Name: manipulating the murine lacrimal gland
Uploaded: 2014-11-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulating the Murine Lacrimal Gland at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke finansiering fra UCSF Ressurs Program.

Alle dyr arbeidet ble utført under strengt samsvar med anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of California, San Francisco. 1. Mouse Embryonic Lacrimal Kjertler (LG): Høsting og mikrodisseksjon <ol><li> Etter prosedyrer godkjent av de institusjonelle Dyr for Scientific forskningsetiske komité, avlive timet gravide CD-en (eller transgene) hunne...

<ol>
	<li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca.">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).</li><li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development.">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, 2563-2572 (2000).</li><li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes:+relevance+in+dry+eye+diseases.">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li><li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs.">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycan-dependent+restriction+of+FGF+diffusion+is+necessary+for+lacrimal+gland+development.">Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development.</a> Development. 139, 2730-2739 (2012).</li><li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development:+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms.">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li><li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis.">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, 1223-1234 (2005).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10/FGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis.">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11 (2005).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration.">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494 (2013).</li></ol>

Allsidigheten til kultur og manipulere LG ex vivo gir betydelige fordeler for å studere dens utvikling. Dette inkluderer hastigheten som forskeren er i stand til å teste hypoteser og mangfoldet av forstyrrelser som kan utføres for å vurdere hvordan epitel, nevronale, endothelial og mesencyhmal celler samhandler for å danne organ. Det er imidlertid en rekke begrensninger når utnytte denne modellen. Først, i kraft av sin isolasjon kjertelen ikke lenger er koblet til den perifere vaskulatur eller nervesyste...

Den tårekjertel (LG) er ansvarlig for vandig tåresekresjon kritisk for synsskarphet og helse-, vedlikehold og beskyttelse av celler av den okulære overflaten. LG dysfunksjon resulterer i en av de mest vanlige og ødeleggende øyelidelser: vandig mangel Dry Eye Disease, som er preget av okulær irritasjon, lysfølsomhet og redusert syn en. I menneske LG befinner seg i bane over sidekanten av øyet der 3-5 excretory kanaler innskudds tårer bort på okulær overflate. Musen har tre par store okulær kjertler, den mest studerte av desse er tårekjertelen (LG) plassert anterior og ventral til øret (exorbital) med tårer som reiser til øyet via en enkelt utførselskanal. I likhet med andre kjertel organer, utvikler LG gjennom prosessen med epitelisk forgrening morfogenese i hvilket en enkelt epitel knopp innenfor en kondensert mesenchyme gjennomgår multiple runder med knopp og kanaldannelse for åm en intrikat sammenvevd nett av sekretorisk acini og kanaler (Figur 1) 2. Under utviklingen Epitel blir vaskulariserte samt tungt innervated av de parasympatiske nerver av pterygopalatine ganglion og i mindre grad av sympatiske nerver fra den overlegne cervical ganglion tre. Interaksjoner mellom hver av disse celler neuronale typer dvs., epitelceller, endotelceller og mesenchymale celler, er viktige for funksjonen og vedlikeholdet av voksent vev. Men de underliggende molekylære mekanismene koordinere LG utvikling og fornyelse samt hvordan inter-celle type kommunikasjon guider disse prosessene er fortsatt uklart. Ankomsten av embryonale ex vivo kultur teknikker har tillatt identifisering av utviklingsmessige og regenererende trasé i flere forgreninger organer fire. Dyrking ex vivo gir forskeren mulighet til å manipulere organ (megmekaniske, genetisk eller kjemisk) under definerte betingelser, så vel som å karakterisere organutvikling og celle-celle-vekselvirkninger i sanntid. Den exorbital LG av musen er svært mottagelig for denne teknikken og nyere studier har definert signalsystemer som regulerer dens utvikling 2,5. Men til tross for behovet for å forstå molekylære signaler som ligger til grunn LG utvikling og fornyelse, er det fortsatt for tiden studerte, sannsynligvis på grunn av tekniske problemer i å isolere organ. I denne artikkelen beskriver vi hvordan du isolerer og utføre ex vivo kulturen i den embryonale murine LG å definere utviklingsprogrammene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1767">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Name</td>
			<td style="width:129px;">Catalog #.</td>
			<td style="width:213px;">Company</td>
			<td style="width:997px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 without HEPES</td>
			<td>SH3027101</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin solution from bovine serum</td>
			<td>A9576</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 16% Solution</td>
			<td>15710</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Diluted to 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline 10X</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared from 10X stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">holo-Transferrin bovine</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">L- Ascorbic acid (Vitamin C)</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes</td>
			<td>130182</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo Microscope with substage iluminator</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td rowspan="2">Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Substage Illuminator Base for Stereo Microscope</td>
			<td>TLB 4000</td>
			<td>Diagnostics Instruments, Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes</td>
			<td>353001</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mm uncoated glass bottom dishes</td>
			<td>P50G-1.5-14-F</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Widefield fluorescence microscope</td>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:213px;">Carl Zeiss</td>
			<td>Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached 
			digital camera.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td style="width:213px;">Leica Microsystems</td>
			<td>Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ideal for harvesting glands from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm)</td>
			<td>17-305X</td>
			<td>Integra LifeSciences Corporation</td>
			<td>Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm)</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine Science Tools (USA), Inc.</td>
			<td>Ideal for harvesting glands from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.</td>
			<td>4-30</td>
			<td colspan="2">Integra LifeSciences Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10</td>
			<td>4-310</td>
			<td colspan="2">Integra LifeSciences Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit</td>
			<td>AM1931</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td>
			<td>3446-005-01</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice</td>
			<td></td>
			<td style="width:213px;">Charles River Labs</td>
			<td>Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm</td>
			<td>110405</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice</td>
			<td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Optional mice for learning how to locate the LG.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulating the murine lacrimal gland

Den tårekjertel (LG) utskiller vandige tårer som er nødvendige for å opprettholde strukturen og funksjonen av hornhinnen, en transparent vev avgjørende for synet. I menneske en enkelt LG befinner seg i bane over den laterale ende av hvert øye å levere tårer til den okulære overflaten gjennom 3-5 kanalene. Musen har tre par store okulære kjertler, det mest studerte av disse er exorbital tårekjertel (LG) plassert i fremre og ventral til øret. I likhet med andre kjertel organer, utvikler LG gjennom prosessen med epitelisk forgrening morfogenese i hvilket en enkelt epitel knopp innenfor en kondensert mesenchyme gjennomgår multiple runder med knopp, og kanaldannelse for å danne en intrikat innbyrdes forbundet nettverk av sekretorisk acini og kanaler. Denne detaljert prosess har blitt godt dokumentert i mange andre epiteliale organer som bukspyttkjertelen og spyttkjertel. Imidlertid har LG vært mye mindre utforsket, og mekanismene som kontrollerer morphogenesis er dårlig ettersto. Vi mistenker at dette underrepresentasjon som modellsystem er en konsekvens av de vanskelighetene forbundet med å finne, dissekere og dyrking LG. Derfor, her vi beskriver disseksjon teknikker for høsting embryonale og post-natal LG og metoder for ex vivo kultur av vevet.

LG utvikler gjennom prosessen med epitelisk forgrening morfogenese. Lysfelt bilder av embryonale LGS dissekert på e14, e15, e16, e17, og P2 illustrerer denne hendelsen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600" /> Figur 1. LG utvikler gjennom prosessen med epitel forgrening morphogenesis. Lysfelt bilder av embryonale LGS fersk dissekert på e14, e15, e16, e17 og P2. <a ...

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating the Murine Lacrimal Gland at JoVE.com

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Manipulere Murine Lacrimal Gland

Den tårekjertelen (LG) er en forgrening organ som produserer de vandige komponenter av tårer er nødvendige for å opprettholde visjon og okulær helse. Her beskriver vi murine LG disseksjon og ex vivo kultur teknikker for å dechiffrere signalveier er involvert i LG utvikling.

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Silicon Microchips for Manipulating Cell-cell Interaction

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from ...

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Intraductal Injection for Lokalisert Drug Deli til musemelkekjertlene

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av Murint Valve endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering av Murine Coronary vaskulære glatte muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Storfe melkekjertlene biopsi teknikker

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

Isolering av Myoepithelial celler fra voksen murine Lacrimal og submandibular kjertler

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Tredimensjonalt, serumfritt kultursystem for stamceller med lacrimal kjertel

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...