Name: strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00
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Agradecemos Rev. Dr. Ralph Bohlmann e Rev. Dr. James Voelz por sugerir a palavra &quot;anastasis&quot; para descrever a reversão da apoptose; Douglas R. Green para as células HeLa que expressam estavelmente o citocromo c -GFP; Charles M. Rudin e Eric E. Gardner para H446 células; Lamb Heather de assistência em desenho dos desenhos animados para o vídeo; Yee Hui Yeo para valiosa discussão deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), a Bolsa de Estudos Dr. Walter Szeto Memorial (HLT), bolsa Fulbright 007-2009 (HLT), Life Science Foundation Research fellowship (HLT), NIH concede NS037402 (JMH) e NS083373 (JMH) e Universidade Comitê Grants do Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang é um Shurl e Kay Curci Fundação Fellow da Fundação Life Sciences Research.

1. Preparação de células para imagens de células vivas <ol><li> Para facilitar a detecção de alterações morfológicas, escolher células aderentes, tais como células HeLa (carcinoma cervical humano), as células que são planas sobre o substrato para melhor visualizar alteração da membrana plasmática e organelos intracelulares. Nota: Reversão de apoptose tem sido observada em várias células de mamífero 12,13, incluindo as células do fígado de rato primária, macrófagos primários, ...

Anastasis se refere ao fenômeno em que as células que tenham activado via de morte celular reverter posteriormente o processo de morrer e sobreviver. Aqui, nós demonstramos que imagens de células vivas podem ser usados ​​para confirmar que as mesmas células individuais de fato pode reverter processo de morte celular por apoptose numa fase tardia, e, em seguida, continuar a sobreviver e reproduzir. Os nossos protocolos descrever várias condições de tratamento específicas do tipo de células optimizado para i...

A apoptose (palavra grega para &quot;cair para a morte&quot;) é geralmente aceite que é um processo de uma maneira que termina em suicídio celular 1-7. Perturbação genética de pró-morte genes resulta na sobrevivência de células extra que de outra forma morrem em animais inteiros, incluindo as células que já iniciadas 8,9 a via de apoptose. Da mesma forma, as manipulações genéticas permitem que as células de mamíferos saudáveis ​​que artificialmente mostrar &quot;me come&quot; sinais ou que perdem aderência à sua matriz extracelular para escapar da morte por fagocitose de células inteiras ou entosis, respectivamente 10,11. No entanto, nós e outros mostraram que, sem manipulação genética de células de mamíferos saudáveis ​​normais e linhas de células também pode recuperar desde as fases iniciais da apoptose 12-15. Usando ferramentas para rastrear células individuais, demonstramos ainda mais a recuperação de estágios finais de apoptose 12,13, depois que as células passaram checkpoints importante que típicoly marcar o &quot;ponto de não retorno&quot; 2-6. Estes pontos de controlo de fase de apoptose tardia incluem libertação mitocondrial de citocromo c, a activação de caspases, fragmentação nuclear, e formação de corpos apoptóticos. Adotamos uma palavra composta grega &quot;anastasis&quot;, que significa &quot;subindo para a vida&quot;, para descrever essa inversão de apoptose à beira da morte celular 2-6. A não ser que todo o processo de morrer recuperação é observado por imagens de células vivas, é um desafio para distinguir as células que sofreram anastasis a partir de células que nunca experimentaram eventos apoptóticos. Décadas de trabalho têm revelado que as características morfológicas de suicídio celular por apoptose são movidos por eventos bioquímicos e moleculares conservados evolutivamente 16-19. Estes eventos promover a auto-destruição das células que regulam os processos de desenvolvimento e homeostáticos em organismos unicelulares e pluricelulares, eliminando danificado ou dcélulas angerous 16-19. Enquanto as células em apoptose pode ser facilmente distinguidos por manifestações morfológicas, bioquímicas e moleculares padronizados de apoptose 1,5,6,16,20, atualmente não há nenhum marcador conhecido específico para anastasis 12,13. É importante notar que as células que sofreram anastasis parecem ser as células saudáveis ​​normais, e as células que começam a inversão apoptose apenas aparecem como células moribundas apoptóticos 12,13. Assim, novas ferramentas são necessárias para concluir com segurança que uma determinada célula sobreviver já havia experimentado processos apoptóticos ativos. A apoptose é geralmente assumido como uma cascata irreversível porque é um processo de destruição rápida e maciça. Embora possa demorar alguns minutos para dias para algumas células para iniciar a apoptose, uma vez que as mitocôndrias têm lançado fatores apoptogénicas como citocromo c para o citosol 21,22, caspases pode ser ativado dentro de 5 minutos 23,24, seguido por citoplasmática econdensação nuclear dentro de 10 min 25-27, e morte celular pouco depois 25-27. Caspases activadas orquestrar a apoptose por clivagem e inactivação de componentes estruturais e funcionais importantes para o propósito de demolição 2,28 celular, tais como o inibidor da endonuclease DFF45 / ICAD 29,30. Caspases também ativar fatores pró-apoptóticos, como BID membro família Bcl-2, que transloca para a mitocôndria para promover a liberação mitocondrial do citocromo c 31,32. Atividade Caspase também resulta em exposição na superfície celular de phosphatidylserine como um &quot;me comer&quot; sinal para a promoção engulfment de morrer células por macrófagos ou células vizinhas através de fagocitose 33. Além disso, os eventos apoptóticos tornar mitocôndrias disfuncionais, interrompendo bioenergética celular e metabolismo 34,35,36. Assim, a recuperação de tal destruição parece intuitivamente improvável. Contrariamente ao original esperarções, as células podem reverter o processo de morte celular por apoptose, mesmo numa fase tardia. Ao monitorar continuamente o destino de morrer células em cultura, observou-se a reversibilidade da fase de apoptose tardia em um intervalo de células primárias e linhas de células 12,13. A remoção do estímulo morte permitiu a recuperação das características evidentes de apoptose, tais como a fragmentação mitocondrial, a condensação da cromatina, danos no ADN, de vesículas de membrana do plasma, a exposição da superfície celular de fosfatidilserina, a libertação de citocromo c mitocondrial, activação de caspases, fragmentação nuclear, encolhimento da célula, e formação de corpos apoptóticos. Estas observações levantam questões sem respostas sobre as funções, as consequências, e os mecanismos de anastasis. Para responder a estas perguntas, um pré-requisito é para identificar com segurança as células que sofreram anastasis. Aqui, descrevemos os métodos de microscopia ao vivo e um biossensor caspase para detectar células que já inverteu apoptose fase tardia e then sobreviveu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="667">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">LSM780 confocal microscopy</td>
			<td style="width:139px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:127px;">/</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Glass bottom culture dish</td>
			<td style="width:139px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:127px;">P35G-0-14-C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Transparent CultFoi</td>
			<td style="width:139px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:127px;">000000-1116-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">CO2 independent medium</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">18045-088</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">CellTracker</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">C34552</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Mitotracker Red CMXRos</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">M-7512</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">H1399</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Fluorescently labeled annexin V</td>
			<td style="width:139px;">Biovision</td>
			<td style="width:127px;">K201</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis

Anastasis (grego para &quot;ressuscitar para a vida&quot;) refere-se a recuperação de células que morrem. Antes essas células se recuperar, eles passaram por checkpoints importantes da apoptose, incluindo fragmentação mitocondrial, liberação de citocromo c para o citosol, ativação de caspases, condensação da cromatina, danos no DNA, fragmentação nuclear, blebbing membrana plasmática, o encolhimento celular, exposição da superfície celular de fosfatidilserina, e formação de corpos apoptóticos. Anastasis pode ocorrer quando os estímulos apoptóticos são removidos antes da morte, permitindo assim que as células morrem a inverter a apoptose e, potencialmente, outros mecanismos de morte. Portanto, anastasis parece envolver processos de cura fisiológicas que também poderiam sustentar as células danificadas de forma inadequada. As funções e mecanismos de anastasis ainda não estão claros, prejudicado em parte pelas ferramentas limitadas para a detecção de eventos passados ​​após a recuperação de células aparentemente saudáveis. Estratégias para detectar Anastasis permitirá estudos sobre os mecanismos fisiológicos, os perigos de células mortas-vivas em patologia da doença e possíveis terapias para modular anastasis. Aqui, descrevemos estratégias eficazes por meio de microscopia de células vivas e um biossensor caspase mamífero para identificar e rastrear anastasis em células de mamíferos.

Para estudar a reversão da apoptose, células de cultura de tecido são primeiro expostos a um estímulo de morte para desencadear a apoptose. Quando as células apresentam marcas de apoptose, o meio de cultura fresco é então aplicada para lavar o estímulo e em seguida incubar as células moribundas para permitir a recuperação (Figura 1A). Aqui, a questão-chave a ser abordado é o quão longe morrendo células cultivadas individuais podem progredir para apoptose e ainda sofrer anastasis. Esta que...

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Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Mudanças Dinâmicas de monitoramento dos níveis de cálcio mitocondrial durante a apoptose através de um sensor de cálcio geneticamente codificado

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Biologia

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Modificado anexina V / propídio Assay Apoptose Iodeto para avaliação rigorosa da morte celular

Studies of cellular apoptosis have been significantly impacted since the introduction of flow cytometry-based methods. Propidium iodide (PI) is widely ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Ativação da apoptose por microinjeção citoplasmática de citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Rastreamento Deformações Tissue Morfogenéticas no embrião de galinha precoce

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival

As formulações para liofilização de bactérias e sua influência na sobrevivência das células

Cellular water can be removed to reversibly inactivate microorganisms to facilitate storage. One such method of removal is freeze-drying, which is ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Rastreamento de celular utilizando proteínas Photoconvertible Durante o Desenvolvimento Zebrafish

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

O tomate / GFP-FLP / FRT Method for Imaging ao vivo de Mosaico Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; As células fotorreceptoras

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

A Guide to Modern quantitativa fluorescente Western Blotting com estratégias de resolução de problemas

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Acompanhamento Temporal de progressão do ciclo celular utilizando citometria de fluxo, sem a necessidade de sincronização

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...