Name: manipulating the murine lacrimal gland
Uploaded: 2014-11-18T13:00:00
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Die Autoren bedanken sich bei Förderung durch die UCSF Ressourcenzuordnung Programm vorgesehen anzuerkennen.

Alle Tier Arbeit wurde unter strenger Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der University of California, San Francisco genehmigt. 1. embryonalen Maus-Tränendrüsen (LG): Ernten und Mikrodissektion <ol><li> Folgenden Verfahren durch die Institutional Tiere für wissenschaftliche Forschung Ethik-Komm...

<ol>
	<li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca.">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).</li><li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development.">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, 2563-2572 (2000).</li><li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes:+relevance+in+dry+eye+diseases.">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li><li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs.">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycan-dependent+restriction+of+FGF+diffusion+is+necessary+for+lacrimal+gland+development.">Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development.</a> Development. 139, 2730-2739 (2012).</li><li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development:+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms.">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li><li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis.">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, 1223-1234 (2005).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10/FGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis.">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11 (2005).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration.">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494 (2013).</li></ol>

Die Vielseitigkeit der Kultur und manipulieren das LG ex vivo bietet erhebliche Vorteile für das Studium ihrer Entwicklung. Dies schließt die Geschwindigkeit, mit der sich der Forscher in der Lage, Hypothesen und die Vielzahl von Störungen, die ausgeführt ist, um zu beurteilen, wie Epithelzellen, neuronale, Endothel- und mesencyhmal Zellen interagieren, um das Organ zu bilden, zu testen. Es gibt jedoch eine Reihe von Einschränkungen bei der Nutzung dieses Modell. Erstens durch seine Isolierung die Drüse n...

Die Tränendrüse (LG) ist für wässrige Tränensekretion kritisch für die Sehschärfe und die Gesundheit, Pflege und zum Schutz der Zellen der Augenoberfläche verantwortlich. LG Dysfunktion führt zu einer der häufigsten und schwächenden Augenerkrankungen: wässrige mangel Trockenen Auges, die durch Augenreizung, Lichtempfindlichkeit auszeichnet und verminderte Sicht ein. Im menschlichen LG liegt in der Umlaufbahn über dem seitlichen Ende des Auges in dem 3 - 5 Werkausführungsgänge Ablagerung Tränen auf der Augenoberfläche. Die Maus verfügt über drei Paare von großen Augendrüsen, die am meisten untersuchte, von denen ist die Tränendrüse (LG) befindet vorderen und ventralen zum Ohr (exorbital) mit Tränen über einen einzigen Ausführungsgang Reisen in das Auge. Ähnlich wie bei anderen Drüsenorgane entwickelt das LG durch den Prozess der epithelialen Verzweigung Morphogenese bei dem eine einzelne epitheliale Knospe innerhalb eines kondensierten Mesenchym erfährt mehrere Runden von Knospe und Kanalbildung fürm eine komplizierte Verbundnetz von sekretorischen Acini und Leitungen (1) 2. Während der Entwicklung des Epithels vaskularisiert sowie stark von den parasympathischen Nerven des Ganglion pterygopalatinum und in geringerem Maße von der überlegenen zervikalen Ganglion 3 innerviert durch sympathische Nerven. Wechselwirkungen zwischen jedem dieser Zelltypen, dh neuronale, Epithelzellen, Endothelzellen und mesenchymalen Zellen, sind für die Funktion und Wartung der adulten Geweben. Allerdings bleibt die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen koordiniere LG Entwicklung und Regeneration und wie Inter-Zellen-Typ-Kommunikation führt diese Prozesse unklar. Das Aufkommen von embryonalen ex vivo Kulturtechniken hat die Identifizierung von Entwicklungs- und Regenerationswege in mehreren verzweigenden Organe 4 erlaubt. Züchten ex vivo gibt dem Forscher die Möglichkeit, die Orgel mich zu manipulieren (mechanisch, genetische oder chemische) unter definierten Bedingungen sowie die Organentwicklung und Zell-Zell-Wechselwirkungen in Echtzeit zu charakterisieren. Die exorbital LG der Maus ist sehr gut für diese Technik und neuere Studien haben festgelegt, Signalsysteme, die ihre Entwicklung 2,5 regulieren. Doch trotz der Notwendigkeit, Signalstoffe zugrunde LG Entwicklung und Regeneration zu verstehen, momentan bleibt wenig erforschten, wahrscheinlich aufgrund der technischen Schwierigkeiten bei der Isolierung des Organs. In diesem Beitrag beschreiben wir, wie zu isolieren und zu führen ex vivo Kultur von embryonalen Maus-LG zu Entwicklungsprogramme definieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1767">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Name</td>
			<td style="width:129px;">Catalog #.</td>
			<td style="width:213px;">Company</td>
			<td style="width:997px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 without HEPES</td>
			<td>SH3027101</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin solution from bovine serum</td>
			<td>A9576</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 16% Solution</td>
			<td>15710</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Diluted to 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline 10X</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared from 10X stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">holo-Transferrin bovine</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">L- Ascorbic acid (Vitamin C)</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes</td>
			<td>130182</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo Microscope with substage iluminator</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td rowspan="2">Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Substage Illuminator Base for Stereo Microscope</td>
			<td>TLB 4000</td>
			<td>Diagnostics Instruments, Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes</td>
			<td>353001</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mm uncoated glass bottom dishes</td>
			<td>P50G-1.5-14-F</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Widefield fluorescence microscope</td>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:213px;">Carl Zeiss</td>
			<td>Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached 
			digital camera.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td style="width:213px;">Leica Microsystems</td>
			<td>Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ideal for harvesting glands from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm)</td>
			<td>17-305X</td>
			<td>Integra LifeSciences Corporation</td>
			<td>Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm)</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine Science Tools (USA), Inc.</td>
			<td>Ideal for harvesting glands from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.</td>
			<td>4-30</td>
			<td colspan="2">Integra LifeSciences Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10</td>
			<td>4-310</td>
			<td colspan="2">Integra LifeSciences Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit</td>
			<td>AM1931</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td>
			<td>3446-005-01</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice</td>
			<td></td>
			<td style="width:213px;">Charles River Labs</td>
			<td>Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm</td>
			<td>110405</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice</td>
			<td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Optional mice for learning how to locate the LG.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulating the murine lacrimal gland

Die Tränendrüse (LG) sezerniert wäßrigen Tränen zur Aufrechterhaltung von Struktur und Funktion der Hornhaut, ein transparentes Gewebe wichtig für das Sehvermögen erforderlich. Im menschlichen einen einzigen LG liegt in der Umlaufbahn über dem seitlichen Ende eines jeden Auges liefern Tränen auf die Augenoberfläche über 3 - 5 Werkkanäle. Die Maus verfügt über drei Paare von großen Augendrüsen, die am meisten untersuchte, von denen ist die exorbital Tränendrüse (LG) befindet vorderen und ventralen an das Ohr. Ähnlich wie bei anderen Drüsenorgane entwickelt das LG durch den Prozess der epithelialen Verzweigung Morphogenese bei dem eine einzelne epitheliale Knospe innerhalb eines kondensierten Mesenchym erfährt mehrere Runden von Knospe und Kanalbildung, um eine komplizierte Verbundnetz von sekretorischen Acini und Kanäle bilden. Diese aufwendigen Verfahren wurde auch in vielen anderen epithelialen Organen wie der Bauchspeicheldrüse und der Speicheldrüse dokumentiert. Allerdings hat das LG viel weniger erforscht und die Mechanismen, die Morphogenese sind schlecht unterstand. Wir vermuten, dass diese Unterrepräsentanz als Modellsystem ist eine Folge der Schwierigkeiten bei der Suche, Präparieren und Kultivieren der LG verbunden. So beschreiben wir Dissektion Techniken für die Ernte embryonalen und postnatalen LG und Methoden für die ex vivo Kultur des Gewebes.

Das LG entwickelt sich durch den Prozess der epithelialen Verzweigung Morphogenese. Hell Bilder embryonaler LGs bei e14, e15, e16, e17 und P2 seziert illustrieren diese Veranstaltung. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1. Das LG entwickelt sich durch den Prozess der epithelialen Verzweigung Morphogenese. Hell Bilder embryonaler LGs frisch bei e14, e15...

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Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Manipulation der Murine Lakrimal

Die Tränendrüse (LG) ist ein Verzweigungs Organ, das die wässrigen Bestandteile der Tränen notwendig für die Aufrechterhaltung der Vision und Augengesundheit produziert. Hier beschreiben wir murine LG Dissektion und ex vivo Kulturtechniken zu entziffern Signalwege in LG Entwicklung beteiligt.

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Silicon Microchips for Manipulating Cell-cell Interaction

Silizium-Mikrochips zur Manipulation Zell-Zell-Interaktion

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from ...

Forschung

Biologie

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

Mit Laser-Pinzette zur Manipulation isolierter Neuronen In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Murine Renal Transplantation Procedure

Murine Renal Transplantation

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Isolierung von Maus Speicheldrüsen Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Intraduktale Injection für Lokalisierte Drug Delivery auf die Maus Milchdrüse

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine Brustdrüse Biopsie-Techniken

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

Isolierung von myepithelialen Zellen aus der Urmorine, Lacrimal und Submandibular Drüsen

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Dreidimensionales, serumfreies Kultursystem für Tränendrüsenstammzellen

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...