Name: analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix
Uploaded: 2014-10-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix at JoVE.com

This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany

1 Beredning av migrations Chambers <ol><li> Förbered en paraffin / vaselin (1: 1) mix och värm tills blandningen har smält. Med hjälp av en paint-pensel och dra 2-3 skikt av paraffin / vaselin (1: 1) Blanda i mitten av glasskivan enligt fig 1B-1D. OBS: Vi använder vanliga glasskivor (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (B / D / H)) </li><li> Applicera den smälta paraffin / vaselin mix snabbt på glasskiva för att undvika stel medan du ritar. Säkerställa paraffin / vaselin skiktet är ungefär 2 till ...

Förmågan att migrera är ett kännetecken för tumörceller 4. Utan möjligheten att lösgöra från den primära tumören och att migrera genom de omgivande bindväv tumörceller kommer inte att kunna ympa sekundära lesioner, som är den främsta orsaken till död av nästan alla cancerpatienter. På grund av detta förhållande många studier fokuserar på cancer cell migration. Syftet med dessa studier är att identifiera nya målmolekyler och målgrupp vägar som effektivt blockerar tumörcellmigration...

Som cellfusion (för en översikt se 1,2) cellmigration är ett annat biologiskt fenomen som är inblandad i en uppsjö av fysiologiska processer, inklusive embryoutveckling, sårläkning och immunsvar (för översikt se 3). Emellertid är förmågan att migrera också en förutsättning för tumörceller att metastasera (för översikt se 3,4). Cellmigration är en komplex, ännu ej helt förstådd process som styrs av samspelet mellan flera signaltransduktionsvägar initieras av olika ligand (t.ex. cytokiner, kemokiner, tillväxtfaktorer, hormoner, extracellulära matriskomponenter) receptor (t.ex. receptortyrosinkinaser, kemokinreceptorer, integriner) samspelet 5 slutligen orsakar en omorganisering av aktin cytoskelettet samtidig med de- och monteras ihop brännvidhäftnings komplex och grin-medierad signalering 6. in vitro och in vivo cellmigrationsanalyser har utvecklats under de senaste decennierna, bland annat Boyden kammare / transwell analys 7, scratch test / sårläknings analys 8-10, tredimensionell ( 3D) kollagenmatris migrationsanalys 11 samt intravital imaging / mikroskopi (för översikt se 12). Var och en av dessa cellmigrationsanalyser har för-och nackdelar, t.ex. beträffande kostnader och behov av utrustning, hantering eller tillförlitlighet erhållna data. Både Boyden kammare / transwell analys och scratch-analysen / sårläkningsanalysen är enkla, billiga och väl utvecklade analyser för att mäta cellmigration in vitro 7-10. I Boyden-kammare / Transwell analys celler ympas ovanpå ett insert innehållande porer (ca 8 ^ m i diameter) - den så kallade övre utrymmet 7. Valfritt, kan skäret vara belagd med extracellulära mAtrix komponenter, t.ex. fibronektin, kollagen, etc, för att efterlikna en mer fysiologisk miljö. Likaså skulle endotelceller odlas ovanpå insatsen, därigenom härma en endotelcell barriär 13. De celler som har passerat genom porerna under en definierad tidsperiod i det nedre facket hyser media och tillägg, såsom tillväxtfaktorer och kemokiner, används som en avläsning att kvantifiera cellmigration (eller extravasation). I scratch-analysen / sårläkningsanalys celler ympas i plattor och odlas till sammanflytning 10. I beroende av de experimentella inställningsplattorna kan vara pre-belagd med extracellulära matriskomponenter, såsom fibronektin. När du har skapat en repa / sår genom att skrapa encellsskiktet enskilda celler från varje sida av repan / såret kan migrera in i gapet och därigenom fylla / läka det 10. Avståndet mellan de två sidorna av skrap / sår bestämsi beroende av tid och används som en avläsning för migrations aktiviteten av cellerna 10. Men att skilja mellan celltillväxt (som också kan leda till fyllning / läkning av repan / sår) och cellmigration rekommenderas att kombinera analysen med time-lapse video mikroskopi och enstaka cell tracking 10. Men både Boyden kammare / transwell analys och repor analys / sårläknings analys är ganska ofullkomliga om ett fysiologiskt liknande cellmiljön. I Boyden-kammare / Transwell analys celler har att vandra genom en plast por, medan i scratch assay / sårläkningsanalys celler ympas på en två-dimensionell förbelagda plastplatta. Likaså är det väl känt att den flyttande beteende skiljer sig markant mellan en tvådimensionell och 3D-miljö 3. Exempelvis tredimensionell matris sammanväxningar av fibroblaster skiljer sig från fokala och fibrillära sammanväxningar karakteriseras på två-dimensionella substrat i sitt innehåll av α5β1 och aVp3 integriner, paxillin, andra cytoskelettala komponenter, och tyrosin fosforylering av fokal vidhäftnings kinas 14. Likaså celler inbäddade i en 3D-miljö visas också en förändrad vandrande beteende 15. Således för att analysera cellmigration mer exakt en migrations analys rekommenderas gör det möjligt att mäta migration av enskilda celler i en 3D-fysiologiska eller fysiologisk-liknande miljö. Intravital imaging / mikroskopi är guld-standarden för mätning av cellmigration i ett 3D fysiologiskt sammanhang. Detta innebär inte bara hör till extracellulära matrix-cell-interaktioner, men också att samspelet mellan olika celltyper, såsom tumörceller och endotelceller under extravasering 16 eller lymfocyter människohandel inom lymfkörteln 17, som hittills är möjligt på grund av förbättrade fluorescensmikroskopiska tekniker, såsom 2-fotonkonfokal laserscanningsmikroskopi, användning av vitala fluorescerande färgämnen och transgena musstammar uttrycker fluorescerande proteiner derivat 12,16,17. Dessutom kan intravital imaging / mikroskopi kombineras med manuell och automatiserad cell tracking 18. Men på grund av behovet av en 2-foton konfokala laserskanning mikroskopi och djur (och lämpliga transgena djurmodeller) intravital imaging / mikroskopi är en ganska kostnadskrävande teknik. För att övervinna begränsningarna i Boyden kammar / transwell analys och scratch-analysen / sårläkningsanalysen och att analysera migration av olika celltyper i en 3D-miljö kollagenmatris migrationsanalysen 3D utvecklades 11,19. Därigenom är migrerande celler inbäddade i en 3D kollagenfibernätet, vilket fler liknar i in vivo situationen. Conjointly, på grund av tidsförlopp video mikroskopi verkliga cellmigration mäts tillåter Bestämningnation av flera migrationsparametrar samt deras förändringar som svar på pro-flyttande faktorer eller inhibitorer. Olika celltyper skulle kunna analyseras med användning av denna teknik, inklusive lymfocyter och leukocyter 11,20, hematopoietiska stam / progenitorceller 21-24, och tumörceller 5,25-29. Förutom enstaka celler också cell kluster eller sfäroider kan vara inbäddade i kollagenmatrisen samtidigt med analys av emigration av enskilda celler från cellkluster / sfäroid i kollagen lattice 30,31. Detta protokoll innehåller en översikt om en enkel, men kraftfull teknik för att analysera flyttbeteende olika celltyper i en 3D-miljö - en in vitro metod som ger i resultat som är nära den in vivo situationen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Leica DM IL inverted microscope</td>
			<td style="width:192px;">Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Microscope stage heater</td>
			<td style="width:192px;">Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">JVC C1431 video camera</td>
			<td style="width:192px;">JVC, Bad Vilbel, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Axis 241Q video server</td>
			<td style="width:192px;">Axis communication GmbH, Ismaning, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Mac G5 Computer</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">iMac</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">FileMaker Pro</td>
			<td style="width:192px;">FileMaker GmbH, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Multi-camera video surveillance software(Security Spy)</td>
			<td style="width:192px;">Bensoftware, London, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Runtime Revolution Media 2.9.0</td>
			<td style="width:192px;">RunRev Ltd., Edinburgh, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Paraffin</td>
			<td style="width:192px;">Applichem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">A4264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Petrolatum jelly</td>
			<td style="width:192px;">local drug store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Purecol (liquid collagen)</td>
			<td style="width:192px;">Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">10x MEM</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">M0275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">7.5% Sodium Bicarbonate solution</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">EGF</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">U73122</td>
			<td style="width:192px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td align="right" style="width:119px;">662035</td>
			<td>dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix

Förmågan att migrera är ett kännetecken för olika celltyper och spelar en avgörande roll i flera fysiologiska processer, inklusive embryoutveckling, sårläkning och immunsvar. Dock är cellmigration också en viktig mekanism i cancer som möjliggör dessa cancerceller att lossna från den primära tumören att börja metastaser spridning. Under de senaste åren olika cellmigrations analyser har utvecklats för att analysera flyttbeteende olika celltyper. Eftersom motoriskt beteende celler markant skiljer mellan en tvådimensionell (2D) och tredimensionella (3D) miljö kan det antas att analysen av migration av celler som är inbäddade i en 3D-miljö skulle ge mer betydande cell migration data. Fördelen med den beskrivna 3D kollagenmatrisen migration analysen är att cellerna är inbäddade i en fysiologisk 3D nätverk av kollagenfibrer som representerar den största delen av den extracellulära matrisen. På grund avtime-lapse video mikroskopi verkliga cellmigration mäts tillåter bestämning av flera migrationsparametrar samt deras förändringar som svar på pro-flyttande faktorer eller inhibitorer. Olika celltyper skulle kunna analyseras med användning av denna teknik, inklusive lymfocyter / leukocyter, stamceller och tumörceller. På samma sätt skulle också cellkluster eller sfäroider vara inbäddade i kollagenmatrisen samtidigt med analys av emigration av enskilda celler från cellkluster / sfäroid i kollagen gitter. Vi drar slutsatsen att den 3D kollagenmatrisen migration assay är en mångsidig metod för att analysera migration av celler inom en fysiologisk-liknande 3D-miljö.

Den använda 3D-kollagenanalysmatris migration i kombination med time-lapse video-mikroskopi och datorstödd spårningscell möjliggör bestämning av olika cellmigrationsparametrar inklusive både populationsbaserad parameter (till exempel, menar motoriskt aktivitet) och samlade cellbaserade parametrar (t.ex. tid för aktiv rörelse, hastighet, avstånd migrerat). Ett exempel på de erhållna spårning cell data, databehandling och presentation av data ges i figur 2. En cell tracking ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix at JoVE.com

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analys av Cell Migration inom en tredimensionell kollagenmatris

Cellmigration är ett biologiskt fenomen som är involverad i en plethora av fysiologiska, såsom sårläkning och immunsvar, och patofysiologiska processer, som cancer. Den 3D-kollagenmatrisen migration analysen är ett mångsidigt verktyg för att analysera de flyttande egenskaper hos olika celltyper inom en 3D fysiologisk-liknande miljö.

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Plana och tredimensionella Tryckning av ledande bläck

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Live-cell imaging att migrera celler som uttrycker fluorescerande-taggade proteiner i en tredimensionell matris

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Tredimensionell cellkulturmodell för mätning av effekterna av interstitialvätska Flow på Tumörcellinvasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Concentric Gel system att studera den Biofysikalisk roll Matrix mikromiljö på 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar Gradient Diffusion System för att undersöka Chemotaxis i en 3D kollagenmatris

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Tredimensionell Biomimetic Technology: Novel Biorubber Skapar Defined mikro- och makroskala arkitekturer i Collagen Hydrogeler

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Beredning och analys av<em&gt; In Vitro</em&gt; Tredimensionell bröstkarcinom Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensionella epitelvävnader Embedded inom extracellulär matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...