Name: analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix
Uploaded: 2014-10-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix at JoVE.com

This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany

1. Fremstilling af Migration Chambers <ol><li> Forbered en paraffin / vaseline (1: 1) mix og varme, indtil blandingen er smeltet. Ved hjælp af en pensel og trække 2-3 lag af paraffin / vaseline (1: 1) blandes i midten af objektglasset i henhold til figurerne 1B-1D. BEMÆRK: Vi bruger almindelige objektglas (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (B / D / H)) </li><li> Påfør den smeltede paraffin / vaseline mix hurtigt på objektglasset for at undgå størkning under tegning. Sørg for paraffin / vaseline lag...

Evnen til at migrere er kendetegnende for tumorceller 4. Uden evnen til at løsne sig fra den primære tumor og til at vandre gennem de omgivende bindevæv tumorceller vil ikke være i stand til at pode sekundære læsioner, som er den vigtigste dødsårsag for næsten alle cancerpatienter. På grund af dette forhold mange undersøgelser fokuserer på kræft celle migration. Formålet med disse undersøgelser er identifikationen af ​​nye målmolekyler og målrette veje, der effektivt blokerer tumorcellemi...

Ligesom cellefusion (for en oversigt se 1,2) celle migration er en anden biologisk fænomen, der er involveret i et utal af fysiologiske processer, herunder fosterudvikling, sårheling og immunreaktioner (til gennemgang se 3). Evnen til at migrere er også en forudsætning for tumorceller metastaserer (for en gennemgang se 3,4). Cellemigrering er et komplekst, endnu ikke fuldt forstået proces, der er styret af samspillet af flere signaltransduktionsveje initieres af forskellige ligand (fx cytokiner, kemokiner, vækstfaktorer, hormoner, extracellulære matrixkomponenter) receptor (f.eks receptortyrosinkinaser, kemokinreceptorer, integriner) interaktioner 5 i sidste ende forårsager reorganisering af actincytoskelettet samtidig med de- og samling af fokale vedhæftning komplekser og integrin-medieret signalering 6. in vitro og in vivo celle migration assays er blevet udviklet i de seneste årtier, herunder Boydenkammer / transwell assay 7, scratch assay / sårheling assay 8-10, tre-dimensionelle ( 3D) collagenmatrix migration assay 11 samt intravital billedbehandling / mikroskopi (for en gennemgang se 12). Hver af disse celle migration assays har fordele og ulemper, f.eks vedrørende omkostninger og behov for udstyr, håndtering eller pålideligheden af opnåede data. Både Boydenkammer / transwell analysen og scratch-analysen / sårheling assay er nemme, billige og veludviklede assays til at måle celle migration in vitro 7-10. I Boydenkammer / transwell assay celler podes på toppen af en indsats, der indeholder porer (ca. 8 um i diameter) - den såkaldte øvre kammer 7. Valgfrit, kan indsatsen være coatet med ekstracellulære mATRIX komponenter, fx fibronectin, kollagen, etc., for at efterligne en mere fysiologisk miljø. Ligeledes kunne endotelceller dyrkes på toppen af indsatsen, og dermed efterligne en endotelcelle barriere 13. De celler, der har passeret gennem porerne i løbet af et bestemt tidsinterval i det nedre rum huser medier og kosttilskud, såsom vækstfaktorer og chemokiner, der bruges som en udlæsning at kvantificere celle migration (eller ekstravasation). I bunden assayet / sårhelings- assay celler podes i plader og dyrkes til konfluens 10. I afhængighed af de eksperimentelle indstilling plader kan præ-coatet med ekstracellulære matrixkomponenter, såsom fibronectin. Efter oprettelse af en ridse / sår ved skrabning cellemonolaget enkelte celler fra hver side af bunden / sår kan migrere ind i hullet, og derved fylde / healing det 10. Afstanden mellem de to sider af scratch / sår bestemmesi afhængighed af tid og anvendes som en udlæsning for vandrende aktivitet af cellerne 10. For at skelne mellem celleproliferation (der også kunne resultere i opfyldning / heling af bunden / sår) og cellemigration anbefales det at kombinere assayet med time-lapse video mikroskopi og enkelt celle sporing 10. Men både Boydenkammer / transwell assay og ridser assay / sårheling assay er en ufuldstændig om en fysiologisk-lignende cellulære miljø. I Boydenkammer / transwell assay celler har til at migrere gennem en plast pore, mens der i bunden assayet / sårheling assay celler podet på en todimensional præ-coatede plastplade. Ligeledes er det velkendt, at vandringsadfærd varierer markant mellem en to-dimensionel og 3D-miljø 3. For eksempel tredimensionale matrix adhærencer fibroblaster afviger fra fokale og fibrillære adhæsioner karakteriseret på todimensionale substrater i deres indhold af α5β1 og αvβ3 integriner paxillin andre cytoskeletale komponenter, og tyrosinphosphorylering af fokal adhæsionkinase 14. Ligeledes celler indlejret i et 3D-miljø vises også en ændret vandringsadfærd 15. Således at analysere cellemigrering mere præcist en migration assay anbefales gør det muligt at måle migreringen af ​​enkelte celler i en 3D fysiologisk eller fysiologisk-lignende miljø. Intravital billedbehandling / mikroskopi er guld-standard for måling celle migration inden en 3D-fysiologisk kontekst. Dette betyder ikke kun hører til ekstracellulære matrix-celle-interaktioner, men også til vekselvirkninger mellem forskellige celletyper, såsom tumorceller og endotelceller under ekstravasation 16 eller lymfocyttrafik i lymfeknude 17, som til dato er muligt på grund forbedrede fluorescens mikroskopi teknikker, såsom 2-fotonkonfokal laser scanning mikroskopi, anvendelse af vitale fluorescerende farvestoffer og transgene musestammer, der udtrykker fluorescerende proteiner derivater 12,16,17. Derudover kunne intravital billedbehandling / mikroskopi kombineres med manuel og automatiseret celle sporing 18. Men på grund af nødvendigheden af ​​en 2-foton konfokal laser scanning mikroskopi samt dyr (og egnede transgene dyremodeller) intravital billedbehandling / mikroskopi er en temmelig omkostningstung teknik. For at overvinde begrænsningerne i Boyden kammer / transwell assay og bunden assayet / sårheling analyse og analysere migrationen af forskellige celletyper i et 3D-miljø 3D collagenmatrix migration assay blev udviklet 11,19. Derved er migrerende celler indlejret i en 3D-kollagen fibernet, som mere minder om en in vivo-situationen. Forening, som følge af time-lapse video mikroskopi virkelige celle migration målt tillader determination af flere migration parametre samt deres ændringer i respons på pro-migrerende faktorer eller inhibitorer. Forskellige celletyper kan analyseres ved hjælp af denne teknik, herunder lymfocytter og leukocytter 11,20, hæmatopoietiske stamceller / progenitorceller 21-24, og tumorceller 5,25-29. Ud over enkelte celler også celleklyngerne eller spheroids kunne være indlejret i kollagenmatrixen samtidig med analyse af emigration af enkelte celler fra cellen klynge / klumpformet i kollagengitter 30,31. Denne protokol indeholder en oversigt over en enkel, men kraftfuld teknik til at analysere vandringsadfærd forskellige celletyper i et 3D-miljø - en in vitro metode, der giver i resultater, der er tæt på in vivo situationen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Leica DM IL inverted microscope</td>
			<td style="width:192px;">Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Microscope stage heater</td>
			<td style="width:192px;">Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">JVC C1431 video camera</td>
			<td style="width:192px;">JVC, Bad Vilbel, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Axis 241Q video server</td>
			<td style="width:192px;">Axis communication GmbH, Ismaning, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Mac G5 Computer</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">iMac</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">FileMaker Pro</td>
			<td style="width:192px;">FileMaker GmbH, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Multi-camera video surveillance software(Security Spy)</td>
			<td style="width:192px;">Bensoftware, London, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Runtime Revolution Media 2.9.0</td>
			<td style="width:192px;">RunRev Ltd., Edinburgh, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Paraffin</td>
			<td style="width:192px;">Applichem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">A4264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Petrolatum jelly</td>
			<td style="width:192px;">local drug store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Purecol (liquid collagen)</td>
			<td style="width:192px;">Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">10x MEM</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">M0275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">7.5% Sodium Bicarbonate solution</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">EGF</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">U73122</td>
			<td style="width:192px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td align="right" style="width:119px;">662035</td>
			<td>dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix

Evnen til at migrere er kendetegnende for forskellige celletyper og spiller en afgørende rolle i flere fysiologiske processer, herunder embryonisk udvikling, sårheling og immunresponser. Men celle migration er også en vigtig mekanisme i kræft give disse kræftceller til at løsne sig fra den primære tumor for at starte metastatisk spredning. Inden for de seneste år er der udviklet forskellige celle migration assays til at analysere vandringsadfærd forskellige celletyper. Fordi bevægelsesadfærd af celler adskiller sig markant mellem en todimensional (2D) og tre-dimensionelle (3D) miljø kan det antages, at analysen af ​​migrationen af ​​celler, der er indlejret i et 3D-miljø ville give mere markant cellemigration data. Fordelen ved den beskrevne 3D collagenmatrix migration assay er, at cellerne er indlejret inden for en fysiologisk 3D netværk af collagenfibre, der repræsenterer den største komponent af den ekstracellulære matrix. På grund aftime-lapse video mikroskopi virkelige celle migration målt tillader bestemmelse af flere migration parametre samt deres ændringer som reaktion på pro-migrerende faktorer eller inhibitorer. Forskellige celletyper kan analyseres ved hjælp af denne teknik, herunder lymfocytter / leukocytter, stamceller, og tumorceller. Ligeledes kunne også celle klynger eller sphæroider være indlejret i kollagenmatrixen samtidig med analyse af emigration af enkelte celler fra cellen klynge / klumpformet i kollagengitter. Vi konkluderer, at 3D-collagenmatrix migration assay er en alsidig metode til at analysere migration af celler i en fysiologisk-lignende 3D-miljø.

Den anvendte 3D-kollagenmatrix migration assay kombineret med time-lapse video mikroskopi og computer-assisteret cellesporing giver mulighed for bestemmelse af forskellige celle migration parametre, herunder både befolkning-baserede parameter (fx betyde motorisk aktivitet) og enkeltparametre cellebaserede (fx tidspunkt for aktiv bevægelse, hastighed, distance migreret). Et eksempel på de opnåede cellesporing datasæt, databehandling og datapræsentation er givet i figur 2. En celle...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix at JoVE.com

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse af Cell Migration inden for en tre-dimensionel kollagenmatrix

Cell migration er et biologisk fænomen, der er involveret i en overflod af fysiologiske, såsom sårheling og immunresponser, og patofysiologiske processer, som kræft. 3D-collagenmatrix migration assay er et alsidigt værktøj til at analysere den migrerende egenskaber af forskellige celletyper inden i en 3D fysiologisk-lignende miljø.

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar-og tredimensionelle Udskrivning af ledende blæk

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Live-cell imaging at migrere celler, der udtrykker fluorescens-mærkede Proteiner i en tre-dimensionel Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Tredimensional Cell Culture Model for måling af virkningerne af interstitielvæske Flow på tumorcelleinvasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Koncentrisk Gel System til Undersøgelse den biofysiske rolle Matrix mikromiljø på 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar Gradient Diffusion System til Undersøg Chemotaxis i en 3D kollaqenmatrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Tre-dimensionel Biomimetic Teknologi: Novel Biorubber Opretter Defineret mikro- og makro-skala Architectures i Collagen Hydrogeler

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Udarbejdelse og analyse af<em&gt; In vitro</em&gt; Tre Dimensional brystcarcinoma surrogater

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensionale epitelvæv indlejret i ekstracellulær matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...