Name: manipulating the murine lacrimal gland
Uploaded: 2014-11-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulating the Murine Lacrimal Gland at JoVE.com

Författarna vill tacka för finansiering från UCSF Resource Allocation Program.

Alla djur har gjorts med strikt enlighet med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur i National Institutes of Health. Protokollet godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of California, San Francisco. 1. Mouse embryonala tårkörtlar (LG): Skörd och Microdissection <ol><li> Efter förfaranden som godkänts av Institutional djur för vetenskapliga forskningsetisk kommitté, euthanize tids gravida CD-1 (eller...

<ol>
	<li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca.">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).</li><li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development.">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, 2563-2572 (2000).</li><li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes:+relevance+in+dry+eye+diseases.">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li><li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs.">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycan-dependent+restriction+of+FGF+diffusion+is+necessary+for+lacrimal+gland+development.">Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development.</a> Development. 139, 2730-2739 (2012).</li><li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development:+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms.">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li><li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis.">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, 1223-1234 (2005).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10/FGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis.">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11 (2005).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration.">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494 (2013).</li></ol>

Mångsidig till kultur och manipulera LG ex vivo ger betydande fördelar för att studera dess utveckling. Detta inkluderar den hastighet med vilken forskaren har möjlighet att testa hypoteser och de många störningar som kan utföras för att bedöma hur epitelial, neuronal, endotelceller och mesencyhmal cellerna samverkar för att bilda organ. Det finns emellertid ett antal förbehåll när använder denna modell. Först på grund av sin isolering körteln inte längre är ansluten till den perifera kärlsy...

Tårkörteln (LG) är ansvarig för vatten tårsekretion avgörande för synskärpa och hälsa, underhåll och skydd av cellerna i ögats yta. LG dysfunktion leder till en av de vanligaste och försvagande ögonsjukdomar: vatten bristfällig Torra ögon sjukdom, som kännetecknas av ögonirritation, ljuskänslighet och försämrad synskärpa 1. I människan LG ligger i omloppsbana ovanför sido änden av ögat där 3-5 utförsgångar inlånings tårar har laddats in i ögats yta. Musen har tre par stora okulära körtlar, den mest studerade av dessa är tårkörteln (LG) belägna främre och ventrala för örat (exorbital) med tårar som reser till ögat via en enda utskiljningskanal. I likhet med andra körtel organ, LG utvecklas genom processen att epitel förgrening morfogenes i vilka en epitelial knopp i en kondenserad mesenkymet genomgår flera omgångar av knopp och kanalbildning till förm ett intrikat sammankopplat nätverk av sekretorisk acini och kanaler (figur 1) 2. Under utvecklingen epitelet blir vaskulariserad liksom tungt innerveras av de parasympatiska nerverna i pterygopalatine ganglion och i mindre utsträckning av sympatiska nerver från den överlägsna cervikala ganglion 3. Interaktioner mellan var och en av dessa celler typer dvs neuronala, epitelceller, endotelceller och mesenkymala celler, är avgörande för funktion och underhåll av vuxen vävnad. Men de bakomliggande molekylära mekanismer samordning LG utveckling och förnyelse samt hur inter celltyp kommunikation styr dessa processer är fortfarande oklart. Tillkomsten av embryonala ex vivo odlingstekniker har möjliggjort identifiering av utvecklingsstörningar och regenerativa vägar i flera förgrenings organ 4. Odling ex vivo ger forskaren möjlighet att manipulera orgeln (migmekanisk, genetisk eller kemisk) under definierade förhållanden och för att karakterisera utveckling orgel och cell-cell interaktioner i realtid. Den exorbital LG av musen är mycket mottaglig för denna teknik och nya studier har definierat signalsystem som reglerar dess utveckling 2,5. Trots behovet av att förstå molekylära signaler som ligger till grund LG utveckling och förnyelse, för närvarande är det fortfarande understudied, sannolikt på grund av de tekniska svårigheterna att isolera orgeln. I detta dokument beskriver vi hur du isolerar och utföra ex vivo kultur embryonala murina LG att definiera utvecklingsprogrammen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1767">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Name</td>
			<td style="width:129px;">Catalog #.</td>
			<td style="width:213px;">Company</td>
			<td style="width:997px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 without HEPES</td>
			<td>SH3027101</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin solution from bovine serum</td>
			<td>A9576</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 16% Solution</td>
			<td>15710</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Diluted to 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline 10X</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared from 10X stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">holo-Transferrin bovine</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">L- Ascorbic acid (Vitamin C)</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes</td>
			<td>130182</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo Microscope with substage iluminator</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td rowspan="2">Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Substage Illuminator Base for Stereo Microscope</td>
			<td>TLB 4000</td>
			<td>Diagnostics Instruments, Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes</td>
			<td>353001</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mm uncoated glass bottom dishes</td>
			<td>P50G-1.5-14-F</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Widefield fluorescence microscope</td>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:213px;">Carl Zeiss</td>
			<td>Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached 
			digital camera.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td style="width:213px;">Leica Microsystems</td>
			<td>Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ideal for harvesting glands from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm)</td>
			<td>17-305X</td>
			<td>Integra LifeSciences Corporation</td>
			<td>Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm)</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine Science Tools (USA), Inc.</td>
			<td>Ideal for harvesting glands from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.</td>
			<td>4-30</td>
			<td colspan="2">Integra LifeSciences Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10</td>
			<td>4-310</td>
			<td colspan="2">Integra LifeSciences Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit</td>
			<td>AM1931</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td>
			<td>3446-005-01</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice</td>
			<td></td>
			<td style="width:213px;">Charles River Labs</td>
			<td>Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm</td>
			<td>110405</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice</td>
			<td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Optional mice for learning how to locate the LG.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulating the murine lacrimal gland

Tårkörteln (LG) utsöndrar vatten tårar som krävs för att upprätthålla struktur och funktion på hornhinnan, en transparent vävnad viktigt för vision. I människan en enda LG ligger i omloppsbana ovanför sidoänden av varje öga levererar tårar till den okulära ytan genom 3 - 5 kanaler. Musen har tre par stora okulära körtlar, den mest studerade av dessa är exorbital tårkörteln (LG) belägna främre och ventrala till örat. I likhet med andra körtel organ, LG utvecklas genom processen att epitel förgrening morfogenes i vilka en epitelial knopp i en kondenserad mesenkymet genomgår flera omgångar av linda och kanalbildning för att bilda ett intrikat sammankopplat nätverk av sekretorisk acini och kanaler. Denna genomarbetade process har dokumenterats väl i många andra epiteliala organ såsom bukspottkörteln och spottkörteln. Däremot har LG varit betydligt mindre utforskade och de mekanismer som styr morphogenesis är dåligt istod. Vi misstänker att detta underrepresentation som modellsystem är en följd av de svårigheter som är förknippade med att hitta, dissekera och odling av LG. Alltså, här beskriver vi dissektion tekniker för skörd embryonala och postnatal LG och metoder för ex vivo odling av vävnaden.

LG utvecklas genom processen epitel förgrening morfogenes. Bright bilder av embryonala LGs dissekerade vid E14, E15, e16, e17, och P2 visar denna händelse. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600" /> Figur 1. LG utvecklas genom processen epitel förgrening morfogenes. Bright bilder av embryonala LGs nyligen dissekeras på E14, E15, e16, E17 och P2. <a href="https://ww...

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating the Murine Lacrimal Gland at JoVE.com

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Manipulera Murin tårkörteln

Tårkörteln (LG) är en förgrenings organ som producerar de vattenbaserade komponenter i tårar som krävs för att upprätthålla syn och ögonhälsa. Här beskriver vi mus LG dissektion och ex vivo odlingstekniker för att dechiffrera signalvägar involverade i LG utveckling.

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Silicon Microchips for Manipulating Cell-cell Interaction

Silicon mikrochips för Manipulera cell-cell interaktion

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from ...

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

Använda Laser pincett för att manipulera enstaka nervceller i Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Murine Renal Transplantation Procedure

Murina njurtransplantation Förfarande

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Isolering av Mouse Saliv celler Gland Stem

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Intraductal Injektion för Lokaliserad Drug Delivery till Mouse bröstkörtel

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av murint Ventil Endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering av murin Coronary vaskulära glatta muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovin bröstkörteln biopsi tekniker

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

Isolering av Myoepithelial celler från Adult murine lacrimal och submandibular körtlar

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Tredimensionellt, serumfritt odlingssystem för lacrimalkörtelstamceller

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...