Name: analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix
Uploaded: 2014-10-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix at JoVE.com

This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany

1. Utarbeidelse av Migration Chambers <ol><li> Tilbered en parafinvoks / vaselin (1: 1) blanding og varme inntil blandingen har smeltet. Ved hjelp av en maling-børste og trekke 2-3 lag av parafinvoks / vaselin (1: 1) Bland i midten av glass-slide i henhold til figurene 1B-1D. MERK: Vi bruker vanlige glassplater (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (B / D / H)) </li><li> Påfør smeltet parafinvoks / vaselin mix raskt på glasset lysbilde for å unngå størkning mens du tegner. Sørg for at parafinvoks / vas...

Evnen til å migrere er et kjennetegn på kreftceller fire. Uten mulighet til å løsne fra den primære tumor, og til å migrere gjennom den omkringliggende bindevev tumorceller ikke vil være i stand til frø sekundære lesjoner, som er den viktigste årsaken til død nesten alle kreftpasienter. På grunn av dette forholdet mange studier fokuserer på kreft celle migrasjon. Målet med disse studiene er identifisering av nye målmolekyler og mål-baner som effektivt blokkerer tumorcellemigrering, og derved s...

Som cellefusjon (for en oversikt se 1,2) celle migrasjon er en annen biologisk fenomen som er involvert i en mengde fysiologiske prosesser, inkludert embryoutvikling, sårheling og immunresponser (for gjennomgang se 3). Imidlertid er evnen til å migrere videre en forutsetning for tumorceller til å metastasere (for gjennomgang se 3,4). Cell migrering er en kompleks, ennå ikke fullt forstått prosess som er styrt av et samspill av flere signaltransduksjonsveier initieres med forskjellige ligand (f.eks, cytokiner, kjemokiner, vekstfaktorer, hormoner, ekstracellulære matriks-komponenter)-reseptor (for eksempel reseptor tyrosinkinaser, kjemokine reseptorer, inte) interaksjoner fem slutt forårsaker omorganisering av aktin cytoskjelettet samtidig med de- og remontering av fokale vedheft komplekser og inte-mediert signale seks. in vitro og in vivo cellemigrasjon analyser har blitt utviklet de siste tiårene, inkludert Boyden kammer / Transwell analysen 7, scratch analysen / sårheling analysen 8-10, tredimensjonale ( 3D) kollagenmatriksen migrasjon assay 11 så vel som intravital avbildning / mikroskopi (for gjennomgang se 12). Hver av disse cellemigrasjon analyser har fordeler og ulemper, f.eks om kostnader og behov for utstyr, håndtering eller påliteligheten av innhentet data. Både Boyden kammer / Transwell analysen og scratch analysen / sårheling analysen er enkle, rimelige og velutviklede metoder for å måle celle migrasjon in vitro 7-10. I Boyden kammer / Transwell analyse celler er sådd på toppen av en innsats inneholdende porer (ca. 8 mikrometer i diameter) - den såkalte øvre rom 7. Valgfritt, kan innsatsen være belagt med ekstracellulær mATRIX komponenter, f.eks, fibronektin, kollagen, etc., for å etterligne en mer fysiologisk miljø. Likeledes kan endotelceller dyrkes på toppen av innsatsen og dermed etterligne en endotelcelle barriere 13. De cellene som har gått gjennom porene i løpet av en definert tidsintervall i nedre kammer husing media og kosttilskudd, slik som vekstfaktorer og kjemokiner, blir brukt som et lese-out for å kvantifisere celle migrasjon (eller bloduttredelse). I scratch analysen / sårtilheling analyse cellene er sådd i form av plater og er vokst til konfluens 10. I avhengighet av de eksperimentelle innstillingsplatene kan være forhåndsbelagt med ekstracellulære matriks-komponenter, slik som fibronektin. Etter å ha laget en ripe / såret ved skraping blir cellemonoskiktet enkeltceller fra hver side av bunnen / såret kan migrere inn i gapet, for derved å fylle / helbredende det 10. Avstanden mellom de to sider av skrape / sår bestemmesi avhengighet av tiden, og brukes som en lese-ut for den vandrende aktiviteten av cellene 10. Imidlertid, for å diskriminere mellom celleproliferasjon (som også kan føre til fylling / helbredelse av grunnen / sår) og cellemigrasjon er det anbefalt å kombinere analysen med time-lapse videomikroskopi og enkelt celle sporing 10. Men både Boyden kammer / Transwell assay og ripe assay / sårheling analysen, er temmelig ufullkomment om en fysiologisk lignende cellulære miljø. I Boyden kammer / Transwell analysecellene har til å migrere gjennom en pore av plast, mens det i bunnen av assay / sårheling analyseceller sås på en to-dimensjonal pre-belagte plastplate. Likeledes er det velkjent at den vandrende oppførsel skiller seg markant mellom en to-dimensjonal og 3D miljø 3. For eksempel tredimensjonal matrise voksninger av fibroblaster avvike fra fokale og fibrillar sammenvoksninger karakteriseres på to-dimensjonale substrater i sitt innhold av α5β1 og αvβ3 integrinene, paxillin, andre cytoskeletal komponenter, og tyrosinfosforylering av fokus vedheft kinase 14. Likeledes, celler innebygd i et 3D-miljø også vises en endret trekkadferden 15. Således for å analysere cellemigrasjon mer nøyaktig en migreringsanalyse er anbefalt som tillater å måle overføringen av enkeltceller i et 3D fysiologiske eller fysiologisk lignende miljø. Intravital avbildning / mikroskopi er gull-standarden for måling av cellemigrering innenfor et 3D fysiologisk sammenheng. Dette betyr ikke bare hører til ekstracellulære matriks-celle interaksjoner, men også til interaksjonene mellom forskjellige celletyper, slik som tumor-celler og endotelceller under ekstravasasjon 16 eller lymfocytt handel innen lymfeknute 17, som til dags dato, er mulig på grunn forbedrede fluorescensmikroskopi teknikker, for eksempel 2-fotonkonfokal laser scanning mikroskopi, bruk av vitale fluorescerende fargestoffer og transgene musestammer som uttrykker fluorescerende proteiner derivater 12,16,17. I tillegg kan intra bildebehandling / mikros kombineres med manuell og automatisert celle sporing 18. Imidlertid, på grunn av behovet for en 2-foton konfokal laser-skanning mikroskopi, så vel som dyr (og egnede transgene dyremodeller) intravital avbildning / mikroskopi er en ganske kostnadskrevende teknikk. For å overvinne begrensningene i Boyden kammer / Transwell analysen og ripe assay / sårheling assay og for å analysere migrering av forskjellige celletyper innenfor et 3D miljø 3D kollagenmatriksen migrering assay ble utviklet 11,19. Derved blir migrerende celler innleiret i en 3D-kollagen fibernett, som mer ligner til in vivo-situasjonen. Conjointly, på grunn av time-lapse video mikros ekte cellemigrasjon måles slik at bestemme strnasjon av flere migrasjonsparametere så vel som deres forandringer i respons på pro-trekkende faktorer eller inhibitorer. Ulike celletyper kan analyseres ved hjelp av denne teknikken, inkludert lymfocytter og leukocytter 11,20, blodkreft stilk / stamceller 21-24, og kreftceller 5,25-29. I tillegg til enkle celler også celleklynger eller sfæroider kan være innebygd i kollagenmatriksen samtidig med analyse av utvandring av enkeltceller fra celle klynge / sfæroide inn i kollagen gitter 30,31. Denne protokollen gir en oversikt om et enkelt, men kraftig teknikk for å analysere vandringsadferd av forskjellige celletyper innenfor et 3D miljø - en in vitro fremgangsmåte gir resultater som er i nærheten av den in vivo-situasjon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Leica DM IL inverted microscope</td>
			<td style="width:192px;">Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Microscope stage heater</td>
			<td style="width:192px;">Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">JVC C1431 video camera</td>
			<td style="width:192px;">JVC, Bad Vilbel, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Axis 241Q video server</td>
			<td style="width:192px;">Axis communication GmbH, Ismaning, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Mac G5 Computer</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">iMac</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">FileMaker Pro</td>
			<td style="width:192px;">FileMaker GmbH, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Multi-camera video surveillance software(Security Spy)</td>
			<td style="width:192px;">Bensoftware, London, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Runtime Revolution Media 2.9.0</td>
			<td style="width:192px;">RunRev Ltd., Edinburgh, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Paraffin</td>
			<td style="width:192px;">Applichem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">A4264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Petrolatum jelly</td>
			<td style="width:192px;">local drug store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Purecol (liquid collagen)</td>
			<td style="width:192px;">Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">10x MEM</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">M0275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">7.5% Sodium Bicarbonate solution</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">EGF</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">U73122</td>
			<td style="width:192px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td align="right" style="width:119px;">662035</td>
			<td>dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix

Evnen til å migrere er et kjennetegn på ulike celletyper og spiller en avgjørende rolle i flere fysiologiske prosesser, inkludert embryoutvikling, sårheling og immunresponser. Imidlertid er cellemigrasjon også en viktig mekanisme i kreft slik at disse kreftceller til å løsne fra den primære tumor til å begynne metastatisk spredning. I løpet av de siste årene forskjellige cellemigrerings analyser har blitt utviklet for å analysere den vandringsadferd av forskjellige celletyper. Fordi motorisk oppførsel av cellene markert forskjellig mellom en to-dimensjonal (2D), og tre-dimensjonale (3D) miljø kan det antas at analysen av migrering av celler som er innebygd i et 3D-miljø ville gi mer signifikant cellemigrasjon data. Fordelen med den beskrevne 3D kollagenmatriksen migrasjon analysen er at cellene er innleiret i en fysiologisk 3D nettverk av kollagenfibre som representerer den viktigste komponent av ekstracellulær matriks. Grunnettime-lapse videomikros fast cellemigrasjon blir målt slik at bestemmelse av en rekke migrasjonsparametere så vel som deres endringer som respons på pro-trekkende faktorer eller inhibitorer. Ulike celletyper kan analyseres ved hjelp av denne teknikken, inkludert lymfocytter / leukocytter, stamceller og kreftceller. Likeledes kan også celle klynger eller sfæroider bli integrert i kollagenmatriksen samtidig med analyse av utvandring av enkeltceller fra celle klynge / sfæroide inn i kollagen gitteret. Vi konkluderer med at 3D-migrasjon kollagen matriks-analysen er en anvendelig metode for å analysere migreringen av celler i en fysiologisk lignende 3D miljø.

Den brukte 3D-kollagen matrise migrasjon analysen kombinert med time-lapse video-mikroskopi og datastøttet celle sporing gjør for bestemmelse av ulike cellemigrasjon parametere inkludert både populasjonsbasert parameter (f.eks, mener motorisk aktivitet) og enkeltcellebaserte parametere (for eksempel tidspunktet for aktiv bevegelse, hastighet, avstand migrert). Et eksempel på de oppnådde celle sporing datasett, databehandling og datapresentasjons er gitt i figur 2. En celle sporing...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix at JoVE.com

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse av celle migrasjon innenfor en tre-dimensjonal Kollagen Matrix

Cell migrasjon er et biologisk fenomen som er involvert i en mengde av fysiologisk, slik som sårheling og immunresponser, og patofysiologiske prosesser, som kreft. Den 3D-migrasjon kollagen matriks-analysen er en allsidig verktøy for å analysere de trekkende egenskaper av forskjellige celletyper innenfor et 3D fysiologisk lignende miljø.

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar og tredimensjonale Trykking av Conductive blekk

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Live-cell Imaging of Migrering cellene uttrykker fluorescensmerket-merket Proteiner i en tredimensjonal Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Tredimensjonal Cell Kultur Modell for å måle effekten av interstitiell væske Flow på Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Konsentriske Gel System for å studere den Biofysikalsk rolle Matrix mikromiljøet på 3D-Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar Gradient Diffusion System for å etterforske Chemotaxis i en 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Tredimensjonal Biomimetic Technology: Novel Biorubber Oppretter Defined mikro- og makroskala arkitektur i Kollagen Hydrogeler

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Utarbeidelse og analyse av<em&gt; In Vitro</em&gt; Tredimensjonal brystkreft Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensjonal epitelvev innebygd i ekstracellulær matriks

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...