medium, LGM3, X-VIVO 20 og IMDM var 19,5 [17,7 til 21,5 ], 11.5 [8,5 til 15,7], 8,0 [4,6 til 14,2] og 7.2 [5.6 til 9.5] fold, henholdsvis. Denrefore anvendelse av Mouse T Cell Nucleofector medium er avgjørende. I tillegg forskjeller i effekten av knockdown av IL10RB på SOCS3 uttrykk etter IL10 behandling var observerbar, ble uttrykket nivåer av SOCS3 mRNA redusert til 9.5 [8.8 til 10.3] fold i Mouse T Cell Nucleofector medium, 2.1 [1.1 til 4.1] fold i LGM3, 4.8 [3.2 til 7.2] fold i X-VIVO 20 og 3.3 [2.7 til 3.9] fold i IMDM. Disse verdier svarer til reduksjoner på SOCS3 ekspresjon i forskjellige medier til 49%, 18%, 60% og 45%, respektivt. Reduksjon av IL-10-indusert SOCS3 uttrykk etter transfeksjon av IL10RB siRNA bekrefter vellykket nedregulering av IL10RB ved transfeksjon. <img alt="Figur 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" width="300" /> Figur 1. Karakterisering av transfekterte THP-1 makrofager. Den karakteristiske status av cellene er upåvirket som avslørt av lyset mikroskopiske og flowcytometrisk analyse av untransfected control celler versus THP-1 makrofager transfektert i henhold til den fremlagte protokoll. THP-1-makrofager ble differensiert med 10 ng / ml PMA i 48 timer og transfektert med fluorescensmerkede (Alexa 488) uspesifikk kontroll siRNA. 24 timer etter transfeksjon enten bilder av levende celler ble tatt (B), eller cellene ble løsnet ved Accutase I behandlingen og analysert ved flowcytometri (A). Apoptose og nekrose farging ble utført ved hjelp av Annexin V-phycoerythrin (PE) (C) og 7-Aminoactinomycin (7-AAD) (D). Transfeksjon effektiviteten (E) ble bestemt ved strømningscytometri ved bruk av fluorescens-merket som er festet til siRNA. Fluorescens signal av de transfekterte celler (svart) er vist mot styresignal (grå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-Bredde = &quot;4in&quot; src = &quot;/ filer / Ftp_upload / 51960 / 51960fig2highres.jpg&quot; width = &quot;400&quot; /&gt; Figur 2. Sammenligning av intracellulær fordeling av siRNA etter nucleofection versus lipofection. THP-1-cellene ble differensiert i 48 timer i henhold til denne protokoll og deretter transfektert enten med nucleofection eller ved lipofection. De presenterte lipofection resultater ble oppnådd ved bruk av Xtremegene siRNA settet i henhold til produsentens anbefalinger med en charge-forhold av reagensene til siRNA på 4: 1.. 24 timer etter transfeksjon ble cellene enten frittliggende med Accutase jeg for flowcytometrisk analyse eller vurdert mikroskopisk med levende celler. (A) Transfeksjon effektivitet og fordeling av siRNA per celle innenfor populasjonen ble bestemt ved strømningscytometri ved bruk av fluorescens-merket som er festet til siRNA, blir transfektert kontroller uten siRNA vist i grått, blir prøvene transfektert med siRNA vist i sort. (B) Fluorescens mikrosbilder som viser intracellulær fordeling av fluorescensmerkede siRNA (Alexa Fluor 488); målestokken representerer 40 mikrometer. (C) Differensial kontrast interferensbilde som tilsvarer det bilde fluorescens; målestokken representerer 40 mikrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig2highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3. siRNA-mediert knockdown av IL10RB i transfekterte THP-1 makrofager. THP-1 makrofager ble transfektert i henhold til den protokoll som er beskrevet. Etter transfeksjon ble cellene dyrket i fire forskjellige kulturmedier, nemlig Mus T celle Nucleofector medium (A), IMDM (B), LGM3 (C), og X-VIVO 20 (D), supplert som beskrevet i protokoll delen. Calen ble enten tilført med uspesifikke kontroll siRNA (Ctrl) eller IL10RB spesifikke siRNA (IL10RB). Som flere kontroller følgende prøvene ble inkludert: Impulskontroll, dvs.. celler som gjennomgikk transfeksjon i fravær av siRNA (puls), og en mellomstyring, dvs.. celler som mottok bare endringene av kultur media, men holdt seg ellers ubehandlet. 24 timer etter transfeksjon ble cellene inkubert i serumfritt medium med eller uten 50 ng / ml IL10 for ytterligere 24 timer. IL10RB ekspresjon ble målt ved RT-qPCR; Diagrammene viser gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter, feil søylene representerer standardfeil av gjennomsnittet; * P &lt;0,05; ** P &lt;0,01; *** P &lt;0,001 g Ctrl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" width= &quot;500&quot; /&gt; Figur 4. IL10-avhengig regulering av SOCS3 etter knockdown av IL10RB i transfekterte THP-1 makrofager. THP-1 makrofager ble transfektert i henhold til den beskrevne protokoll. Etter transfeksjon ble cellene dyrket i fire forskjellige kulturmedia Mus T celle Nucleofector medium (A), IMDM (B), LGM3 (C) og X-VIVO 20 (D) supplert som beskrevet i protokoll delen. Celler ble enten tilført med uspesifikke kontroll siRNA (Ctrl) eller IL10RB spesifikke siRNA (IL10RB). Som flere kontroller følgende prøvene ble inkludert: Impulskontroll, dvs. celler som gjennomgikk transfeksjon i fravær av siNRA (Puls), og en medium kontroll, det vil si. celler som mottok bare endringene av kultur media, men holdt seg ellers ubehandlet. 24 timer etter transfeksjon ble cellene inkubert i serumfritt medium med eller uten 50 ng / ml IL10 for ytterligere 24 timer. SOCS3 EXPREssion ble målt ved RT-qPCR; Diagrammene viser gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter, feil søylene representerer standardfeil av gjennomsnittet; *, # P &lt;0,05; **, ## P &lt;0,01; ***, ### P &lt;0,001 g Ctrl og g Ctrl + IL-10, henholdsvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection at JoVE.com

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Denne protokollen gir en effektiv og pålitelig metode for å transfektere humane THP-1 makrofager med siRNA eller plasmid DNA med elektroporering med høy transfeksjon effektivitet og samtidig opprettholde høy celle vitalitet og full makrofag kapasiteten for differensiering og polarisering.

Svært effektiv Transfeksjon menneskerettighets THP-1 Makrofager av nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

En enkel og effektiv metode for å oppdage kjernefysiske faktor Activation i Human Nøytrofile ved flowcytometri

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolering av humane monocytter ved å dobbelt gradientsentrifugering og deres differensiering til Makrofager i teflonbelagt cellekultur Vesker

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteomikk Profilering av Makrofager av 2D elektroforese

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypisk Karakterisering av makrofager fra Rat Nyre ved flowcytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Liten RNA Transfeksjon i Primær Menneskelig Th17 celler av Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Tidsinnstilt 3D bildebehandling av fagocytose av musen makrofager

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Eksperimentell analyse av apoptotisk Thymocyte Oppslukningsprosess av makrofager

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...