Name: analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix
Uploaded: 2014-10-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix at JoVE.com

This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany

1 Voorbereiding van Migratie Chambers <ol><li> Bereid een paraffine / petroleum jelly (1: 1) mengsel en verhit tot het mengsel is gesmolten. Met een penseel en teken 2-3 lagen van de paraffine / petroleum jelly (1: 1) meng het midden van het glaasje volgens de figuren 1B-1D. LET OP: Wij maken gebruik van gemeenschappelijke glas dia&#39;s (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (B / D / H)) </li><li> Breng de gesmolten paraffine / vaseline mix snel op het glaasje om stolling te voorkomen tijdens het tekenen. Zorg...

Het vermogen om te migreren is een kenmerk van tumorcellen 4. Zonder de mogelijkheid om los te maken van de primaire tumor en migreren door het omringende bindweefsel tumorcellen kunnen geen secundaire laesies, die de belangrijkste doodsoorzaak van bijna alle kankerpatiënten zaad. Vanwege deze relatie veel studies zijn gericht op kankercellen migratie. Het doel van deze studie is de identificatie van nieuwe doelmoleculen en doel wegen die efficiënt blokkeren migratie van tumorcellen, waardoor afbreuk of afr...

Like celfusie (voor een overzicht zie 1,2) celmigratie is een biologisch verschijnsel dat betrokken is bij een grote verscheidenheid aan fysiologische processen zoals embryonale ontwikkeling, wondgenezing en immuunresponsen (voor review zie 3). Echter, het vermogen om te migreren is een voorwaarde voor tumorcellen uitzaaien (voor review zie 3,4). Cel migratie een complex, nog volledig begrepen proces dat wordt geleid door de wisselwerking van verschillende signaaltransductieroutes geïnitieerd door verschillende ligand (bijvoorbeeld cytokines, chemokines, groeifactoren, hormonen, extracellulaire matrixcomponenten) receptor (bijvoorbeeld receptor tyrosine kinases, chemokine-receptoren, integrines) interacties 5 uiteindelijk veroorzakend de reorganisatie van het actine cytoskelet gelijktijdig met de- en hermontage van focale adhesie complexen en integrine-gemedieerde signalering 6. in vitro en in vivo celmigratie testen analyseren ontwikkeld in de afgelopen jaren, met inbegrip van de Boyden kamer / transwell assay 7, scratch test / wondgenezende assay 8-10, drie-dimensionale ( 3D) collageenmatrix migratie assay 11 evenals intravitale beeldvorming / microscopie (voor een overzicht zie 12). Elk van deze cel migratie assays heeft voor-en nadelen, bijvoorbeeld met betrekking tot de kosten en de behoefte van de apparatuur, het hanteren of de betrouwbaarheid van de verkregen gegevens. Zowel de Boyden kamer / transwell test en de scratch test / wondgenezende assay gemakkelijk, goedkoop en goed ontwikkelde assays celmigratie gemeten in vitro 7-10. In de Boyden kamer / transwell assay cellen worden bovenop een insert met poriën (ongeveer 8 micrometer in diameter) - de zogenaamde bovenste compartiment 7. Optioneel, kan het inzetstuk worden bekleed met extracellulaire matrix componenten, bijvoorbeeld fibronectine, collageen, etc., om een fysiologische omgeving nabootsen. Evenzo kan endotheelcellen worden gekweekt boven het inzetstuk, waardoor een endotheliale barrière 13 nabootsen. Die cellen die gedurende een bepaalde tijdsinterval in het onderste compartiment herbergen media en supplementen, zoals groeifactoren en chemokinen doorgegeven via de poriën, worden gebruikt als een uitlezing celmigratie (of extravasatie) kwantificeren. In de scratch test / wondgenezing assay cellen worden gezaaid in platen en zijn uitgegroeid tot samenvloeiing 10. In afhankelijkheid van de experimentele setting platen kunnen vooraf worden bekleed met extracellulaire matrixcomponenten, zoals fibronectine. Nadat een kras / ontbonden door schrapen celmonolaag enkele cellen van elke kant van de kras / wond kan migreren in de spleet, waardoor het vullen / genezing te 10. De afstand tussen de twee kanten van de kras / wonden wordt bepaaldafhankelijk van de tijd en wordt gebruikt als een uitlezing voor het trekkende activiteit van de cellen 10. Echter, onderscheid maken tussen celproliferatie (die ook kan leiden tot het vullen / genezing van de kras / wond) en celmigratie wordt aanbevolen de assay te combineren met time-lapse microscopie en video cel volgen 10. Zowel de Boyden kamer / transwell test en scratch test / wondgenezende assay, zijn eerder onvolmaakte over een fysiologische-achtige cellulaire omgeving. In de Boyden kamer / transwell assay cellen migreren door een plastic porie, terwijl in de scratch test / wondgenezende assay cellen worden op een twee-dimensionale pre-gecoate kunststoffen plaat. Zo wordt ook goed ingezien dat het migratiegedrag aanzienlijk verschilt tussen een tweedimensionale en 3D-omgeving 3. Bijvoorbeeld, drie-dimensionale matrix adhesies fibroblasten verschillen van focale adhesies fibrillair kenmerkt tweedimensionale substraten in de inhoud van α5β1 en avß3 integrines, paxillin, andere cytoskelet componenten, en tyrosine fosforylering van focal adhesion kinase 14. Evenzo cellen ingebed in een 3D-omgeving getoond ook een veranderde migratiegedrag 15. Aldus celmigratie analyse nauwkeuriger een migratietestsysteem wordt aanbevolen zodat de migratie van afzonderlijke cellen in een 3D fysiologisch of fysiologisch-achtige omgeving meten. Intravitaal imaging / microscopie is de gouden standaard voor het meten van celmigratie in een 3D fysiologische context. Dit geldt niet alleen tot extracellulaire matrix-cel interacties, maar ook om de interacties tussen verschillende celtypen zoals tumorcellen en endotheelcellen tijdens extravasatie 16 of lymfocyttransport binnen de lymfeklier 17, die tot op heden mogelijk, als gevolg verbeterde fluorescentie microscopie, zoals 2-photonconfocale laser scanning microscopie, het gebruik van vitale fluorescente kleurstoffen en transgene muizenstammen expressie fluorescerende eiwitten derivaten 12,16,17. Daarnaast kan intravitale beeldvorming / microscopie worden gecombineerd met handmatige en geautomatiseerde cel bijhouden 18. Vanwege de noodzaak van een 2-foton confocale laser scanning microscopie en dieren (en geschikte transgene diermodellen) intravitale beeldvorming / microscopie is een nogal dure techniek. Om de beperkingen van de Boyden kamer / transwell test en de scratch test / wondgenezing assay overwinnen en de migratie van verschillende celtypen te analyseren in een 3D-omgeving 3D collageenmatrix migratie assay ontwikkeld 11,19. Daarbij migreren cellen ingebed in een 3D collageenvezelnetwerk, die meer lijkt op de in vivo situatie. Gezamenlijk, als gevolg van time-lapse video microscopie echte cel migratie wordt gemeten zodat de VASTSTELLInatie van verschillende migratieparameters en hun veranderingen in reactie op pro-trekkende factoren of remmers. Verschillende celtypes kunnen worden geanalyseerd met deze techniek, zoals lymfocyten en leukocyten 11,20, hematopoëtische stam / progenitorcellen 21-24 en tumorcellen 5,25-29. Naast enkele cellen ook clusters cel of sferoïden kunnen worden ingebed in de collageen matrix samenvalt met de analyse van de emigratie van afzonderlijke cellen van de cel cluster / sferoïde in het collageen rooster 30,31. Dit protocol geeft een overzicht van een eenvoudige maar krachtige techniek het migrerende gedrag van verschillende celtypes in een 3D-omgeving te analyseren - een in vitro methode die in de resultaten die dicht bij de in vivo situatie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Leica DM IL inverted microscope</td>
			<td style="width:192px;">Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Microscope stage heater</td>
			<td style="width:192px;">Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">JVC C1431 video camera</td>
			<td style="width:192px;">JVC, Bad Vilbel, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Axis 241Q video server</td>
			<td style="width:192px;">Axis communication GmbH, Ismaning, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Mac G5 Computer</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">iMac</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">FileMaker Pro</td>
			<td style="width:192px;">FileMaker GmbH, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Multi-camera video surveillance software(Security Spy)</td>
			<td style="width:192px;">Bensoftware, London, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Runtime Revolution Media 2.9.0</td>
			<td style="width:192px;">RunRev Ltd., Edinburgh, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Paraffin</td>
			<td style="width:192px;">Applichem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">A4264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Petrolatum jelly</td>
			<td style="width:192px;">local drug store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Purecol (liquid collagen)</td>
			<td style="width:192px;">Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">10x MEM</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">M0275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">7.5% Sodium Bicarbonate solution</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">EGF</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">U73122</td>
			<td style="width:192px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td align="right" style="width:119px;">662035</td>
			<td>dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix

Het vermogen om te migreren is een kenmerk van verschillende celtypes en speelt een cruciale rol in verscheidene fysiologische processen, zoals embryonale ontwikkeling, wondgenezing, en immuunresponsen. Echter, celmigratie is ook een belangrijk mechanisme bij kanker waarmee dit kankercellen los van de primaire tumor metastatische verspreiding starten. In de afgelopen jaren verschillende celmigratie assays ontwikkeld om het migratiegedrag van verschillende celtypen analyseren. Omdat het motorisch gedrag van cellen sterk verschilt tussen een tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) omgeving kan worden aangenomen dat de analyse van de migratie van cellen die zijn ingebed in een 3D omgeving oplevert in significantere celmigratie data. Het voordeel van de beschreven 3D collageenmatrix migratietestsysteem is dat cellen worden ingebed bij een fysiologische 3D netwerk van collageenvezels die de belangrijkste component van de extracellulaire matrix. Doortime-lapse microscopie video real celmigratie gemeten waarbij het bepalen van verschillende migratieparameters en hun veranderingen in reactie op pro-trekkende factoren of remmers. Verschillende celtypes kunnen worden geanalyseerd met deze techniek, waaronder lymfocyten / leukocyten, stamcellen en tumorcellen. Evenzo kan ook celgroepen of bolvormige deeltjes worden ingebed in de collageen matrix gelijktijdig met de analyse van de emigratie van enkele cellen uit de cel cluster / spheroid in de collageen rooster. We concluderen dat de 3D collageenmatrix migratie assay is een veelzijdige methode om de migratie van cellen te analyseren in een fysiologisch-achtige 3D-omgeving.

De gebruikte 3D-collageenmatrix migratietestsysteem combinatie met time-lapse video-microscopie en computerondersteunde cell tracking maakt de bepaling van verschillende celmigratie parameters zowel populatie gebaseerde parameter (bijvoorbeeld gemiddelde motorische activiteit) en eencellige gebaseerde parameters (bijvoorbeeld tijd van actieve beweging, snelheid, afstand gemigreerd). Een voorbeeld van de verkregen cell tracking datasets verwerking en presentatie van gegevens zijn aangegeven in f...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix at JoVE.com

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse van cel-migratie binnen Driedimensionale Collagen Matrix

Celmigratie is een biologisch verschijnsel dat betrokken is bij een overvloed aan fysiologische, zoals wondgenezing en immuunreacties en pathofysiologische processen, zoals kanker. De 3D-matrix van collageen migratie assay is een veelzijdig instrument om de trekkende eigenschappen van verschillende celtypes te analyseren binnen in een 3D-fysiologische-achtige omgeving.

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Vlakke en Three-Dimensional Printing van geleidende inkten

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Drie-dimensionale Cultuur van de Cel Model voor het meten van de effecten van het interstitiële vocht Flow op tumorcel invasie

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Concentrische Gel Systeem om de biofysische rol van matrix Microenvironment op 3D-Cell Migratie Bestudeer

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar Gradient Diffusion System Chemotaxis onderzoeken in een 3D collageenmatrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Driedimensionale Biomimetic Technologie: Novel Biorubber Creëert Defined micro- en macro-schaal Architectures in Collageen Hydrogels

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Voorbereiding en analyse van<em&gt; In Vitro</em&gt; Three Dimensional mammacarcinoom Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...